Marcela Vlková Jana Nechvátalová. FN u sv. Anny v Brně LF MU Brno

Transkript

1 Marcela Vlková Jana Nechvátalová FN u sv. Anny v Brně LF MU Brno

2 Leukocytární subpopulace CD45 CD45

3 Lymfocytární subpopulace Fenotypizace základní subpopulace T a B lymfocytů a NK buněk subpopulace základních populací vývojové a aktivační markery Sledování regulačních buněk Funkční testy: proliferace např. CSFE, produkce cytokinů, cytotoxicita,..

4 Bazofily Bazotest

5 Monocyty CD14 CD45 Funkční testy: Stanovení exprese HLA DR Fagocytární testy Produkce cytokinů Exprese aktivačních molekul

6 Změny exprese HLA DR na monocytech u septických pacientů CD14 HLA DR FITC CD14 HLA DR PerCP Cy5.5 HLA DR FITC

7 Eozinofily FS CD16,56 CD45 CD45

8 Neutrofily Jméno neutrofil pochází z histologických nebo cytologických preparátů, při barvení hematoxylinem nebo eosinem Basofily tmavě modré Eosinofily jasně červené Neutrofily neutrálně růžové Charakteristické svými výraznými jádry, které jsou segmentovány do 2 5 laloků

9 Vývoj neutrofilů Nature Clinical Practice Rheumatology (2006) 2,

10 Cytologie neutrofilů Zralé neutrofily měří v průměru v nátěru m Jsou charakteristické výraznými jádry, které jsou segmentovány do 2 5 laloků Méně zralé neutrofily nazýváme tyčkami mají nesegmentované jádra tvarované právě do tvaru tyček Ranější formy neutrofilů metamyelocytymůžeme také nalézt v periferní krvi

11 Vývoj netrofilů

12 Neutrofily Vysoký počet neutrofilů a jejich krátký život může být výsledkem evolučního vývoje Buňky rychlého nasazení Minimalizace množení parazitů Neutrofilní antimikrobiální produkty poškozují okolní tkáně Neutrofily bývají často fagocytovány makrofágy po digesci patogenů

13 Neutrofily stanovení v PK CD45 a CD16 FS CD16,56 CD45 CD45

14 Neutrofily FS CD16,56 FS CD16,56 CD45 CD45 CD45 CD45

15 Vývojová stádia neutrofilů v PK CD16,56 CD16,56 CD45 CD45

16 Subpopulace neutrofilů? Absence monoklonální protilátky? CD16,56 CD16,56 CD16,56 FS FS FS CD45 CD45 CD45

17 Absence monoklonální protilátky? NE!!! FS CD16 CD16 CD45 CD3

18 Maturované x nematurované neutrofily CD16,56 FS CD45

19 Další fenotypizace ukázala CD45 CD3 CD16 CD15 FS FS CD16,56 CD19 CD16 CD16,56 CD19 CD16 CD45 CD3 CD16 CD15

20 CD16 je nízkoafinitní receptor pro Fc IgG. Vyskytuje se ve dvou izoformách: FC RIIIA (NK buňky, DC, monocyty, makrofágy) a Fc RIIIB (na neutrofilech a eozinofilech). FC RIIIA (CD16a) existuje ve třech polymorfizmech: Fc RIIIa 48L/H/R Fc RIIIa 158V/F Fc RIIIa 66H/L Fc RIIIB (CD16b) 2 alelické formy NA1 a NA2 Různé alelické varianty CD16 vedou k: rozdílné aktivitě ADCC snížení léčebné odezvy (léčba rituximabem) ovlivnění účinnosti fagocytózy bakterií opsonizovaných IgG ochotněji s homozygotní variantou NA1 než NA2) popsán i deficit CD16 další Fc receptory pro IgG (CD32 a CD64) zřejmě kompenzují ztrátu CD16 (Wagner C. et al., Eur J Clin Invest. 2004)

21 Exprese CD16b na neutrofilech x10 3 vazebných míst (při použití klonu 3G8) Intenzita exprese CD16b na neutrofilech: při manipulaci in vitro (hustotní gradientová centrifugace) u pacientů podstupujících hemodialýzu u těhotných žen u novorozenců u pacientů léčených G CSF u pacientů během sepse během apoptózy neutrofilů

22 Ne všechny klony monoklonálních protilátek CD16 se chovají stejně. A proto Jana dále bádá, a příště Vám řekne víc

23 Děkuji Spolupracovníkům: Janě Nechvátalové Zitě Chovancové Jiřímu Litzmanovi

24 Neutrofily stimulace nebo suprese? Pieter H.C. Leifelder, Front Immunol, 2015

25 Subpopulace neutrofilů Janesh Pillay, J Clin Invest, 2012

26 Neutrofily změny po separaci Periferní krev Granulocyty 1hodina po separaci a inkubaci Inkubace PBMC + granulocytů 24 hod. Inkubace PBMC + granulo 24 hod. + stim.anti CD3, CD28 CD62L CD16 PD L1 CD16

27 Monocyty změny po separaci a inkubaci Periferní krev Čerstvě izol. PBMC Inkubace PBMC 24 hod. Inkubace PBMC 24 hod. + stimulace anti CD3, CD28 CD16 PD 1 CD62L PD L1

28 Low density granulocytes Jitka Y. Sagiv, Cell Reports, 2015

29 Low Density Neutrophiles LDN v PBMC pacienta s CVID Čerstvě izol. PBMC Inkubace PBMC 24 hod. Inkubace PBMC 24 hod. + stimulace anti CD3, CD28 CD62L CD16 PD L1 CD15 CD16

30 Fenotypizace LDN Carmelo Carmon Rivera, Seminar Immunophatol, 2013