Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd MOŽNOSTI STANOVENÍ PROTILÁTEK TYPU LUPUS ANTIKOAGULANS V HEMATOLOGICKÉ LABORATOŘI IKEM PRAHA Bakalářská práce Vedoucí práce: Mgr. Ilona Fátorová Školitel konzultant: Mgr. Marcela Mikešová Praha 2014 Rybníčková Soňa 1

2 Prohlášení Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu. V Praze dne: Soňa Rybníčková 2

3 PODĚKOVÁNÍ Za odbornou pomoc při zpracování předkládané práce chci na tomto místě poděkovat vedoucí práce paní Mgr. Iloně Fátorové, a také své konzultantce paní Mgr. Marcele Mikešové za trpělivost se kterou mi s touto prací pomáhala. 3

4 Rybníčková Soňa MOŢNOSTI STANOVENÍ PROTILÁTEK TYPU LUPUS ANTIKOAGULANS V HEMATOLOGICKÉ LABORATOŘI IKEM PRAHA Bakalářská práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotní laborant Abstrakt Cíl práce Diagnostika lupusu antikoagulans je problematická, protoţe neexistuje 100% citlivý screeningový test, a v případě prodlouţení koagulačních testů je nutno vyloučit i jiné moţné příčiny. (M. Penka 2011) Cílem mé práce je ukázat moţnosti vyšetřování LA v naší laboratoři, někdy nejednoznačnou interpretaci naměřených výsledků a také nutnost dodrţovat preanalytickou fázi. Zhodnotit klinické projevy, laboratorní kritéria, popsat moţné interference testů LA. Metody Teoretická část se zabývá základními mechanismy hemostázy, působením protilátek typu LA v organismu, diagnostickými kritérii i léčebnými doporučeními. Praktická část ukazuje, i pomocí jednoduchého centrifugačního pokusu, jak je důleţitá preanalytická fáze včetně dvojí centrifugace, popisuje pouţité reagencie a přesný postup vyšetření LA rozdělený na screeningové, směsné a konfirmační testy. Výsledky Vyhodnocujeme výsledky jednotlivých testů: screeningových (aptt-la a drvvt screen), směsných testů (aptt-la A drvvt) a konfirmačních testů (ACTIN FS a drvvt confirm, Staclot LA). 4

5 Závěry Porovnali jsme specifitu a senzitivitu výpočtu Rösnerova indexu oproti poměru k normální plazmě, abychom prokázali, zda jsou obě moţnosti srovnatelné. Klíčová slova: Lupus antikoagulans, Antifosfolipidový syndrom, protilátky, trombóza 5

6 Rybníčková Soňa THE POSSIBILITY OF ASSESSMENT OF LUPUS ANTICOAGULANT ANTIBODIES IN HEMATOLOGY LABORATORY IKEM IN PRAGUE Bachelor thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Laboratory Technician Background Diagnosis of the Lupus Anticoagulant is very complicated due to a missing completely reliable screening test and whenever the presence of prolonged clotting times on a routine plasma test is detected, the other potential causes besides LA is needed to exclude. The aim of the thesis is focused on a possibilities of testing the Lupus Anticoagulant in our Clinical Haematology Department in the Institute for Clinical and Experimental Medicine inclusive of ambiguity measured results interpretation and a necessity to abide by the conditions of a preanalytic phase. In addition, clinical manifestation and laboratory criteria assessment as well as a possible interferences in Lupus Anticoagulant testing are also discussed. Methods The theoretical part is focused on a basic mechanism of haemostasis, on an effect of antiphospholipid antibodies, the diagnostic kriteria inclusive of a treatment guidelines. The practical part is focused on importance of the preanalytical phase, principally on necessity of a double centrifugation tube method (to obtain platelet pure plasma). More over is described a reagent kit for the detection of a Lupus Anticoagulant and the test procedure comprising screening, mixing and confirmation tests. Results An appraisal and result interpretation of the screening (aptt-la a drvvt screen) tests, the mixing tests (aptt-la A drvvt) and the confirmation tests (ACTIN FS a drvvt confirm, Staclot LA) are performed. 6

7 Conclusions The sensitivity compared with the specificity of the Rösner index calculation versus normal plasma ratio was carried out to prove (ascertain) comparability both of the statistical methods. Key words: Lupus anticoagulant, Antiphospholipid syndrome, Antibodies, Thrombosis 7

8 Obsah 1. Zadání cíl práce 12 I. Teoretická část Hemostáza Základní mechanismy hemostázy Primární hemostáza Plazmatický koagulační systém Fibrinolytický systém Přirozené inhibitory hemostázy Získané inhibitory hemostázy Průkaz antifosfolipidových protilátek Historie a současnost Antifosfolipidový syndrom Fosfolipidy Mechanismus antifosfolipidových protilátek Mechanismus působení protilátek LA ACLA protilátky Diagnostika Diagnostická kritéria APS Diagnostika lupus antikoagulans Léčebná doporučení 21 II. Praktická část Preanalytická fáze Odběr primárního vzorku a transport Základní centrifugace Stabilita Příprava plazmy k zamrazení, uchovávání vzorků před analýzou Rozmrazení plazmy a příprava k měření 25 8

9 5.6. Přístroje Analyzátor STA-R Analyzátor STart Vlastní vyšetření LA Screeningová vyšetření Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) Parciální tromboplastinový čas - rutinní reagencie - aptt Parciální tromboplastinový čas citlivý k lupus antikoagulans - aptt-la drvvt screen (Dilute Russel viper venom time) Směsné testy na principu aptt-la a drvvt Konfirmační testy aptt necitlivé na LA Konfirmační test s hexagonálním uspořádáním fosfolipidů drvvt confirm Experimentální část Výsledky porovnání směsných testů Výsledky porovnání konfirmačních testů na principu aptt Kazuistika Kazuistika Závěr - diskuze Seznam pouţité literatury Tabulky Obrázky Přílohy 45 9

10 Seznam použitých zkratek ACLA antikardiolipinové protilátky APA, APLA antifosfolipidové protilátky APS antifosfolipidový syndrom aptt aktivovaný parciální tromboplastinový čas ASA kyselina acetylsalicylová BWR Bordetova-Wassermannova reakce β 2 -GPI β 2- glykoprotein I Ca 2+ vápenaté ionty drvvt ředěný test s jedem Russelovy zmije FN falsely negative FP falsely positive HMWK vysokomolekulární kininogen ISTH International Society on Thrombosis and Haemostatsis INR mezinárodní normalizovaný poměr LA lupus antikoagulans LCA Rösnerův index LIS laboratorní informační systém NP normalizovaný poměr PL fosfolipidy PPP plazma chudá na destičky PT protrombinový čas SCT silica clotting time 10

11 SLE Systémový lupus erythematodes THR trombocyty TN truth negative TP truth positive t-pa tkáňový aktivátor plazminogenu u-pa urokináza 11

12 1. Zadání cíl práce Tématem mé bakalářské práce je stanovení protilátek typu lupus antikoagulans (LA) v hematologické laboratoři IKEM. Výběr tématu byl mimo jiné ovlivněn i vlastními poţadavky na hlubší porozumění této sloţité a ne vţdy jednoznačné problematiky stanovení LA. LA je heterogenní skupina protilátek s různými klinickými či laboratorními projevy, společně s antifosfolipidovými protilátkami charakterizuje tzv. Antifosfolipidový syndrom. Antifosfolipidový syndrom je onemocnění manifestující se především venózními a arteriálními trombózami, trombocytopenií a opakovanými ztrátami plodu. Vzhledem k závaţnosti těchto projevů, je nutné co nejspolehlivěji stanovit moţnou přítomnost těchto protilátek v plazmě. Na myšlenku, zde se jedná o LA, nás můţe přivést zjevně neodůvodněné prodlouţení rutinní reagencie aktivovaného parciálního tromboplastinového času (aptt). Před uzavřením pozitivního nálezu LA, je nutno posoudit vliv jiných moţných příčin prodlouţeného APTT, jako například sníţení koagulačních faktorů, moţnou interferenci antikoagulační léčbou, či přítomnost jiných inhibitorů. 12

13 I. Teoretická část 2. Hemostáza Pro existenci ţivého organismu je zcela nezbytné zachování krevního oběhu a přítomnost krve v tekutém stavu. Krev je oddělena od vnějšího prostředí cévní stěnou. Při poškození cévní stěny se začíná uplatňovat hemostatický mechanismus, který promění tekutou krev na krevní sraţeninu, která cévu uzavře. Hemostáza je schopnost organismu zastavit krvácení. Jde o komplexní proces, na kterém se podílí řada sloţek a mechanismů. Hlavními sloţkami hemostázy jsou: cévní stěna, tkáňová sloţka, krevní destičky a činitelé plazmatického koagulačního systému (Pecka, 2004) Základní mechanismy hemostázy Mezi základní mechanismy hemostázy patří: primární hemostáza, plazmatický koagulační systém, fibrinolytický systém, inhibitory krevního sráţení a fibrinolýzy Primární hemostáza Primární hemostáza je proces tvorby primární hemostatické zátky, která uzavírá místo narušení celistvosti cévní stěny. V primární hemostáze zaujímají klíčovou roli trombocyty Plazmatický koagulační systém Plazmatický koagulační systém je skupina dějů, které vedou ke vzniku nerozpustného fibrinu. Postupně dochází k přeměně fibrinogenu na fibrin, dále na fibrinové monomery, které polymerují. Polymery fibrinu se pak propojují vazbami působením aktivovaného faktoru XIII (XIIIa) a vzniká nerozpustný fibrin. Ten vytváří vláknitou síť, ve které se zachycují krevní buňky a vytvoří se tzv. stabilní fibrinová zátka (Pecka, 2004). Plazmatické faktory Jsou to látky, které jsou přítomny v plazmě a účastní se dějů hemostázy. Většina plazmatických faktorů je syntetizována v játrech (M. Matýšková, 1999). 13

14 Převáţná část faktorů je v plazmě přítomna v podobě proenzymu a pro správnou funkci vyţaduje štěpení, kdy vzniká koagulačně aktivní enzym. Jedná se převáţně o glykoproteiny. Faktory II, VII, IX, X, XI, XII a prekalikrein řadíme mezi serinové proteázy, protoţe jejich aktivní místo obsahuje serin. Faktory VIII, V a vysokomolekulární kininogen (HMWK) se po rozštěpení účastní tvorby aktivních komplexů a chovají se tak jako kofaktory. Faktor I fibrinogen tvoří substrát pro trombin, který jej štěpí (Pecka, 2004). PIVKA formy Faktory, které jsou závislé na vitamínu K, potřebují ke své řádné funkci vitamín K, který je nutný pro karboxylaci. Pokud tato reakce neproběhne, není daný faktor schopen vazby na Ca 2+ a fosfolipidy. Mezi K-dependentní faktory řadíme FII, VII, IX, X, dále protein C a S. Ty jsou při nedostatku tohoto vitamínu sice tvořeny, ale nejsou koagulačně aktivní, tzv. PIVKA formy (M. Matýšková, 1999) Fibrinolytický systém Fibrinolytický systém je zodpovědný za lýzu koagula (Pecka, 2004). Fibrinolýza je fyziologická, kontrolovaná, dynamická odpověď organismu na tvorbu fibrinových depozit. Rozpouštění fibrinového koagula zajišťuje enzym plazmin, který vzniká aktivací plazminogenu (M. Matýšková, 1999). Nejdůleţitějšími aktivátory plazminogenu jsou tkáňový aktivátor plazminogenu (t-pa) a urokináza (u-pa). Plazmin štěpí jak fibrinogen, tak i fibrin na stále menší částice tzv. štěpné produkty fibrinogenu (fibrinu). Při štěpení fibrinogenu a rozpustných fibrinů vznikají jednak vysokomolekulární fragmenty X, Y a jednak nízkomolekulární fragmenty D a E. Štěpením nerozpustného fibrinu vznikají fragmenty nazývané D- dimery. Jejich laboratorní průkaz je přímým důkazem štěpení nerozpustného fibrinu. Slouţí jako markery trombofilních stavů Přirozené inhibitory hemostázy Inhibitory krevního sráţení jsou sloţky krve, které tlumí antikoagulačními mechanismy proces jejího sráţení vyvolaný plazmatickým koagulačním systémem. Inhibitory můţeme dělit dle původu na přirozené a získané, dle systému na inhibitory koagulace a fribrinolýzy. 14

15 Z fyziologických inhibitorů se nejvíce uplatňují antitrombin a alfa 2 - makroglobulin. Antitrombin spolu s kofaktorem heparinu odpovídá za 80 % inhibiční koagulační aktivity. Dalším účinným inhibičním systémem hemostázy je systém proteinu C, který je tvořen proteinem C, proteinem S a trombomodulinem. Je aktivován na povrchu endotelových buněk trombinem navázaným k trombomodulinu. Systém proteinu C je schopen inaktivovat některé plazmatické koagulační faktory (VIIIa a Va) a tím reguluje tvorbu trombinu (Pecka, 2004) Získané inhibitory hemostázy Získané inhibitory jsou nálezem patologickým, nepříznivě zasahujícím do koagulace. Nejvýznamnější úlohu ze získaných inhibitorů mají tzv. antifosfolipidové protilátky. 3. Průkaz antifosfolipidových protilátek 3.1. Historie a současnost První zprávy se datují na začátek minulého století (1906), kdy byl vyvíjen sérologický komplement fixační test pro diagnostiku syfilis, kterým byly detekovány protilátky nazvané reaginy. Ve čtyřicátých letech dvacátého století byla identifikována antigenní komponenta používaná v tomto serologickém testu jako záporně nabitý fosfolipid-kardiolipin (Z. Fojtík, 2004). Vzápětí se však ukázalo, ţe tento test je pozitivní i u lidí, kteří syfilidu v současné době nemají nebo ji nikdy neměli. Tak vznikl pojem biologicky falešně pozitivního testu, který lze prokázat významně často u různých autoimunitních onemocnění, zvláště pak u systémového lupusu erythematosus (SLE). V roce 1950 se také podařilo dokázat, ţe nemocní se SLE mohou mít projevy krvácivosti, která se pokládala za následek cirkulující autoprotilátky proti některým sloţkám koagulační kaskády. Teprve po dalších deseti letech jiný lékař rozpoznal, ţe tito nemocní mají paradoxně spíše zvýšené riziko ţilní trombózy neţ krvácení. Na 15

16 základě těchto zjištění byl v roce 1972 Feinsteinem a Rappaportem tento faktor nazván lupusovým antikoagulans (LA). Termín LA určuje získanou inhibici koagulace krve. Tento inhibitor prodluţuje celkový koagulační čas a protrombinový čas, není neutralizován přidáním normální plazmy a bývá spojen s falešnou pozitivitou v netreponemových testech pro syfilis (např. BWR). Bylo prokázáno, ţe antikoagulační aktivita LA je zaměřena proti negativně nabitým fosfolipidům v koagulačních testech a ţe brání na kalciových iontech vazbě koagulačních faktorů X a II oběma izotopy (C. Dostál, 2007). Protilátky typu lupus antikoagulans jsou tvořeny buď imunoglobuliny třídy IgG, nebo imunoglobuliny třídy IgM, nebo jejich kombinací. Typ IgA je velmi vzácný (J. Kvasnička, 2003) Antifosfolipidový syndrom APS Antifosfolipidové protilátky (APA) jsou velmi heterogenní skupinou autoprotilátek či aloprotilátek s různým cílovým antigenem a různým klinickým významem (A. Bulíková, 2006). Skutečnými antigenními determinantami antifosfolipidových protilátek nejsou samostatné fosfolipidové povrchy, ale modifikované epitopy vznikající vazbou plazmatických proteinů na struktury s negativním nábojem na fosfolipidové povrchy (Z. Fojtík, 2004). Významné APA jsou namířené proti β 2 -glykoproteinu I, ale uplatnit se mohou i trombomodulin, protein C, protein S, protrombin, faktory kontaktní fáze, annexin V a řada dalších. Z pohledu diagnózy APS můžeme rozdělit APA na tři velké skupiny. První dvě skupiny jsou diagnostikovány za pomoci metod ELISA - protilátky proti kardiolipinům (ACLA) a protilátky proti β 2 -glykoproteinu I. Poslední skupinou APA jsou ty, které jsou zjišťovány na základě jejich schopnosti ovlivňovat na fosfolipidech závislé reakce krevního srážení. Označujeme je jako lupus antikoagulans (A. Bulíková, 2006). APS můţeme rozlišit na primární a sekundární. O primárním hovoříme, vyskytuje-li se izolovaně bez přítomnosti jiného autoimunitního onemocnění. O sekundárním APS hovoříme tehdy, je-li spojen s výskytem jiného systémového, či 16

17 orgánově specifického onemocnění jako např. SLE či revmatoidní artritida (A. Křemenová, 2010) Fosfolipidy Fosfolipidy jsou estery glycerolu a kyseliny fosforečné, jsou integrální součástí membrán. Mezi negativní fosfolipidy (PL) řadíme fosfatidylserin, fosfatidylinositol, kyselinu fosfatidovou a kardiolipin. K neutrálním PL patří fosfatidyletanolamin. Hlavní funkcí PL v organismu je účast na vzniku a přeměně membrán, transport tuku a v neposlední řadě poskytování negativně nabitých povrchů pro koagulační reakce (M. Matýšková, 1999) Mechanismus antifosfolipidových protilátek V letech popsaly dvě nezávislé skupiny, ţe LA a antikardiolipinové protilátky (ACLA) mohou být od sebe odděleny u přibliţně 60 % nemocných. Zhodnocení jejich imunologických vlastností se projevilo tak, ţe ACLA jsou sice schopny se vázat na negativně nabité PL, ale nevykazují antikoagulační aktivitu in vitro. Dalším objevem bylo, ţe tyto protilátky vyţadují k výkonu svých imunitních aktivit nějaký plazmatický bílkovinný kofaktor. Pro LA je to lidský protrombin, pro ACLA je to β 2 -glykoprotein I (β 2 -GPI). Koagulaci krve lze schematicky označit jako posloupnost enzymatických reakcí vedoucích k tvorbě trombinu a formování fibrinu. In vivo negativně nabitý fosfolipidový povrch, který tvoří vazebná místa pro koagulační komplexy je nejpravděpodobněji představován membránou aktivovaných destiček. Enzymatické komplexy, které regulují tvorbu trombinů, jsou téţ vytvářeny na negativně nabitém fosfolipidovém povrchu za přítomnosti vápníkových iontů. Tyto koagulační reakce závislé na PL představují alespoň in vitro cíl ACLA Mechanismus působení protilátek LA Bylo zjištěno, ţe izolované protilátky LA interferují s koagulačními testy závislými na PL pouze za přítomnosti lidské plazmy. Mimo jiné působí na koagulační test se zředěným jedem Russelovy zmije a dá se tedy usuzovat, ţe protilátky LA působí nejméně na úrovni přeměny protrombinu na trombin protrombokinázovým komplexem. LA rozeznává vápníkem zprostředkovaný komplex fosfolipidu vázaného na lidský 17

18 protrombin, není tedy přímo protilátkou proti protrombinu. LA můţe bránit aktivaci faktoru X při jeho přímé vazbě na membránu aktivovaných trombocytů, dále působí na úrovni konverze tohoto faktoru zevním komplexem (C. Dostál, 2007). obr. 1, Antikoagulační a prokoagulační působení protilátek typu LA (Pecka, 2004) ACLA protilátky Antikardiolipinové protilátky, jsou protilátky detekované ELISA metodou, kdy pouţitým antigenem je kardiolipin. Souvislost pozitivity ACLA hodnocených ELISA testem s klinickou manifestací se vyskytuje při přetrvávání středních a vysokých titrů protilátek s převahou IgG izotypu. Podle schopnosti ovlivnění koagulačních reakcí bylo navrţeno rozdělení protilátek na ACLA typ A, které zasahují do koagulačních testů závislých na PL a závisí na přítomnosti anti-β 2 -glykoproteinu I protilátek a ACLA typ B, které fosfolipid-dependentní testy neovlivňují. Toto rozlišení má souvislost s rozdílnou specifitou k různým antigenním determinantám (Z. Fojtík, 2004). 4. Diagnostika Vyšetření LA se pouţívá k určení příčiny nevysvětlitelných trombotických stavů, opakovaných potratů nebo prodlouţeného aktivovaného parciálního tromboplastinového času (aptt). Napomáhá odhalit příčinu prodlouţeného aptt, 18

19 kterou můţe být specifický inhibitor (protilátky proti specifickému koagulačnímu faktoru) nebo nespecifický inhibitor jako je LA. Stanovení diagnózy vyţaduje, aby LA byl prokázán více neţ 2x v časovém odstupu 12 týdnů (Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2009). Opakovaná vyšetření také odhalí, zda je přítomnost LA dočasná či chronická. Trvale pozitivní testy na LA, pokud jsou navíc v nedávné minulosti provázeny cévní trombózou či těhotenskou morbiditou, jsou silnějšími faktory pro vznik trombózy neţ antikardiolipinové protilátky (A. Tripodi, 2007). V případě pozitivity antikardiolipinových protilátek můţe být LA dovyšetřováno k vyloučení diagnózy antifosfolipidového syndromu (APS) ( Diagnostická kritéria APS První ucelené diagnostické schéma vzešlo z mezinárodního konsensu na kongresu o antifosfolipidových protilátkách v Sapporu v roce Na 11. kongresu o antifosfolipidových protilátkách v Sydney v roce 2004 došlo k revizi těchto kritérií. Revidovaná kritéria APS (Sydney 2004) Klinická kritéria Trombóza jedna či více manifestací arteriální nebo venózní trombózy, případně trombózy malé cévy v kterékoli tkáni či orgánu Porucha těhotenství jedno či více úmrtí morfologicky normálního plodu po 10. týdnu těhotenství jedno či více předčasných narození morfologicky normálního plodu před 34. týdnem těhotenství tři a více nevysvětlitelných následných spontánních potratů před 10. týdnem těhotenství 19

20 Laboratorní kritéria LA je prokázán v plazmě dva a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů ACLA je prokázán v séru či plazmě, IgG či IgM izotopu ve středním a vysokém titru, je prokázán dva a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů, měřen ELISA metodou anti β2-gpi je prokázán v séru či plazmě, IgG či IgM izotopu, dva a vícekrát v časovém odstupu 12 a více týdnů ELISA metodou (A. Bulíková, 2009) Diagnostika lupus antikoagulans Průkaz LA je poměrně komplikovaný a to ještě více v případě, chceme-li provést diagnostiku za podmínek antitrombotické léčby. Při pouţití nefrakcionovaného heparinu část laboratoří (nejméně ¼) poskytuje falešně pozitivní výsledky i při pouţití komerčních reagencií obsahujících antiheparinové substance jako je polybren či heparináza. Ani v případě pouţití nízkomolekulárního heparinu (LMWH) nelze moţnou interferenci úplně vyloučit. Při léčbě dikumarolovými preparáty se doporučuje převedení na LMWH, a provést vyšetření LA v době, kdy INR klesne pod 1,5, přičemţ poslední dávka LMWH by měla být více neţ 12 hod před odběrem (Journal ofthrombosis and Haemostasis2009). Alternativním a v poslední době ne příliš doporučovaným řešením je diluce vzorku pacienta se stejným objemem normální plazmy, která bude bezdestičková a s normálním obsahem koagulačních faktorů. Vyšetření tímto způsobem by se mělo provádět pouze u nemocných, u nichţ je antikoagulačníi léčba nastavená v rozmezí INR 1,5 3,0 (A. Bulíková, 2009). Průkaz LA vyţaduje několikastupňové vyšetření. Prvním krokem je výběr senzitivního screeningového koagulačního testu (aptt, drvvt). Další krok je odlišení inhibice koagulace od defektu faktoru koagulační kaskády, který se zjišťuje pomocí korekčních (směsných) testů. Posledním krokem jsou konfirmační testy, jejichţ principem je vyvázání inhibitoru nadbytkem fosfolipidu například destičkovým neutralizačním testem nebo pomocí hexagonálních struktur (Z. Fojtík, 2004). 20

21 Není úplně jasné, zda má klinický význam rozlišovat inhibitory na silné a slabé. Předpokládá se moţná uţitečnost pro rozdělení pacientů dle rizika. Jako silné inhibitory se označují ty, které jsou detekovány více neţ jedním způsobem (A. Bulíková, 2009) Léčebná doporučení U nemocných, u nichţ je průkaz APA asymptomatický, není léčebný přístup ještě definitivně vyřešen. I kdyţ je přítomnost APA dlouhodobá či trvalá, řada těchto pacientů nikdy tromboembolickou příhodu neprodělá. V úvahu přicházejí následující postupy: Ţádná trvalá léčba, je doporučeno se vystříhat rizikových faktorů jako je antikoncepce, kouření, obezita. Léčba kyselinou acetylsalicylovou (ASA) nízké dávky aspirinu ( mg denně). Nízkodávkovaná antikoagulační léčba warfarinem (A. Bulíková, 2009). Antikoagulační léčba můţe být trvalá, protoţe byly popsány případy, kdy po ukončení krátkodobé léčby došlo k projevům nových trombóz. "Současná doporučení pro první tromboembolickou manifestaci v žilním řečišti indikují kumariny konvenčně dávkované s cílovým INR 2,0-3,0 (A. Bulíková, 2013). Jestliţe k retrombóze došlo za okolností účinně nastavené antitrombotické medikace, pak se nabízí prakticky jen tři další léčebné postupy; vysokodávkovaná perorální antikoagulace s cílovým INR 3,0-4,0, standardně dávkovaná antikoagulace s INR 2,0-3,0 v kombinaci s protidestičkovou léčbou, případně dlouhodobé podávání nízkomolekulárního heparinu (A. Bulíková, 2013). Léčba u gravidních žen V případech gravidity nemocných, které prodělaly tromboembolickou manifestaci, ať jiţ je jejich porodnická anamnéza jakákoli, je nutno přihlédnout ke zvýšenému riziku opakované trombózy v těhotenství. "Pacientky, které mají zavedenou antikoagulační léčbu warfarinem, musí být převedeny z důvodu rizika teratogenity mezi 6. a 12. týdnem gestace na LMWH. Tato léčba je přerušena 24 hodin před plánovanou indukcí porodu a znovu podána, jak je to jen možné." (A. Bulíková, 2013). 21

22 V současné době jsou k dispozici nová perorální antitrombotika, která nevyţadují rutinní monitorování. Patří mezi ně přímý inhibitor trombinu - dabigatran (Pradaxa) či přímé inhibitory aktivovaného faktoru X - rivaroxaban (Xarelto) a apixaban (Eliquis) (A. Bulíková, 2013). 22

23 II. Praktická část 5. Preanalytická fáze 5.1. Odběr primárního vzorku a transport Odběr vzorku pro vyšetření protilátek typu LA se provádí do modré zkumavky (VACUETTE-výrobce GREINER BIO-ONE). Nutné je dodrţovat správné pořadí zkumavek při odběru, kdy zkumavka na vyšetření LA nesmí být odebrána jako první. Vakuovým systémem se provede odběr krve po rysku na zkumavce (povolená odchylka mnoţství krve je ± 10 %). 5ml zkumavka obsahuje 0,5 ml 3,2% (0,109 mol/l) citrátu sodného jako antikoagulancia. Doporučený interval mezi odběrem krve a vyšetřením plazmy by neměl překročit 4 hodiny při teplotě C (Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2009). U pacientů s vysokým, či nízkým hematokritem (mimo rozmezí 0,25-0,55) se doporučuje správné mnoţství citrátu přepočítat dle vzorce pro úpravu objemu odebrané krve dle objemu citrátu v odběrové zkumavce: objem citrátu (ml) = 1 HCT 5,95 HCT 5.2. Základní centrifugace x objem plné krve (ml) Po identifikaci vzorku (přiřazení identifikačního čísla laboratoře) přímo na primární zkumavce, se provádí první centrifugace 15 minut při 3000 g na centrifuze Allegra X-12 firmy Beckman Coulter. Vzorky se po první centrifugaci ihned dále zpracovávají (viz odstavec 6.4) (Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2009) Stabilita Po odběru je plazma stabilní při teplotě 15 aţ 25 C 2 hodiny. Pro pozdější zpracování je moţné plazmu zamrazit při -20 C na maximálně dva týdny, při -70 C na dobu maximálně 6 měsíců (Journal ofthrombosis and Haemostasis, 2009) Příprava plazmy k zamrazení, uchovávání vzorků před analýzou Vyšetření protilátek typu LA je speciální vyšetření, neprovádí se kaţdý den, vzorky je nutné zamrazit. Po základní centrifugaci (viz výše), je plazma staţena do označené umělohmotné zkumavky a pak znovu centrifugována. Přibliţně 1 cm plazmy nad krvinkami se jiţ nestahuje. Laboratorní stanovení protilátek typu LA vyţaduje tzv. 23

24 bezdestičkovou plazmu (PLT < 10 x 10 9 /l). Nesprávně zpracovaný materiál můţe zvýšit procento falešně negativních výsledků (Pecka, 2010). Po důkladné dvojnásobné centrifugaci je plazma přenesena do mikrozkumavek a označena štítky. Uchovávají se vţdy 2 alikvoty: jeden pro screening a jeden pro konfirmaci. Takto připravené 2 alikvoty se odděleně zamrazí při -70 aţ -80 C na dobu max. 4 týdnů. (Dokumentace Laboratoří PLM). Důležitost dvojí centrifugace pro získání bezdestičkové plazmy U souboru dvaceti pacientů jsme provedli centrifugační pokus. Pouţili jsme vţdy dvě zkumavky citrátové krve od kaţdého pacienta. První zkumavku jsme centrifugovali na centrifuze StatSpin Express 4 od firmy Medista. Centrifugace probíhala 3 minuty při 4000 g ( Poté jsme změřili počet trombocytů na analyzátoru Sysmex XN 1000 v manuálním modu. Výsledek počtu trombocytů je uveden v tabulce č. 1. Druhou zkumavku jsme centrifugovali na centrifuze Allegra X-12 po dobu 15 minut při 3000 g. Z takto získané plazmy jsme na analyzátoru Sysmex XN 1000 opět změřili počet destiček. Výsledek je uveden v tabulce č. 1. Poslední hodnotu počtu trombocytů jsme získali opakovanou centrifugací druhé zkumavky na centrifuze Allegra X-12 při 3000 g. Pacient Datum Tabulka č. 1, Soubor "Rozdílná centrifugace" Soubor "Rozdílná centrifugace" Stat spin 1. centr. Počet THR Počet THR 2. centr. Počet THR K. L Š. P P. K Č. T Š. H Z. J H. J L. L R. J Č. M D. J

25 Pacient Datum Soubor "Rozdílná centrifugace" Stat spin 1. centr. Počet THR Počet THR 2. centr. Počet THR P. D P. L K. J R. L Č. J H. M M. L J. A V. E Ve sledovaném souboru pacientů s rozdílnou centrifugací byly pouze 2 vzorky LA pozitivní. V následující tabulce je porovnání výsledků screeningových testů u dvou LA pozitivních vzorků pro rozdílné centrifugace: Tabulka č. 2,Porovnání výsledků u LA pozitivních vzorků pro rozdílné centrifugace Porovnání výsledků u LA pozitivních vzorků pro rozdílné centrifugace Pacient Datum výsledky APTT-LA výsledky drvvt Stat spin 1. centr. 2. centr. Stat spin 1. centr. 2. centr. D. J ,31 1,79 1,94 0,66 1,03 1,0 P. D ,19 1,36 1,4 1,37 1,45 1,52 Z daného pokusu vyplývá, ţe dvojí centrifugace ve sto procentech splnila poţadavek na bezdestičkovou plazmu, coţ představuje počet trombocytů niţší neţ 10 x 10 9 /l. Centrifugace na rychlocentrifuze StatSpin je pro vyšetření LA naprosto nevhodná a jednostupňová centrifugace je téměř v polovině případů nedostačující. V pokusu se také potvrdila hypotéza, ţe případná nedostatečná centrifugace vzorku můţe způsobit falešně negativní výsledky testů LA Rozmrazení plazmy a příprava k měření Vzorky se rozmrazují co nejrychleji v termostatu při 37 C, aby nedošlo ke kryoprecipitaci. Ne vţdy provádíme konfirmační vyšetření ve stejný den jako screening, 25

26 proto je nutné vzorky pro konfirmaci rozmrazovat aţ těsně před samotným prováděním konfirmačních testů (Dokumentace Laboratoří PLM) Přístroje Analyzátor STA-R Analyzátor STA-R (Diagnostica Stago) je vysokokapacitní, plně automatizovaný a volně programovatelný koagulometr pro provádění in vitro testů koagulačních, chromogenních a hematoimunologických. Analyzátor pracuje s primárními zkumavkami nebo mikrozkumavkami. Elektromechanický způsob měření princip Elektromechanický princip detekce koagulace je zaloţen na měření nárůstu viskozity prostředí. Kaţdá měřicí kyveta obsahuje kovovou kuličku. Při stálé viskozitě se tato kulička díky elektromagnetickému poli vytvářenému střídavě na obou stranách měřicí hlavy pravidelně pohybuje. Frekvence elektromagnetického pole se blíţí vlastní oscilační frekvenci kuličky, coţ umoţňuje velmi vysokou citlivost systému. Pro kaţdou měřící hlavu vytvářejí magnetické pole 2 motorové cívky a software je automaticky nastavuje v závislosti na viskozitě prostředí a druhu testu. Měřicí cívky zahrnují jednu vysílací a jednu přijímací cívku. Při stálé viskozitě je oscilační amplituda kuličky stálá. Kdyţ se viskozita zvětšuje, oscilační amplituda se zmenšuje. Tuto změnu amplitudy vyuţívá algoritmus stanovující dobu koagulace. 26

27 Obr. 2, STA-R Evolution (vlastní zdroj) Analyzátor STart-4 Analyzátor STart-4 (Diagnostica Stago) je plně programovatelný poloautomatický čtyřkanálový koagulometr vhodný pro stanovení veškerých koagulačních parametrů, pro měření z plazmy i plné krve. Kyvety i kuličky se manuálně vkládají do inkubačních a měřicích pozic, pipetování plazmy a reagencií je manuální. Princip měření Princip spočívá v měření změn oscilace kuliček prostřednictvím indukčních snímačů. Kulička vykonává kyvadlový pohyb, kterého je dosaţeno díky dvěma zakřiveným drahám kyvet a střídavému elektromagnetickému poli vytvářenému dvěma samostatnými cívkami. Amplituda oscilace je konstantní v případě konstantní viskozity prostředí, sniţuje se v případě zvýšení viskozity prostředí. Intenzita magnetického pole se můţe měnit v závislosti na prováděných testech a na vzniku předpokládané sraţeniny. Systém detekce změn amplitudy je zaloţen na dvou měřicích cívkách. Vysílací cívka emituje elektromagnetické pole. Signál přijatý přijímací cívkou závisí na pozici kuličky v kyvetě. Algoritmus pak pouţívá tyto změny amplitudy ke stanovení doby koagulace. 27

28 Přídavná zařízení-multipipeta Fin Jedná se o kabelem připojovanou pipetu, kterou Diagnostica Stago upravila tak, aby obsahovala systém detekce dávkování reagencie a kabel pro přenos informací o dávkování. S touto pipetou můţe být automaticky spuštěno měření při dávkování startovacích reagencií (Dokumentace Laboratoří PLM). Koagulometr STart-4 Obr. 3 Koagulometr Star-4 (vlastní zdroj) 6. Vlastní vyšetření LA Diagnostika LA je pro různou citlivost reagencií a heterogenitu stanovovaných protilátek poměrně sloţitá. Kompletní vyšetření LA zahrnuje screeningové, směsné a konfirmační testy. Směsné a konfirmační testy se provádějí pouze v případě pozitivity screeningových testů Screeningová vyšetření Pro screening LA je nutno pouţít minimálně 2 testy na rozdílném principu. Na pracovišti OKH-IKEM se provádí aptt-la a drvvt. Tyto testy se provádí pouze v případě prodlouţeného rutinního aptt Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) U kaţdého pacienta s poţadavkem na vyšetření LA se provádí klasické (rutinní) vyšetření aptt. Toto vyšetření patří mezi skupinové testy. Je to základní koagulační 28

29 test monitorující vnitřní koagulační systém: F XII, XI, IX, VIII, PK, HMWK, při současném prodlouţení protrombinového času (PT) rovněţ F X, případně F V, II a fibrinogen (M. Matýšková,1999). aptt reagencie se vyznačují různou citlivostí vůči přítomnosti LA. Citlivost reagencie je dána druhem a koncentrací fosfolipidů a dále kontaktním aktivátorem - suspenze negativně nabitých částic (nejčastěji se pouţívají křemičitany, kaolin, kyselina elagová, polyfenol nebo negativně nabité sulfatidy s kaolinem). Vlastnosti reagencie ovlivňuje vzájemná kombinace fosfolipidů a aktivátoru a také výsledná iontová síla (Pecka, 2010). Základní požadavky na aptt reagencie - citlivost k defektům faktorů vnitřního koagulačního systému - citlivost k heparinu - citlivost k LA (M. Matýšková, 1999). Princip testu aptt V přítomnosti čištěných fosfolipidů (kefalinu), vápenatých iontů a povrchového aktivátoru, dochází v plazmě chudé na destičky (PPP) k aktivaci vnitřní cesty přeměny protrombinu na trombin. Vzniklý trombin aktivuje přeměnu fibrinogenu na fibrin. Citrátová plazma se temperuje při 37 C po určitou dobu (3 minuty) spolu s aktivátory a fosfolipidy. Začátek reakce se startuje přidáním roztoku chloridu vápenatého (0,025M) a sleduje se čas od přidání startovací reagencie do vzniku fibrinu (M. Pecka, 2010). Interpretace výsledků Výsledek se vydává jako poměr časů R tzv. ratio (čas pacienta k času kontroly) v sekundách. R aptt = t p /t n t p čas testované plazmy t n čas normálu 29

30 Parciální tromboplastinový čas - rutinní reagencie - aptt Pro rutinní měření aptt na našem pracovišti pouţíváme reagencii PTT AUTOMATE od firmy DIAGNOSTICA STAGO. Je to lyofilizované činidlo, které obsahuje náhradu krevních destiček (kefalin), coţ je výtaţek z mozkové tkáně králíka a aktivátor (oxid křemičitý). Tato reagencie má střední citlivost k LA (Příbalová dokumentace fy DIAGNOSTICA STAGO, Listopad 2009). Referenční rozmezí Neléčení: ratio = 0,8 1,2 Léčení nefrakcionovaným heparinem obvykle: ratio = 2,0 4,0 aptt se vyuţívá při diagnóze kolagulopatií s poruchou vnitřního koagulačního systému. Prodlouţené časy dostáváme u jaterních nemocí, při poruchách faktorů vnitřního koagulačního systému, u hemofilií, při nedostatku vitamínu K, v přítomnosti látek s antitrombotickým účinkem. aptt můţe prodluţovat i přítomnost specifického nebo nespecifického (lupus antikoagulans) inhibitoru (Dokumentace Laboratoří PLM) Parciální tromboplastinový čas citlivý k lupus antikoagulans aptt-la Lupus antikoagulans jsou protilátky, které účinkují proti fosfolipoproteinovým komplexům. Mají schopnost prodluţovat koagulační čas testů závislých na fosfolipidech. Pro screeningové testy LA se doporučuje pouţívat reagencie s nízkým mnoţstvím fosfolipidu a aktivátorem silica (křemičitanové částice). V zahraniční literatuře je tento test označován jako silica clotting time (SCT) (Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009). Přítomnost cirkulujících protilátek typu LA způsobí mnohem výraznější prodlouţení aptt stanoveného pomocí PTT-LA neţ při stanovení pomocí jiných reagencií. Pro screening LA se na našem pracovišti pouţívá reagencie PTT LA od firmy DIAGNOSTICA STAGO. 30

31 Princip testu aptt-la Za přítomnosti kefalinu a aktivátoru dojde ke změření rekalcifikačního času plazmy. Přítomnost antifosfolipidových protilátek prodluţuje koagulační čas. Aktivace reagencie umoţňuje specificky postihnout prodlouţení, které způsobily protilátky LA (Příbalová dokumentace fy DIAGNOSTICA STAGO, REF 00599, prosinec 2008). Referenční rozmezí: 0,8 1, drvvt screen (Dilute Russel viper venom time) Test s jedem Russelovy zmije (ředěný) slouţí v rámci laboratorní diagnostiky jako screeningový test protilátek typu lupus antikoagulans. Vysoká citlivost tohoto testu vůči LA je dána sníţeným mnoţstvím fosfolipidů. V případě přítomnosti těchto protilátek dochází k výraznému prodlouţení koagulačního času drvvt, který se nekoriguje ani přidáním normální plazmy, (Příbalová dokumentace fy DIAGNOSTICA STAGO, 2009). Princip screeningového testu drvvt V laboratoři OKH-IKEM pouţíváme reagencii Staclot drvvtscreen. Obsahuje jiţ výše zmíněný jed Russelovy zmije, který za přítomnosti kalcia aktivuje faktor X. Ten spouští koagulaci a eliminuje interakci předcházejících faktorů. Tento test nezávisí na anomáliích kontaktní fáze a poruchách faktorů VIII a IX.. Interpretace výsledků Konečný výsledek je vyjádřen v poměru drvvt screen: Koagulační čas drvvt screen vzorku (s) Poměr drvvt screen = Koagulační čas drvvt screen referenční pool (s) Koagulační čas referenčního poolu získáme pomocí Pool plazmy (fy STAGO), u které 10x změříme test drvvt screen, a výsledkem je průměr měřených časů. Referenční rozmezí: 0,8 1,2 31

32 Vyhodnocení screeningových testů drvvt a aptt-la Pokud je poměr obou screeningových testů 1,2, je testování ukončeno a LA vyloučen. Je-li poměr koagulačního času vzorku k poolu, byť jen v jednom testu vyšší neţ 1,20, jedná se o abnormální výsledek s moţnou přítomností LA. Pokračuje se dále ve vyšetřování pomocí směsných testů a konfirmačních testů Směsné testy na principu aptt-la a drvvt V případě pozitivity ve screeningových testech je nutné prokázat přítomnost inhibitoru pomocí směsných testů. Sleduje se, zda dojde ke korekci prodlouţených časů pomocí normální plazmy. V případě korekce se pravděpodobně nejedná o LA a je vhodné ověřit deficit koagulačních faktorů. V praxi se korekční test provádí smísením vzorku s normální bezdestičkovou plazmou (Pool plazma fy STAGO) v poměru 1:1. Protilátky typu LA jsou typickým příkladem inhibitoru, který není časově závislý a působí ihned, a proto není nutná inkubace při 37 C. Směsný test se provádí pouze u těch screeningových testů, které byly prodlouţeny (M. Penka, 2011). Pro vyhodnocení směsného testu se pouţívá výpočet tzv. Rösnerova indexu nebo výpočet poměru k normální plazmě (M. Pecka, 2010). Výpočet Rösnerova indexu (RI) (koag. čas směsi 1:1 koag. čas norm. plazmy) RI (%) = * 100 koag. čas pacienta Tabulka č. 3, Vyhodnocení Rösnerova indexu Vyhodnocení Rösnerova indexu RI < 12 RI = RI > 15 korekce nejasný výsledek pozitivní výsledek Pokud je dostatek materiálu, je vhodné provést směsný test drvvt i u konfirmačního testu (pouze pokud je výsledek vyšší neţ 1,2). Následující tabulka pak 32

33 umoţňuje lépe vyhodnotit vzorky s prodlouţeným drvvt. Rozhodovací kritéria uvedené v tabulce jsou ve formě poměru pacienta k normální plazmě. DRVVT SCREEN RATIO Tabulka č. 4, Vyhodnocení výsledků testů drvvt DRVVT CONFIRM RATIO PLAZMA PLAZMA PACIENTA+ POOL PACIENTA NORM(1+1) PLAZMA PLAZMA PACIENTA+ POOL PACIENTA NORM(1+1) 0,7-1,2 0,7-1,2 0,7-1,2 0,7-1,2 >1,2 >1,2 0,7-1,2 0,7-1,2 >1,2 0,7-1,2 >1,2 0,7-1,2 >1,2 >1,2 >1,2 0,7-1,2 >1,2 >1,2 >1,2 >1,2 ZÁVĚR LA nedetegovány LA přítomny Deficit faktoru/léčba kumariny LA+deficit faktoru Jiné inhibitory 6.3. Konfirmační testy Konfirmační testy slouţí k průkazu inhibitoru a doporučuje se je provádět vţdy (alespoň jeden z testů) v případě pozitivního screeningového testu. Pro tento účel se pouţívají reagencie s vyšším obsahem fosfolipidů.(m. Penka, 2011). V naší laboratoři IKEM provádíme tyto konfirmační testy: aptt necitlivé, aptt s hexagonálním uspořádáním fosfolipidů a test s jedem Russelovy zmije s vysokou koncentrací fosfolipidů aptt necitlivé na LA Hematologická laboratoř IKEM pouţívá reagencii DADE ACTIN FS od fy SIEMENS. Reagencie je necitlivá k přítomnosti protilátek typu LA. (Příbalová dokumentace fy SIEMENS DadeActin FS Activate PTT Reagent, edition July 2010) Actin obsahuje nadbytek fosfolipidů, čímţ dojde k neutralizaci inhibitoru a normalizaci naměřeného času. Jak reagencie PTT-LA, tak i ACTIN FS jsou citlivé k heparinu a defektu faktorů. Rozdíl mezi těmito dvěma testy je v tom, ţe u pacientů s LA bude APTT-LA výrazně prodlouţeno, zatímco výsledek s ACTINEM bude normální nebo se bude výrazně korigovat ( spadianews č. 8, 2010/12). 33

34 Pro vyhodnocení tohoto testu pouţíváme tzv. normalizovaný poměr (NR), který se vypočítá jako poměr aptt-la ratio/actin ratio. ACTIN ratio je podíl času pacienta stanoveného reagencií ACTIN ke koagulačnímu času referenčního poolu (Journal ofthrombosis and Haemostasis 2009). Referenční pool získáme změřením vzorků normální plazmy (muţi + ţeny) let, kteří nejsou léčeni (ATB, protizánětlivé léky, antikoagulancia) ani nejsou dobrovolní dárci krve s normálními základními koagulačními testy: INR 0,9-1,2, APTT = 0,8-1,2, Fbg = 2 4 g/l, dvojitá centrifugace. Pokud je NR 1,2, je LA nepravděpodobný. U prodlouţených směsných testů či patologického výsledku NR je však nutné tento konfirmační test vţdy doplnit testem s hexagonálním uspořádáním fosfolipidů (Staclot LA, Diagnostica Stago) Konfirmační test s hexagonálním uspořádáním fosfolipidů Princip testu Pokud jsou ve vyšetřované plazmě přítomny protilátky typu LA, dojde k jejich neutralizaci hexagonální strukturou fosfatidyletanolaminu To způsobí zkrácení času v kyvetě, kde je přítomna hexagonální struktura v porovnání s koagulačním časem systému s pufrem. Vlastní vyšetření probíhá následovně: vyšetřovaná plazma je inkubována při 37 C s fosfatidyletanolaminem v hexagonální fázi (CT 2 ) a paralelně s pufrem (CT 1 ). V další fázi je do obou kyvet přidána normální lidská plazma obsahující inhibitor heparinu. Tento krok je důleţitý pro korekci případného deficitu koagulačních faktorů, eventuelně k zamezení vlivu antikoagulační léčby (UFH v testu interferuje aţ v koncentracích nad 1 IU/ml). Po další inkubaci se přidává kefalin s aktivátorem křemičitanových částic (PTT-LS) a naposledy se inkubuje. Koagulace se startuje přídavkem CaCl 2 (0,025M) (Příbalová dokumentace fy DIAGNOSTICA STAGO STACLOT LA, REF 00600, Květen 2009). U koagulačních časů získaných v kyvetě 1 (CT 1 ) a v kyvetě 2 (CT 2 ) se vypočítá rozdíl (CT 1 CT 2 ). Jestliţe je rozdíl časů větší nebo roven 8 s, je potvrzena přítomnost protilátek lupus antikoagulans v plazmě. V případě časového rozdílu méně neţ 8 s je 34

35 výsledek negativní. Pokud nám vyjde rozdíl časů jako záporná hodnota, výsledek je posuzován jako negativní nález (Pecka,2010) drvvtconfirm Tento test s jedem Russelovy zmije obsahuje vyšší mnoţství fosfolipidů, které neutralizují LA přítomné v testovací plazmě. V případě pozitivity LA bude čas zjištěný testováním drvvtconfirm výrazně kratší neţ koagulační čas při vyšetření drvvtscreen. Pro vyhodnocení se vypočítá ratio drvvtconfirm. koag. čas corfirm vzorku (s) drvvtcorfirm ratio = koag. čas confirm referenčního poolu (s) Koagulační čas referenčního poolu získáme pomocí Pool plazmy (fy STAGO), u které 10x změříme test drvvtconfirm a výsledkem je průměr měřených časů. Konečný výsledek konfirmace je vyjádřen pomocí normalizovaného poměru drvvt. normalizovaný poměr drvvt = (Příbalová dokumentace fy Stago, REF 00334, listopad 2009) poměr drvvt screen poměr drvvt confirm 7. Experimentální část Diagnostika LA začíná screeningovými testy. Na základě výsledků těchto testů je v případě negativity testování ukončeno. Ve sledovaném období od do byly protilátky typu LA testovány v naší laboratoři testovány celkem u 1198 pacientů: 479 muţů a 719 ţen, věkové rozmezí mezi 3 roky a 90 lety, průměrný věk 50,11 let. Jasně negativní ve screeningových testech bylo 663 pacientů, coţ představuje 55,3 %. V případě pozitivity jednoho či obou screeningových testů se pokračovalo vyšetřením směsných a konfirmačních testů. Pro vyhodnocení se pouţívá výpočet tzv. 35

36 Rösnerova indexu nebo výpočet poměru k normální plazmě. V této práci jsme porovnávali oba způsoby vyhodnocení. Na základě výsledků konfirmačních testů jsme vzorky zpětně rozdělili na negativní a pozitivní, a dále výsledek směsných testů jako FN (false negativ), TN (truth negativ), FP (false pozitiv), TP (truth pozitiv). Pacienty, u kterých byl nesoulad v konfirmačních testech, jsme označili jako nejednoznačně. Interferující antikoagulační léčba, či jiné faktory ovlivnily stanovení natolik, ţe nebylo moţno vydat výsledek s jasnou pozitivitou či negativitou. Pomocí následujících vzorců jsme spočítali senzitivitu a specifitu a oba způsoby vyhodnocení směsných testů jsme porovnali. Tabulky s počty FN, TN, FP a TP pro drvvt a aptt-la viz příloha. výpočet specifity=100*tn/(fp+tn) výpočet senzitivity=100*tp/(tp+fn) Senzitivita (citlivost) udává procento správně pozitivních výsledků ze souboru nemocných. Čím vyšší je senzitivita, tím je méně falešně negativních výsledků. Udává se obvykle jako zlomek jedné nebo v procentech. (Dastych, 2011). Specifita udává procento správně negativních výsledků ze souboru zdravých osob. Čím vyšší je specifita, tím je méně falešně pozitivních výsledků. Udává se obvykle jako zlomek jedné nebo v procentech (Dastych, 2011) Výsledky porovnání směsných testů drvvv1+1 ratio Tabulka č.5, Porovnání senzitivity a specifity drvvt1+1rösnerův index aptt-la 1+1 ratio aptt-la 1+1Rösnerův index TN FN

37 drvvv1+1 ratio drvvt1+1rösnerův index aptt-la 1+1 ratio aptt-la 1+1Rösnerův index TP FP Specifita 98,68 % 99,3 % 91,61 % 93,05 % Senzitivita 85,50 % 84,71 % 96,88 % 96,92 % Z uvedené tabulky vyplývá, ţe drvvt testy nemají příliš vysokou senzitivitu. Z tohoto důvodu je zejména pro drvvt velmi důleţité pokračovat v provádění konfirmačních testů vţdy při prodlouţení screeningových testů, i kdyţ je negativní směsný test. V zahraniční EHK (externí hodnocení kvality ECAT) se pro vyhodnocení směsných testů vyţaduje poměr směsi 1+1 k normální plazmě, ale vyhodnocení pomocí Rösnerova indexu má v EHK stejnou specifitu a senzitivitu Výsledky porovnání konfirmačních testů na principu aptt V naší laboratoři pouţíváme 2 konfirmační testy na principu aptt. Zajímalo nás v jakých případech tyto dva testy spolu nekorelují a pokusili jsme se tyto situace zmapovat. Vyhodnocení nám bohuţel komplikovala nemoţnost získat veškeré informace o moţných interferencích. Sledovaný soubor zahrnoval celkem 345 pacientů. Pozitivní konfirmační test na principu aptt (NR) aptt-la/apttnecitl. byl v 186 případech (53,8 %). Oproti tomu hexagonální konfirmační test byl pozitivní pouze u 84 pacientů. Soulad v konfirmačních testech byl u 67 pacientů, tj. 36 % ze všech pozitivních případů. Pacientů, kteří měli pozitivní aptt (NR) a zároveň negativní hexagonální konfirmační test bylo 117 tj. 62,9 %, z toho u 38 (32,5 %) pacientů byla prokázána falešná pozitivita vlivem interference kumarinové či heparinové léčby. Toto procento můţe být ve skutečnosti vyšší, protoţe u 36 pacientů (10,4 %) jsme nebyli schopni 37

38 dohledat případnou léčbu, která by mohla ovlivnit stanovení (byli poslání z externích zdravotnických zařízení). Vzhledem k tomu, ţe hexagonální konfirmační test je koncipován tak, ţe eliminuje případný deficit koagulačních faktorů a vliv antikoagulační léčby (i heparinu do 1 IU/ml), povaţujeme v naší laboratoři (dle doporučení ISTH) tento test jako průkaznější. Proto jsme při vyhodnocování konfirmačních testů postupovali následujícím způsobem. V případě pozitivního hexagonálního testu jsme LA uzavřeli jako prokázaný a negativní výsledek testu aptt (NR) - aptt-la/apttnecitl. jsme označili jako falešně negativní - 21 pacientů (13,2 %). V případě negativního hexagonálního testu a pozitivního aptt (NR) - aptt- LA/aPTTnecitl., kdy se nepodařilo dohledat případnou interferenci antikoagulační léčbou, jsme výsledky uzavřeli jako nejednoznačné s doporučením opakovat vyšetření - 48 pacientů (13,9 %). Soubor pacientů, ze kterého byla data čerpána, viz příloha Kazuistika 1 Pacient Z. B. 1935, vyšetřen Screeningové testy: aptt-la ratio = 1,23 pozitivní drvvtscreen ratio = 1,71 pozitivní Směsné testy: aptt-la 1:1 RI = 5,61 % negativní aptt-la 1:1 ratio = 0,86 negativní drvvtscreen RI 1:1 = 21,4 % pozitivní drvvtscreen ratio = 1,71 pozitivní Konfirmační testy: drvttconfirm ratio = 1,28 pozitivní drvvt screen/confirm = 1,3 pozitivní aptt necitlivé ratio = 1,02 apttscreen/confirm (NR) = 1,21 hexagonál = záporná hodnota negativní 38

39 Vzhledem k hraničnímu výsledku apttscreen/confirm (NR) oproti hexagonálnímu testu a pozitivitě v celé linii drvvt jsme pátrali po případné interferenci antikoagulační léčbou. V těchto případech, pokud léčbu nezjistíme ze zdravotnické dokumentace, je cenným vodítkem výsledek PT a anti-xa aktivity. Výsledek INR byl 1,6. U tohoto pacienta byla nakonec dohledána léčba Rivaroxabanem, hladinu jsme zkontrolovali pomocí testu Biophen DiXaI (Hyphen- Biomed) s výsledkem 0,1 mg/l Kazuistika 2 Vzorek zaslán jako externí hodnocení kvality ECAT. Screeningové testy: aptt-la = 1,57 pozitivní drvvtscreen ratio = 2,5 pozitivní Směsné testy: aptt-la 1:1 RI = 17,3 % pozitivní aptt-la 1:1 ratio = 1,27 pozitivní drvvtscreen 1:1 RI = 33,4 % pozitivní drvvtscreen 1:1 ratio = 1,73 pozitivní Konfirmační testy: aptt necitlivé ratio = 1,89 apttscreen/confirm (NR)= 0,83 Hexagonál = 10,7 pozitivní drvvtconfirm ratio = 1,74 pozitivní drvvt screen/confirm = 1,3 pozitivní drvvt 1:1 confirm RI = 28,01 % pozitivní drvvt 1:1 confirm ratio = 1,49 pozitivní Vzorek i přes negativitu v apttscreen/confirm (NR) byl uzavřen jako pozitivní LA. Při vyhodnocení jsme však zpětně zjistili, ţe vzorek obsahoval 0,2 mg/l Rivaroxabanu. Tento přímý inhibitor falešně pozitivně ovlivnil výsledky i v hexagonálním testu na rozdíl od předchozí kazuistiky, kde byla hodnota Rivaroxabanu o polovinu niţší a hexagonální konfirmační test neovlivnila. Tyto dvě kazuistiky nás poučily v tom, ţe pokud nemáme dostatečné informace o antikoagulační léčbě, je pro spolehlivé vyhodnocení konfirmačních testů vhodné dovyšetřit minimálně PT a anti-xa aktivitu. 39