GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik

Kapilární kolony 19. 23.5. 1958 Sympozium v Amsterodamu M.J.E. Golay 2 chromatogramy dělení všech uhlovodíků C 6 do 9 min., 45,7 m, ID. 0,25 µm, 50 000 teor. pater, 0,5 ml/min McWilliam FID detektor D.H.Desty (BP) první chromatograf pro kapilární kolony a FID dříve skleněné nebo z nerezové oceli dnes výhradně křemenné s polyimidem kapilára (5-150m) vnější stěna je pokryta polyimidovým filmem na vnitřní stěnu je navázána stacionární fáze kolona je charakterizována následujícími parametry typem fáze délkou kolony (5-150m) ID (vnitřní průměr) (0.10-0.75mm) tloušťka fáze d f (0.10-7.0µm) 3

Kapacita kapilárních kolon Kategorie Vnitřní průměr Kapacita Megabore 0,53 mm 100 250 ng Wide bore 0,32 mm 50 125 ng Narrow bore 0,25 mm 50 100 ng Microbore 0,18 0,20 mm 25 50 ng Pro šířku filmu 0,25 µ Zdroj: D. Rood: A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting of Capillary Gas Chromatography Systems, 3 rd Edition, Wiley, 1999 4

Rychlost GC separace Typ GC analýzy Doba separace w 1/2 píku Konvenční >10 min >1 s Rychlá 1 10 min 200 1000 ms Velmi rychlá 0,1 1 min 30 200 ms Ultra-rychlá <0,1 min 5 30 ms Zdroj: K. Maštovká, S.J. Lehotay (2003) J. Chromatogr. A 1000, 153 180 5

Srovnávací tabulka Column ID Sample Capacity (ng) He flow@20cm/sec. H 2 flow@40cm/sec. Theoretical Plates/m Effective Plates/m 0.10mm 5-10 0.18mm 10-20 0.25mm 50-100 0.32mm m 400-0.53mm m 1000-500 2000 0.1cc/ 0.3cc/ 0.7cc/ 1.0cc/ 2.6cc/m min. min. min. min. in. 0.2cc/ 0.6cc/ 1.4cc/ 2.0cc/ 5.2cc/m min. min. min. min. in. 8600 5300 3300 2700 1600 6700 3900 2500 2100 1200 6

uv 90e3 80e3 70e3 60e3 50e3 40e3 30e3 20e3 72 min 910 11 12 C O N V. 10e3 uv 31.40 38.55 0e3 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 min 90e3 80e3 70e3 60e3 50e3 40e3 30e3 16 min F A S T 20e3 10e3 uv 375000 350000 325000 300000 275000 250000 225000 200000 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 6.65 8.35 0e3 0 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 min 2.3 min 1.225 1.425 1.250 1.275 1.300 1.325 1.350 1.375 1.400 min U L T R A F A S 7 T

Aplikace v plynové chromatografii 1. Petrochemie plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta 2. Biochemie, farmacie, soudní chemie FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště 3. Potraviny a nápoje FAME, barviva a vůně, pesticidy,. 4. Životní prostředí pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy 5. Sledování ovzduší sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí 6. Chemie kontrola jednotlivých kroků syntéz 8

SUPELCO 9

Typy fází nevázané SP-... (Supelco Phase), SE-30, SE-54, DEX) vázané SPB - Supelco Phase Bonded Equity 1, 5, 1710 SLB- 5ms- Supelco Low Bleed SUPELCOWAX 10 Polyethyleneglykol tepelně stabilní do 280 C SLB-IL 10

Stacionární fáze Nepolární 100 % dimethylpolysiloxan (5 %-fenyl)methylpolysiloxan Chirální Cyklodextrinové deriváty Polární (50 %-fenyl)methylpolysiloxan Polyethylenglykol (70 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan (100 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan 11

Supelco chirální kapilární GC 12 Oxygen containing analytes in the form of alcohols, ketones, acids, aldehydes, and lactones; halogenated compounds Aliphatic and aromatic amines; aliphatic and some aromatic esters; polar racemates Lactones and aromatic amines; epoxides; styrene oxide Amino acids; amines; furans Aliphatic, olefenic, and aromatic enantiomers Terpenes and tertiary amines Heterocyclic amines Xylenes, menthols, cresols, substituted phenols, substituted benzenes, epoxide enantiomers Acids, alcohols, amines, diols, esters, ethers, halohydrocarbons, hydrocarbons, ketones, positional isomers, silanes, terpenes, terpineols methamphetamine By Chemistry CHIRALDEX TA X CHIRALDEX DP X CHIRALDEX PN X CHIRALDEX BP X CHIRALDEX DM X Supelco DEX 325 X Supelco DEX 225 X CHIRALDEX Bonded B-PM X CHIRALDEX PM X Supelco DEX 120 X Supelco DEX 110 X CHIRALDEX DA X CHIRALDEX PH X By Cyclodextrin alpha-cyclodextrin X beta-cyclodextrin X gamma-cyclodextrin X

SUPELCO kolony pro analýzy životního prostředí, ovzduší 1984 - SPB-608 nízké koncentrace pesticidů a herbicidů, ECD (US EPA 508, 608, 8080, 8081) 1985 - SP-2331 polární kyanosilikonová fáze - dioxiny 1986 VOCOL těkavé organické látky (US EPA 502.2, 524.2, 624, 8240, 8260, 8021) 1987 - Sup-Herb herbicidy dle US EPA metody 507 1995 SPB-624 těkavé halogenované, nehalogenované a aromatické kontaminanty z vody vyhovuje řadě US EPA metod 1997 - SPB-HAP nebezpečné látky znečišťující ovzduší 2003 - Equity 1, 5, 1710 14

SLB- 5ms SLB- 5ms je určena pro stopové analýzy Vývoj byl zaměřen na nový způsob deaktivace povrchu křemenné kapiláry nový typ polymeru Stabilní, nedochází k úniku stacionární fáze čistá MS spektra lepší poměr signál/šum nižší kontaminace MS detektoru 15

Únik stacionární fáze Tradiční kolona - 5% fenyl O Si O Si 5 % Eliminace cyklotrisiloxanu (D3) za vysokých teplot nebo v katalytickém prostředí. Další je eliminace oktametylcyklotetrasiloxan (D4). Me Me 95 % n Si O Si O Si Si O Si O Si + O Si Si O O Si D3 O Si 16

MS Spectrum - únik stacionární fáze Abundance 6500 Scan 4970 (24.623 min): 0715011.D 207 6000 5500 D3 5000 4500 4000 3500 3000 2500 D4 2000 1500 73 281 1000 m/z--> 500 0 44 96 147 115 177 249 323341 429 225 303 363384 407 40 60 80 100120140160180200220240260280300320340360380400420 17

Únik stacionární fáze Silphenylene-Siloxane Copolymer Me Me Me O Si Si O Si Me Me Me x n poly{poly[oxy(dimethylsilandiyl]oxy(dimethylsilandiyl) (1,4-fenylen)(dimethylsilandiyl)} 18

SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách 19

SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách 20

SUPELCO kolony pro petrochemické aplikace Analýzy uhlovodíků Analýzy permanentních plynů, lehkých uhlovodíků atd. SIMDIS Analýzy aromátů Misc. Petrocol DH 50.2 Carboxen-1006 PLOT Petrocol 2887 TCEP SCOT Petrocol DH Carboxen 1010 PLOT Petrocol EX2887 Petrocol DH150 Mol Sieve 5A PLOT SGE HT-5 Petrocol DH Octyl Supel-Q PLOT SPB-1 Sulfur 21

PLOT kolony - charakteristika Carboxen 1006 Carbon Mole Sieve Carboxen 1010 (7A) Carbon Mole Sieve Mol Sieve 5A Zeolite Supel-Q Porus Polymer Alumina sulfate deaktivated Na 2 SO 4 Alumina Chloride deaktivated KCl 715 m 2 /g Sférické Permanentní plyny 675 m 2 /g Sférické Permanentní plyny 325 m 2 /g Nepravidelné Permanentní plyny 705 m 2 /g Sférické Těkavé a středně těkavé látky 250-350 m 2 /g Nepravidelné C1-C12 Uhlovodíky 250-350 m 2 /g Nepravidelné C1-C12 Uhlovodíky, Freony 22

PLOT Alumina Sulfate a Chloride Separace uhlovodíků C1 a C4. Kombinace upraveného povrchu a porózity umožňuje separaci methanu od C2 uhlovodíků, acetylen po n-butanu, separuje se n-penten a 1,3 butadien. PLOT Alumina Chloride je méně polární. separují se na ní např. i freony. 1 2 3 4 56 7 8 9 10 1112 1314 15 16 0 10 20 30 4 Time (min) 2 3 78 5 6 9 11 12 13 14 15 16 10 18 1 17 0 10 20 30 Time (min) 17 18 18 analytů / 35 C (2.5 min.)-> 5 C/min.->150 C Sulfate Peak List (top) 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. n-butane 9. propadiene 10. acetylene 11. trans-2-butene 12. 1-butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. 1,3-butadiene 18. propyne Chloride Peak List 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. acetylene 9. n-butane 10. propadiene 11. trans-2-butene 12. 1-butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. propyne 18. 1,3-butadiene 23

Analýzy FAME Biochemie Analýza potravin Bionafta 24

SUPELCO kolony pro FAME kapilání 1983 - SP-2560 1987 - SP-2380 1990 - Omegawax 320 1991 - Omegawax 250 1995 - SPB-PUFA 2007 - Omegawax 100 25

GC Analysis of Plasma FAMEs on the SUPELCOWAX 10 10 m 0.10 mm I.D., 0.10 µm 26

Omega 3 a 6 mastné kyseliny Analýzy obsahu trans a Omega 3 a 6 mastných kyselin v potravinách se staly velice populární od té doby, kdy se obsah tzv. zdravých tuků musí uvádět na obalech potravin. Rostoucí spotřeba Omega 3 mastných kyselin je spojována se snižováním nebezpečí nemoci věnčitých tepen a zároveň se vyzdvihuje jejich význam při vývoji dětského mozku. Analýzy jsou dlány podle AOAC Metody 991.39 nebo AOCS Metody Ce 1i-07 na 30 metrové koloně Supelcowax 10 nebo Omegawax za 30 až 40 minut. Nová kolona Omegawax 100 µm ID kapilární kolona tento čas významně zkracuje. 27

FAMEs Mastné kyseliny se dělí GC, a to jako methylestery (FAME) Je třeba je derivatizovat. Volba vhodné kolony bude záviset na předpokládaných analytech. Nepolární kolony se používají pro separace nasycených a nenasycených mastných kyselin. Kolony na bázi polyethyleneglycolů zase dělí podle délky uhlíkovéhořetězceči podle stupně nenasycenosti kyselin. Pokud dělíme cis/trans izomery mastných kyselin včetně jejich polohových izomerů, tak většinou používáme vysoce polární kyanosilikonovou fázi. 28

Omezení klasických metod 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20 30 40 50 Time (min) Tuk extrahovaný z margarinu 6t 9t 10t 11t 12t 13t 6c 7c 9c Překryv píků 18:1 trans a cis isomerů 10c 11c 12c 13c 35.0 36.0 37.0 38.0 Time (min) 29

SPE Discovery Ag-Ion Supelco Stabilní stříbrná SPE fáze Při použití běžných organických rozpouštědel nedochází k uniku stacionární fáze Stabilní barva Světlo nemá vliv na Ag-ION sorbent Dlouháživotnost Kapacita 750mg SPE tube až 1 mg celkových FAMEs Předseparace je vysoce reprodukovatelná 30

Mechanismus interakce Mastná kyselina electron donor Stříbro - electron akceptor Cis-mastné kyseliny tvoří pevnější komplex než trans Čím větší počet dvojných vazeb, tím silnější interakce SPE Support - SO 3 Ag + O OCH 3 C 4 H 8 C 11 H 23 Charge-transfer complex between Ag + and unsaturated bond 31

Discovery Ag-Ion postup 32

Cis/Trans FAME - předseparace 33

Ag-ION SPE metoda pro cis/trans FAME separace 1. Kondicionace 4 ml aceton 2. Equilibrace 4 ml hexan 3. Vzorek1 ml (1mg/ml) FAMEs v hexanu, průtok 5mL/min 4. Eluce - frakce 1 6 ml hexan:aceton (96:4 v/v) 5. Eluce - frakce 2 4 ml hexan:aceton (90:10 v/v) 6. Eluce - frakce 3 4 ml aceton 7. Eluce - frakce 4 4 ml aceton:acetonitril (97:3) 8. Odpaření a rozpuštění v hexanu, GC 34

GC separace na SP2560 75m x 0.18 mm ID Použití kratší GC kolony (SP2560, 75 m) a nosný plyn vodík výrazné zkráceníčasu analýzy. Pec: Inj.: Det.: Nosný plyn: Nástřik: Liner: 180 o C, izotermální 220 o C FID, 220 o C vodík, 40 cm/sec při 180 o C 0.5 µl, 100:1 split 4 mm ID, split 35

Standardní směs FAMEs Celkový obsah FAMEs je 1 mg/ml Standard Mixture 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) SPE fraction1 18:1 t Hexan: Aceton 96:4 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) SPE fraction 2 18:1 c Hexan: Aceton 90:10 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 Time (min) SPE fraction 3 Aceton 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) SPE fraction 4 Acetonitril 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) 36

Výsledky analýzy FAMEs (% recovery) Elution 18:0 18:1t 18:1c 18:2tt 18:2 c/t 18:2cc 18:3ttt 18:3 1 6 ml Hexan:aceton (96:4) 100 98.1 0.4 2 4 ml Hexan:aceton (90:10) 1.90 99.60 100 3 4 ml Aceton 100 50 100 40 4 4 ml Aceton:acetonitril (97:3) 50 55 TOTAL 100 100 100 100 100 100 100 95 Izomer 18:3ccc lze eluovat 100% ACN 37

Analýza bramborových chipsů Rozemlít a extrahovat 4 x 4ml petroletheru Podpařit a rozpustit v toluenu Esterifikace 7% BF3/MeOH Po esterifikaci se re-extrahoje do hexanu a vysuší sena 2 SO 4 Předseparace Ag-ION SPE 750mg/6 ml 38

Analýza bramborových chipsů counts Untreated extract 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) counts SPE Fraction 1 18:1 t 6 8 10 12 14 16 18 20 counts SPE Fraction 2 18:1 c 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) counts SPE Fraction 3 6 8 10 12 14 16 18 20 Time (min) 39

Řepkový olej analýza FAME Řepkový olej je typickým reprezentantem rostlinných olejů. Obsahuje nenasycené, mono a více nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Následující chromatogram ukazuje 6 minutovou analýzu nenasycených cis FAME na koloně Omegawax 100 column. 40

Řepkový olej - FAME, Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D. x 0.10 µm 4 5 1 2 3 6 7 8 9 10 11 1. Myristic (C14:0) 2. Palmitic (C16:0) 3. Stearic (C18:0) 5. Linoleic (C18:2n6c) 6. Linolenic (C18:3n3) 7. Arachidic (C20:0) 8. cis-11-eicosenoic (C20:1) 9. Behenic (C22:0) 10. Erucic (C22:1n9) 11. Lignoceric (C24:0) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Time (min) column: Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D., 0.10 µm oven: 140 C, 40 C/min. to 260 C (2 min.) inj: 250 C det.: FID, 260 C carrier gas: H 2, 55 cm/sec., constant injection: 0.2 µl, 200:1 split liner: 4 mm I.D., cup split sample: Rapeseed Oil FAME Mix 41

EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax 43

EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax 44

GC kolony s fází na bázi iontových kapalin aniont CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 cation linkage cation N + N N + N anion CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát) anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota málo těkavé, stabilní až do 380 C určené pro analyty s širokým rozsahem polarit 46

Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita -Octyl 280 C -1 350 C -5 360 C -20 300 C -1701 280 C -35 300 C -50 310 C -225 240 C PAG 220 C PEG 280 C -2330 250 C -2331 275 C -2560 250 C TCEP 145 C Non- Polar Intermediate Polar Polar Highly Polar Extremely Polar 0 25 50 75 100 SLB-IL59 300 C SLB-IL76 270 C SLB-IL82 270 C SLB-IL100 230 C SLB-IL111 270 C 47 sigma-aldrich.com/il-gc

Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants. P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100). Prof. Luigi Mondello (University of Messina, Italy) 48 sigma-aldrich.com/il-gc

První publikace v 2010 49

SP-2560-100 metrů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs 50

SLB-IL111-100 meterů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs 51

Omezení konvenční 1D-GC Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků Složky aroma (např. aroma kávy: 600 700 sloučenin) Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy) Chybná / nemožná identifikace analytů Nadhodnocení / podhodnocení výsledků Řešení Nové detekční techniky Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC) 52

Kompletní dvourozměrná GC (GC GC) Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem Injektor Modulátor Detektor Primární kolona Obvykle narrow bore (nepolární) kolona (30 m 0,25 mm 0,25 µm) Sekundární kolona Obvykle microbore (polární) kolona (1 m 0,10 mm 0,10 µm) 53

KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony Kryogenicky zaostřenéčásti jsou přeneseny na 2. kolonu Rychlá separace na 2. koloně Modulace (kryogenní zaostření) Efluent z 1. kolony Efluent z 2. kolony 54

TVORBA GC GC CHROMATOGRAMU 1D chromatogram (výstup z první kolony) MODULACE Základní 2D chromatogram (výstup z druhé kolony) TRANSFORMACE 2D chromatogramy naskládané vedle sebe Vrstevnicový půdorys 2D chromatogramu VIZUALIZACE 55

VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků Zlepšení detekce Tvorba strukturovaných chromatogramů 56

VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků (n c ) Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou do separačního prostoru (chromatogramu) zvýšení separační účinnosti 1. Dimenze 2. Dimenze Konvenční kapilární kolona n = 1 000 n c (celk) = n c (kolona 1) n c (kolona 2) GC GC (kolona druhé dimenze: n = 25) n = 1 000 25 = 25 000 57

Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu 1D-GC Dichlorvos 0,01 mg/kg v přečištěném extraktu jablek Interference: m/z 109 (kvantifikace) m/z 79 (identifikace) BEZ SHODY S KNIHOVNOU SPEKTER 58 Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173 186

Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu GC GC Dichlorvos spolehlivě identifikován a kvantifikován Výsledek zvýšené kapacity píků 5-hydroxymethyl- 2-furan-karbaldehyd H it N a m e R e v e rs e C A S P h o s p h o ric a c id, 2,2-1 d ic h lo ro vin yl d im e th yl e s te r 9 4 0 6 2-7 3-7 P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 2 d im e th yl e ste r 7 2 9 6 2-7 3-7 P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 3 d im e th yl e ste r 7 0 7 6 2-7 3-7 P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 4 d im e th yl e ste r 7 0 4 6 2-7 3-7 P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 5 d im e th yl e ste r 7 0 0 6 2-7 3-7 Separovaný koextrakt 59 Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173 186

Strukturované chromatogramy Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických skupin) Specifické interakce Separace podle polarity Systém: nepolární polární kolony Separace podle bodu varu Tlak par (Těkavost) 60

Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME Systém: nepolární polární kolony polyethylenglycol 5 % fenylmethylpolysiloxan Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282 289 61

Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME Systém: polární nepolární kolony 50 % fenylmethylpolysiloxan polyethylenglycol 62 Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282 289

GC doplňky a nářadí 63

HPLC 64

Trendy v současné HPLC Rychlá chromatografie (UHPLC) Vysoké rozlišení Zvýšení separační účinnosti Snížení meze detekce Krátký čas separace Ekonomický provoz Ekologický provoz 65

Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors ChromatographyOnline.com 66

Ascentis HPLC kolony Ascentis HPLC kolony jsou 4 generací SUPELCO HPLC kolon Zahrnují následující typy kolon: C18, C8, ES-CN, Si, Phenyl, RP-Amide, Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí. Discovery HPLC kolony jsou 3 generací SUPELCO HPLC kolon Zahrnují následující typy kolon: C18, HS C18, C8, Cyano, PEG, HS F5 Discovery BIO Wide Pore Discovery Zr Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí. 68

Klasifikace podle možné chemické interakce a Bonded Phase Hydrophobic H-Bonding Dipolar π-π Steric b Ionic b C18 Very Strong Weak No No No Moderate C8 Strong Weak No No No Weak RP- Amide Strong Strong Acceptor Moderate No Weak Very weak Phenyl Strong Weak Acceptor Weak Strong Donor Strong (Rigid) Weak F5 or PFP Moderate Moderate Acceptor Strong Strong Acceptor Strong (Rigid) Moderate Cyano Light to Moderate Weak Acceptor Strong Weak No Moderate a. Using Euerby 2 variation of Snyder-Dolan-Carr Hydrophobic Subtraction Model 3. b. Steric and Ionic probe data are not very helpful in predicting or interpreting steroid selectivity results; however, they are always underlying factors with silica bonded phases. 69

Discovery BIO Wide Pore dokonale sférické, porézníčástice velikost částic 3, 5, 10 µm velikost pórů 300Å specifický povrch 100 m 2 /g velikost porů je vhodná pro HPLC analýzy proteinů, polypeptidů a oligonucleotidů Vynikající pro analýzy hydrofobních molekul (MH > 500 Dalton) pro oblast proteomiky jsou v nabídce kolony křemenné kapiláry mikrobore kolony 70

Discovery BIO Wide Pore Discovery BIO C18 fáze je vhodná pro analýzu peptidů RP fáze s největší hydrofobicitou Discovery BIO C8 středně hydrofobní fáze není používaná tak běžně jako C18 a C4 Discovery BIO C5 doporučovaná pro analýzu proteinů a peptidů separační vlastnosti podobné jako u C4 ve srovnání s C4 má vyšší stabilitu vynikající pro LC/MS analýzy - nekrvácí 71

Discovery BIO PolyMA ionexy na bázi polymethakrylátových pryskyřic.hydrofilní povrch eliminuje adsorpci proteinů Discovery BIO Poly-SCX je silný katex s chemicky vázanou sulfopropylovou skupinou Discovery BIO Poly-WAX je slabý anex s chemicky vázanou diethylaminoethyl skupinou Polymethakrylát, 5µm, 1000Å Iontově výměnná kapacita (oba): 0,3meq/g 72

Discovery Zr výhodou nosiče na bázi ZrO 2 je chemická a tepelná stabilita kolony jsou stabilní v celém rozsahu ph 1-14 a při teplotách do 200 C retenční mechanismus je odlišný od silikagelových kolon (Lewisova teorie kyselin a zásad) kolony jsou mechanicky stabilní a vysoce účinné dodávají se čtyři typy fází 73

C C C C C C C C C C Fáze Discovery Zr Zr-PBD Zr-PS Zr-Carbon Zr-CarbonC18 C C C C C C C C C C C C 74

Fyzikálně chemické vlastnosti oxidu zirkoničitého Atomy Zr ve strukturní mřížce mají charkter Lewisových kyselin. #1 Zr atomy se chovají vlivem přítomnosti prázdných elektonových orbitalů jako Lewisovy kyseliny (akceptor elektronového páru). -O O P O- #2 Lewisovy báze (např. fosforečnany) z mobilní fáze interagují s povrchem stacionární fáze. NH 2 +. O-. R O O Zr O O Zr O O #3 Kladně nabité skupiny, přítomné v molekulách analytů jsou zachycovány na povrchu sorbentu na základě iontově výměnných interakcí. 75

Přehled chirálních stacionárních fází pro HPLC 76

Hamilton www.sigmaaldrich.com/hamiltoncolumns 77

HPLC kolony vhodné pro separaci cukrů SUPELCOGEL Ca SUPELCOGEL C-610H SUPELCOGEL C-611 SUPELCOGEL Ag2 SUPELCOSIL LC-NH2 aphera NH2 column: aphera NH2, 15 cm 4.6 mm I.D., 5 µm mobile phase: 20:80, water:acetonitrile flow rate: 1.0 ml/min temp.: 25 C detector: ELSD, 45 C, 3.5 psi nitrogen injection: 10 µl sample: 500 µg/ml in 30:70, water: acetonitrile 78

Tosoh Corp. 79

Co je HILIC? Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC. Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr. 499 (1990) 177) Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a mobilní fáze relativně nepolární. Mobilní fáze je složena z 60-95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru. Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla Typické složení 70-90% acetonitrilu v 10 mm octanu amonném Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC. Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH), které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem. Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá. Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až po čistě organickou. (.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): 2437-2443). 80

Ascentis Si NP separace v tucích rozpustných vitamínů 1 4 1. alpha tocopherol (100 µg/ml) (E) 2. menadione (150 µg/ml) (K3) 3. gamma tocopherol (200 µg/ml) (E) 4. chlolecalciferol (100 µg/ml) (D) 2 3 0 2 4 6 8 10 12 Time (min) column: Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µ particles (581512-U) mobile phase: A Hexane, B Ethylacetate gradient: time %B 0 10 10 30 12 30 13 10 flow rate: 1.0 ml/min. temp.: 30 C det.: UV at 290 nm 81

Rychlé HPLC analýzy 82

Chromatografický trojúhelník 1 α 1 k' R S = N 4 α 1+ k' Účinnost Selektivita Retence Rychlost t r = L u (k +1) t r = retenčníčas L = délka kolony k = retentenční factor u = rychlost průtoku mobilní fáze Selektivita Účinnost 83

Rozlišení Účinnost R S = N 4 Retence k k +1.. Selectivita α-1 α Faktor účinnosti a) Rychlost toku MF b) Délka kolony c) Průměr zrna, teplota, viskozita Faktor kapacity a) Množství stacionární fáze v koloně b) Změna stacionární fáze nebo MF c) Teplota Faktor selektivity a) Změna stacionární fáze b) Změna MF c) Rychlost toku MF Rozlišení (R) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 α N 0.0 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20 1.25 0 5000 10000 15000 20000 25000 0 5 10 15 20 25 Zhao, J.H. and P.W. Carr. Analytical Chemistry, 1999. 71(14): p. 2623-2632 k α N k 84

Zkrácení doby analýzy t r = L u (k +1) tr = retenční čas L = délka kolony k = retentenční factor u = rychlost průtoku mobilní fáze Existují tři způsoby zkrácení retenčního času (t r ) daného analytu: Zkrácení délky kolony (L) Zmenšení hodnoty retenčního factoru (k ), a to: Změnou stacionární fáze Zvýšením teploty Zvýšení průtoku mobilní fáze 85

Možnosti zrychlení separací Zmenšit rozměry kolony Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze Zvýšit teplotu mobilní fáze Změnit profil gradientu Zmenšit velikostčástic HPLC nosiče 86

Vliv zkrácení kolony 2 1 3 4 5 2 6 3 4 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital Columns: Discovery C18, 5µm particles Mobile Phase: CH 3 OH:H 2 O (45:55) Flow Rate: 1mL/min Temp.: 20 C Det.: UV, 214nm 1 1 5 2 1 6 3 2 4 3 5 4 5 0 10 20 30 6 6 2cm x 4.6mm ID 0 10 20 30 5cm x 4.6mm ID 0 10 20 30 0 10 20 30 Time (min) 15cm x 4.6mm ID 25cm x 4.6mm ID 88 98-0348

Vliv zkrácení kolony 2 3 4 5 Columns: Discovery C18, 5µm Mobile Phase: CH 3 OH:H 2 O (45:55) Flow Rate: 1mL/min Temp.: 20 C Det.: UV, 214nm 6 1 1 2 3 4 5 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital 6 1.0 2.0 2cm x 4.6mm ID 0 10 20 30 Time (min) 25cm x 4.6mm ID 89

Vliv průtokové rychlosti 1 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital Columns: Discovery C18 column, 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: CH 3 OH:H 2 O (45:55) Flow Rate: see figure Temp.: 25 C Det.: UV, 214nm 2 3 1 2 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 4 4mL/min 5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 3mL/min 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Time (min) 2mL/min 1mL/min 91

Účinnost kolony při různých průtokových rychlostech (porézníčástice sorbentu) Flow Rate 1.0mL/min 2.0mL/min 3.0mL/min 4.0mL/min N (Barbital) 1766 1460 1250 997 N (Phenobarbital) 2556 1821 1461 1307 N (Butabarbital) 3169 2215 1766 1506 N (Mephobarbital) 3524 2383 1924 1569 N (Pentobarbital) 3829 2494 2029 1704 N (Secobarbital) 3947 2584 2113 1742 92 98-0357

Vliv teploty 1. Clonazepam 2. Chlorazepate 3. Diazepam 1 1 1 2 2 Column: Discovery RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: ACN:H 2 O (30:70) Flow Rate: 2.0mL/min Temp.: see figure Det.: UV, 254nm 3 3 1 2 3 1.0 2.0 2 3.0 4.0 5.0 6.0 20 C 3 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 30 C 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 40 C 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Time (min) 50 C 94 98-0359

Profil gradientu 1 3 4 4 Column: Discovery RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Flow Rate: 1mL/min Temp.: 30 C Det.: UV, 220nm Elution: 10:90 ACN, 0.1%TFA: H 2 O, 0.1%TFA gradient to 90:10 ACN, 0.1%TFA:H 2 O,0.1%TFA 2 1 1 1 2 3 3 4 5 4 1. 1-hydroxy-7-azabenzotriazole 2. 4-methoxybenzene sulfonamide 3. Methyl-3-amino-2-thiophene-carboxylate 4. 4-aminobenzophenone 2 3 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 20%/min gradient 16%/min gradient 2 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Time (min) 10%/min gradient 6.67%/min gradient 96 98-0361

Účinnost versus velikostčástic Columns: All C18, All 150 x 4.6mm Flow: 1.8mL/min Detection: 254nm Temp: 30 C Injection Vol: 5µL Analytes: 1. o-xylene (0.04mg/mL 2. p-xylene (0.01mg/mL N ave = 36,000 60 60 60 60 N ave = 18,000 40 40 N ave = 12,000 40 40 sub-2µm N ave = 6,000 3-4µm 5µm 20 10µm 20 20 20 0 2.0 3.0 0 2.0 3.0 0 2.0 3.0 0 2.0 3.0 99

Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace HETP (µm) 16,000 35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 Pressure (psi) 16,000 14,000 12,000 10,000 8,000 6,000 1-2 ml/min UHPLC 1.7 µm 10.00 4,000 3 µm 5.00 2,000 1 2 3 4 5 Mobile Phase Velocity (mm/sec) 2 4 6 8 10 12 Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 100

Povrchově porézníčástice versus zcela porézníčástice: 0.5 µ Difuzní vrstva 0.75 µ 2.7 µm 1.7 µm Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp. 101

Ascentis Express Fused-Core tm specifikace Sorbent: vysoce čistý silikagel 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B Velikost částic: 2.7 µ Distribuce velikosti částic: 2.7 +/- 0.16 µ (6% standardní odchylka*) Velikost pórů: 90 Å, 160 Å Velikost povrchu: 150 m²/g (220-300 m²/g efektivní) ph rozsah: 2 9 (minimálně) Limitní tlak: 600 barů (testováno na UHPLC) Nabídka stacionárních fází C18, peptide ES C18, C8, F5 (RP nebo HILIC), RP-Amide,Phenyl-Hexyl, HILIC (NP nebo HILIC), ES-CN LC-MS: vysoce kompatibilní * Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka. 102

Ascentis Express Fused-Core tm specifikace Ascentis Express Sterically Protected ph range endcapping Pore size Angstroms Particle size microns C18 No 2-9 Yes 90 2.7 C8 No 2-9 Yes 90 2.7 RP-Amide No 2-9 Yes 90 2.7 Phenyl-Hexyl HILIC No No 2-9 Live area for full-page graphic 2-8 Yes No 90 90 2.7 2.7 Peptide ES-C18 Yes 1-8 No 160 2.7 F5 No 2-8 Yes 90 2.7 ES-Cyano Yes 1-8 Yes 90 2.7 103

Předkolony malý mrtvý objem vhodné pro všechny přístroje kompatibilní s vysokým tlakem 104

Distribucečástic 105

Výhody silikagelových častic s pevným jádrem 106

Výhody silikagelovýchčástic s pevným jádrem 107

Zpětný tlak & účinnost a velikostčastic Effiiciency 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 N 1 d p bar 5,000 0 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 d p (µm) P 1 2 d p Particle (µm) 1.8 2.5 3 5 10 15 20 psi 5889 3089 2118 769 189 87 44 bar 406 213 146 53 13 6 3 N 27,500 20,000 16,500 10,000 5,000 3,750 2,500 108

Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace 16,000 35.00 16,000 14,000 1.7 µm HETP (µm) 30.00 25.00 20.00 15.00 Pressure (psi) 12,000 10,000 8,000 6,000 1-2 ml/min 2.7 µm FC 10.00 4,000 3 µm 5.00 2.7 µm Ascentis Express 2,000 1 2 3 4 5 Mobile Phase Velocity (mm/sec) 2 4 6 8 10 12 Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 109

Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech Zpětný tlak versus průtoková rychlost Maximální limit 450 400 Pressure drop (bar) 350 300 250 200 150 Limit tradičních HPLC systemů N = >30,000 35 60 80 100 50 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 Flow rate (ml/min) Experimentáln lní zavislost celkového zpětn tného tlaku jako funkce průtokov tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm, 2.7 m Ascentis Express kolony při různých teplotách ch.. MF: 30:70 voda:acetonitril Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina 110

Převod metod 111

Rychlejší, účinnější a levnější analýza *původní metoda je na koloně 4.6 x 250 mm, 5µ 4.6 x 50 mm, 2.7 µ 1 ml/min 2 µl inj N(5) = 10600 Rs = 1.8 6,9 MPa 8x úspora rozpouštědel Column: Ascentis Express C18 Mobile Phase: 64:36, water : acetonitrile Temp: 35 C Det: 250 nm 3 x 50 mm, 2.7 µ 0.43 ml/min 0.9 µl inj N(5) = 10000 Rs = 1.8 6,6 MPa 19x úspora rozpouštědel Sample 1. Oxazepam 2. Alprazolam 3. Clonazepam 4. N-desmethyldiazepam 5. Diazepam 2.1 x 50 mm, 2.7 µ 0.21 ml/min 0.4 µl inj N(5) = 8360 Rs = 1.6 6,5 MPa 38x úspora rozpouštědel 0 2 4 Time (min) 112

Vliv zkrácení a zmenšení průměru kolony na úsporu rozpouštědel Kolona µ ID (mm) L (mm) Rs Průtok (ml/min) Doba analýzy (min) ml/ nástřik Úspora Ascentis C18 5 4.6 250 3.3 1 33 33 1x Ascentis Express C18 2.7 4.6 75 3.0 1 6.2 6.2 5x Ascentis Express C18 2.7 3 75 2.5 0.43 6.2 2.7 12x Ascentis Express C18 2.7 2.1 75 2.5 0.21 6.2 1.3 25x Ascentis Express C18 2.7 4.6 50 1.8 1 4.1 4.1 8x Ascentis Express C18 2.7 3 50 1.8 0.43 4.1 1.8 19x Ascentis Express C18 2.7 2.1 50 1.6 0.21 4.1 0.9 38x 113

Ascentis Express Fused Core HPLC kolony s vysokou účinnosti a možnosti rychlé chromatografie jak na běžných systémech tak na systémech UHPLC. Krátká difúzní dráha analytu v povrchově porézníchčásticích - užší a vyšší píky než lze dosáhnout na porézníchčásticích větší citlivost, vyšší účinnost. Tvar Deemterovy křivky ukazuje na možnosti měření při vyšších průtokových rychlostech s vysokou účinností. Zpětný tlak na kolonách s povrchově porézním sorbentem je nižší něž na kolonách s poréznímičasticemi sub-2µ odpovídá přibližně 3 µ sorbentům. 114

USP aplikace column: as listed mobile phase: * Phosphate buffer flow rate: 1.5 ml/min temp.: 30 C det.: UV at 215 nm H 3 C NH phase injection: 5 µl sample: 50 µg/ml in mobile CH 3 CH 3 O H 3 C OH *Phosphate buffer Combine 500 ml of potassium phosphate monobasic 500 mg/l in water and 500 ml of acetonitrile Adjust to ph 3.3 with phosphoric acid H 3 C Ibuprofen OH Pseudoephedrine 115

Ibuprofen /Pseudoefedrin Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm 1.0 2.0 3.0 Time (min) 1.0 2.0 3.0 Time (min) phase length void rt (pseu) rt (ibu) resolution plates (ibu) k (ibu) plates/m (ibu) Ascentis Express ES-Cyano 10 0.64 0.56 1.87 28.3 22479 1.9 224790 Discovery Cyano 25 2.15 2.27 3.05 6.1 13066 0.4 52264 Ascentis Express C18 10 0.55 0.54 3.57 41.4 21281 5.5 212810 Ascentis ES-Cyano 10 0.65 0.85 3.11 25.4 10460 3.8 104600 Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm 1.0 2.0 3.0 Time (min) 1.0 2.0 3.0 Time (min) 116

USP aplikace column: as listed mobile phase: 30:40:30, 20 mm sodium acetate (ph 4):methanol:acetonitrile flow rate: 1.5 ml/min temp.: 30 C det.: UV at 210 nm injection: 5 µl sample: 50 µg/ml in mobile phase H 3 C H N O O OH NH CH 3 Ritalin Methylphenidate OH Phenylephrine 117

Ritalin /Fenylefrin phase length void rt (phen) rt (ritalin) resolution plates (ritalin) k (ritalin) plates/m (ritalin) Ascentis Express ES-Cyano 10 0.64 0.77 0.92 5.62 15981 0.4 159810 Discovery Cyano 25 2.15 2.49 2.64 2.05 19007 0.2 76028 Ascentis Express C18 10 0.55 0.55 0.63 3.08 9038 0.1 90380 Ascentis ES-Cyano 10 0.65 1.13 1.46 6.08 9096 1.3 90960 Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm 1.0 2.0 3.0 Time (min) 1.0 2.0 3.0 Time (min) Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm 1.0 2.0 3.0 Time (min) 1.0 2.0 3.0 Time (min) 118

Problém s nečistotami v mobilní fázi Nečistoty, které na HPLC nejsou detegovatelné mohou být problém na UHPLC 119

LC-MS Ultra CHROMASOLV Rozpouštěla a aditiva do MF Brand Product Name Description Pack size Fluka 14261 Acetonitrile LC-MS Ultra CHROMASOLV, 99.9%, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka 14262 Methanol LC-MS Ultra CHROMASOLV, 99.9%, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka 14263 Water LC-MS Ultra CHROMASOLV, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka 14264 Trifluoroacetic acid LC-MS Ultra eluent additive, 99.0% suitable for UHPLC-MS 1ML, 2ML Fluka 14265 Formic acid LC-MS Ultra eluent additive, 98% suitable for UHPLC-MS 1ML, 2ML Fluka 14266 Ammonium formate LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS 25G Fluka 14267 Ammonium acetate LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS 25G 120

LC-MS Ultra CHROMASOLV Rozpouštědla se testují na UHPLC Gradient UHPLC-UV, shodné vlastnosti mezi výrobními šaržemi Nízké pozadí a minimum nečistot jako jsou ftaláty a PEG. Testováno na UHPLC-MS TOF Testování v obou polaritách Obaly Bílé borosilikátové sklo Minimální výluh alkalických iontů 121

Identifikace nečistot v ESI + Intens. x104 1.2 LCMS Ultra UVMSpos_RD1_07_3218.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd 1.0 0.8 0.6 New LC-MS ultra grade 0.4 0.2 0.0 Intens. x104 Gradient Grade BASF pos_rd1_03_3255.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 High quality gradient grade 0.2 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Time [min] Nežádoucí nečistoty v rozpouštědlech (plastifikátory, PEGy). 122

LC-MS Ultra CHROMASOLV ESI + ESI - MS test v ESI + a ESI - ; 5ppb reserpinu a 20 ppb digoxinu; velmi nízký šum. 123

Borosilikátové skleněné láhve Intens. 800 LCMS Ultra UVMSneg_RD1_01_3235.d: -MS, 3.0-9.1min #(270-809), -Constant Bkgrnd 600 400 LC MS Ultra (v borosilikátové láhvi) 200 197.9713 325.1941 451.3073 648.9335 698.9277 532.9422 792.9043 847.8578 909.8569 1014.8415 0 800 Chrom Gradient Grade UVMSneg_RD1_04_3232.d: -MS, 3.0-9.0min #(270-807), -Constant Bkgrnd 600 400 219.9947 248.9723 Klastry mravenčanu sodného Gradient grade quality (v hnědé skleněné láhvi) 200 325.2004 355.9741 384.9540 520.9360 648.9327 698.9393 858.8914 906.8939 983.8583 1035.8551 0 200 400 600 800 1000 1200 m/z 124

C18 C8 HILIC (Si) RP-Amide Phenyl-Hexyl Peptide ES C18 F5 ES-CN Děkuji za pozornost 125