ANALYTICKÉ METODY STOPOVÉ ANALÝZY Požadavky na analytické metody: - robustnost (spolehlivost) - citlivost - selektivita stanovení - možnost automatizace Klasická chemická roztoková analýza většinou nevyhovuje - metody instrumentální Anorganická analýza 1. prvky (většinou kovové) AAS: plamenová, s elektrotermickou ionizací v grafitové kyvetě, metoda studených par - Hg, hydridová metoda AES: atomová emisní spektroskopie s indukčně spřaženým plazmatem (ICP) atomová fluorescenční spektroskopie hmotnostní spektroskopie s ICP nebo laserem polarografie, voltametrické metody iontvě selektivní elektrody UV-VIS elektronová mikrosonda RTG analýza 2. ionty (většinou anionty, ale i kationty) UV-VIS spektroskopie polarografie, voltametrické metody HPLC - iontová chromatografie, chromatografie iontových párů FIA -průtoková analýza Požadavky na vybavení laboratoře: snadná omyvatelnst, dobře fungující klimatizace a prachové filtry (prach: 10% Ca, 5 % Si, 3 %Fe, 1.5 %Al, Na, atd.)
uzavřené přetlakové boxy. Omývání roztokem EDTA a destilovanou vodou. Nádobí: sklo, křemen, Teflon (nejlepší), nutnost minimální sorpce na stěny nádobí. Vyluhování nádobí minerálními kyselinami. Nepoužívat poleptané nádobí - sorpce látek, nepoužívat tuky na zábrusy. Koncentrační techniky: převedení na těkavou sloučeninu (SiF 4, GeCl 4 ), extrakce, iontová výměna, elektrolytické vyloučení na rtuťové elektrodě. Organická analýza - spektrální a chromatografické metody a jejich kombinace MS - hmotnostní spektrometrie FTIR spektrometrie UV-VIS spektrometrie fluorescenční spektrometrie GC - plynová chromatografie HPLC - kapalinová chromatografie GC-MS, GC-FTIR, GC-AES HPLC-MS, HPLC-FTIR TLC, HPTLC HPCZE elektrochemické metody radioimunoanalýza enzymatické metody FIA - průtoková analýza Přehled koncentračních rozsahů běžně používaných metod 100 pg/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml 1µg/ml <---------------------------------hmotnostní spektroskopie-------------------------> <------------------spektroskopie UV, fluorimetrie-----------> <------------------------------------GC/ECD---------------------------------------------> <--------------GC/FID----------------------> <----------------DPP------------------------> <-------------RIA-------------------------->
Spektrální metody - stanovení kovových prvků 1. laserová AES ~ 10-10 - 10-8 g 2. ICP-AES ~ 10-1 - 10 3 µg/l 3. plazmová AFS ~ 10 0-10 3 µg/l 4. plamenová AAS ~ 10 0-10 3 µg/l měření pevných vzorků (LAES) měření v roztocích - AAS - jeden prvek AES, AFS - současně více prvků Předběžné úpravy vzorků s obsahem <ppb - obohacení extrakcí nebo sorpcí na katexech Optimalizace citlivosti (meze detekce) - volba spektrální čáry, prodloužení doby integrace signálu, optimalizace průtoku plynu (excitační teploty plazmatu) a příkonu ve vf cívce (5000-10000 K, cca 2.5 kw - Ar/Ar plazma; cca 15 kw Ar/N 2 plazma) U prvků s nízkou excitační energií - čáry iontové citlivější než atomové - Hg, As, Se - tvorba hydridů při "flow injection analýze" s AAS metodou studených par AAS s grafit. kyvetou citlivější než plamenová AAS 5. hmotnostní spektrometrie kovových iontů - jiskrová (tuhé vzorky) ICP (roztoky) 6. extrakční spektrofotometrie Tvorba barevného komplexu kovu s činidlem. extrakce do org. rozpouštědla, měření absorbance ve VIS oblasti např. Cu - dithizon extr. činidla amylalkohol Ni - dimethylgyloxim chloroform P, As, Si - molybdenová modř ethylacetát 7. fotometrická mikrotitrace - pro obsahy cca 1-10 ppm
- stanovení organických látek 1. UV-VIS spektrometrie, případně spojení s FIA většinou málo selektivní - screening nebo po separaci HPLC, TLC neabsorbující látky - derivatizace - zavedení chromoforu do molekuly (většinou aromatické jádro s NO 2 skupinou) Stanovení v ng; omezené využití pro identifikaci a strukturní analýzu 2. IČ spektrometrie specifická, pro stopovou analýzu vyhovuje citlivost FTIR přístrojů v ng - 10 2-10 3, citlivější než scanovací IČ spektrometry citlivé pyroelektrické detektory (monokrystaly síranu triglycinu, tellurid Cd- Hg) počítačové zpracování dat - rychlé měření - časové průměrování a akumulace spekter, vyhlazování spekter, jejich adice nebo substrakce, diferenční spektrometrie mikrovzorky - tabletky s KBr o průměru 1 mm, reflexní technika - odpaření kapky vzorku na zrcátku o průměru 2 mm zlepšení rozlišení: FTIR, teplota kapalného N 2, matricové izolační spektrum - v cca 10% přebytku zřeďující látky (kaplný N 2 ) - ostrá spektra kombinace GC-FTIR, LC-FTIR stanovení ne příliš specifické - identifikace, strukturní analýza - zvýšení citlivosti obohacením vzorků 3. laserová Ramanova spektrometrie i vodné roztoky, malé vzorky - mikrometody - soustředění paprsku v mikrosondě na plochu o průměru 1 µm nebo v mikrocele pro chromatografii 4. fluorimetrie, fluorescenční spektrometrie přirozená fluorescenec (PAH, aflatoxiny, apod.) derivatizace - zavedení fluoroforu do molekuly - aminokyseliny, aminy, fenoly - citlivější než UV/VIS o více jak 2 řády, meze detekce - ng, pg selektivní optimalizace citlivosti a mezí detekce - λ ex, λ em, rozpouštedlo, ph, odstranění látek zhášejících fluorescenci (kyslík,...), ni žší teplota kombinace s TLC - chromatografie na vrstvě adsorbentu s fluoresceinem (indikátorem) (temné skvrny pod UV světlem) nebo po extrakci z adsorbentu
kombinace s HPLC v průtokovém systému - na kapilárních kolonách - cela o objemu v nl, laserem indukovaná fluorescence anorganická analýza - důkazy a stanovení iontů po reakci s organickými činidly - morin, 8-chinolin, rhodamin B, azobarviva, deriváty salicylaldehydu důkazy - pozorování fluorescence ve viditelném nebo UV světle 10-8 - 10-12 g stanovení - fluorimetry odměrná analýza s fluorescenčními neutralizačními indikátory a oxidačněredukčními indikátory (rhodamin B) zhášení fluorescence nadbytkem oxidovadla, adsorpční jevy (argentometrie - adsorpce na povrchu sraženiny - změna zbarvení či zhášení v přítomnosti Ag + či X - iontů (fluorescein, chinin, rhodamin GG,...) - metalofluorochromní indikátory Chemiluminiscence fluorescence při chemických reakcích - např. luminol (hydrazid 3- aminonaftalenové kyseliny + H 2 O 2 - až 10-9 g/l kovů - oxidační katalyzátory (Ag +, Cu 2+, Fe 3+, Cr 3+, Co 2+, Bi 3+ Bioluminiscence např. 10-12 - 10-13 M ATP v biologických vzorcích + luciferin + luciferasa + Mg 2+ + O 2 - oxidace (562 nm)
Detekční systémy v chromatografii Zaznamenávání rozdílu signálu při průchodu čisté mobilní fáze (eluátu) a mobilní fáze obsahující separovanou složku. Klasifikace detektorů - integrální diferenciální - destruktivní nedestruktivní - koncentrační odezva hmotnostní odezva dc/dv dm/dv změna hmotnostní koncentrace látky v eluátu změna rychlosti přívodu detegované látky do detektoru Koncentrační detektory - citlivost S c A.F m m h.x.f m m Hmotnostní detektory - citlivost S - odezva detektoru A - plocha h - výška x - šířka píku v polovině F m - průtok mobilní fáze m - hmotnost látky S m A m h.x m
Rozdělení podle selektivity - univerzální - odezva pro všechny typy zkoumaných látek refraktometr, hmotnostní detektor, detektor rozptylu světla - selektivní - pro určité třídy látek - UV detektor, ECD - specifické - pro úzce ohraničenou skupinu látek - fluorescenční det. Odezva detektoru Charakterizace: - stabilita nulové linie - její časový a tepelný drift - kolísání okolo střední hodnoty - šum vf šum, nf šum, charakterizace detektoru poměrem s/š (S/N) - lineární dynamický rozsah - rozmezí koncentrací, kde platí S a.c r logs loga r.logc r 0.98 1.02 - mimokolonové příspěvky - rozšiřování elučních zón. Co nejmenší objem měřících cel krátká optická dráha - nutnost kompromisů - citlivost detektoru - množství látky vyvolávající určitou velikost signálu - minimální detegovatelné množství - množství látky, které je možno ještě detegovat při určitém poměru S/N (nejčastěji S/N = 2 nebo 3). Zahrnuje v sobě i vlastnosti separačního systému - reprodukovatelnost odezvy - směrodatná odchylka odezvy detektoru na určitou, stále stejnou koncentraci látky při opakovaném měření
Detektory pro plynovou chromatografii teplotně vodivostní TCD - 5-100 ng, ochlazování žhaveného vlákna průchodem plynu. K. plam. ionizační FID - 10-100 pg, spalování org. látky, změna vodivosti plamene. H. alkalický ionizační AFID - 1-10 pg, pro S, N, P, korálek se solí alkalického kovu - podpoření ionizace. H. fotoionizační PID - 10-100 pg, ionizace UV zářením, nastavení ionizační energie pro určitý typ látek. H. termoionizační TID - 1-10 pg, jako AFID, místo plamene vyhřívaná hrudka soli Rb, Cs, vys. odezva pro N, P. H. elektron. záchytu ECD - 0.1-10 pg, zdroj β-záření, ionizace nosného plynu(ar) - ionizace stanovovaných molekul, odezva pro halogeny. H. heliový HECD - 0.1-10 pg, obdobný jako ECD hmotnostní MS - 10-100 pg, hmotnostní spektrometr jako detektor, nastavení univerzální specifické. H. infračervený FTIR - 1-10 ng, Fourierova transformace. K. plamenově fot. FPD - 10-100 pg, sleduje se chemiluminiscence, pro N, S, P. H. atomový emisní AED - 10-100 pg, indučně spřažené plazma - atomizace + excitace do vyšších hladin - sledování záření pro určité prvky. H. elektrolytický - 1-10 pg, spalování látek v plynné fázi, absorpce spalin do vody, měření vodivosti. Odezva S, N, X. K. term. energie TEA - 10-100 pg, sleduje se chemiluminiscence nitrosylderivátu s ozonem, pro nitrosaminy. H.
Detektory pro HPLC 1. fotometrické nejběžnější UV a VIS oblast stálá nebo proměnná vlnová délka, diode array meze detekce cca 0.1-10 ppm. K. 2. fluorimetrické UV a VIS oblast Hg výbojka + filtry, deuteriová lampa nebo xenonová výbojka + monochromátor, na emisní straně filtr nebo monochromátor vysoká selektivita, zvýšení citlivosti pulsním uspořádáním mez detekce 1-100 ppb. K. 3. elektrochemické amperometrické, coulometrické, vodivostní tuhé elektrody - zanáší se, obtížná reprodukovatelnost různé uspořádání elektrod - koncentrické, wall-jet, rtuťová elektroda - obnovitelný povrch detekce oxidovatelných nebo redukovatelných látek mez detekce 1-100 ppb. K.