Ing. Václav Krejzar, Ph.D Ing. Iveta Pánková, Ph.D. Ing. Radka Krejzarová prof. Ing. Václav Kůdela, DrSc. Zefektivnění postupu při stanovení přítomnosti karanténního organismu, bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ve vzorcích sadbových brambor METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
2 Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem projektu č. 0002700603. Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu. O uplatnění metodiky byla 26.11.2007 uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-42-3
3 Autoři: Ing. Václav Krejzar, Ph.D, Ing. Iveta Pánková, Ing. Radka Krejzarová, prof. Ing. Václav Kůdela, DrSc. Název: Zefektivnění postupu při stanovení přítomnosti karanténního organismu, bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ve vzorcích sadbových brambor Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně Redakce: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 10 CD Vyšlo v roce 2007 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: krejzar@vurv.cz Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-42-3
4 Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
5 Václav Krejzar a kol. Zefektivnění postupu při stanovení přítomnosti karanténního organismu, bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ve vzorcích sadbových brambor METODIKA PRO STÁTNÍ ROSTLINOLÉKAŘSKOU SPRÁVU Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
6 Zefektivnění postupu při stanovení přítomnosti karanténního organismu, bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ve vzorcích sadbových brambor Abstrakt V souladu s metodikou EU se od roku 1995 provádí v ČR pravidelné testování všech sadbových a vybraných nesadbových vzorků brambor na přítomnost karanténního organismu, bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Uplatňováním požadavku nulové tolerance patogena ve vzorcích sadbových brambor i dalších karanténních opatření, se v České republice podařilo v průběhu více než deseti let snížit četnost pozitivních vzorků u sadbových i nesadbových brambor. Poklesl i počet zamořených katastrů. Původce bakteriální kroužkovitosti se však nepodařilo eradikovat. S výjimkou jednoho roku je patogen v posledních letech ve vzorcích sadbových brambor opakovaně detekován. V navrhované metodice se předkládají návrhy, jejichž uplatněním lze zvýšit pravděpodobnost detekce původce bakteriální kroužkovitosti v partiích sadbových brambor. Navržené úpravy se týkají změn v termínu odběru vzorků pro testování, v počtu hlíz ve vzorku a v uchovávání vzorků před vlastními rozbory po určitou dobu při vyšších teplotách. Předložené úpravy mohou být cíleně využity především v podnicích s opakovaným výskytem Cms. Podniky je mohou uplatnit i z vlastního popudu s cílem snížit riziko použití sadby, která by poskytla produkci, u níž by se prokázala přítomnost Cms a podnik se musel podrobit veškerým omezením vyplývajícím z povinností uvalených na podnik s potvrzeným výskytem Cms. Doporučované změny nejsou v protikladu s oficiální metodikou EU. Navržený postup k zefektivnění postupu pří detekci původce kroužkovitosti bramboru je výsledkem řešení výzkumného záměru MZe č.0002700603 Klíčová slova: sadba brambor; bakteriální kroužkovitost bramboru; karanténní opatření; detekce patogena
7 I. Úvod do problematiky Na rostlinách bramboru obecného (Solanum tuberosum L.) se vyskytují tři prokaryotické organismy, které podléhají regulaci podle zákona č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů. V souladu s 7 výše uvedeného zákona a návazného prováděcího právního předpisu, vyhlášky č. 330/2004 Sb. a přílohy 1 k této vyhlášce (Anonym 2004b), patří v ČR (a ve všech státech EU) k regulovaným karanténním škodlivým organismům tato prokaryota: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., původce bakteriální kroužkovitosti bramboru; Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.(= Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, původce hnědé hniloby bramboru; Potato stolbur phytoplasma, původce stolburu bramboru. Největší význam se přikládá původci bakteriální kroužkovitosti, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (dále jen Cms). A. Současná legislativa EU Směrnicí Rady 93/85/EEC (ANOMYNOUS 1993) a její novelizací (ANONYMOUS 2006) jsou stanovena opatření, která mají členské státy přijmout proti Cms s cílem: (i) lokalizovat patogena a vymezit rozsah jeho geografického rozšíření; (ii) předcházet jeho výskytu a rozšíření; (iii) při zjištění výskytu zabránit jeho šíření, mít patogena pod kontrolou a eradikovat jej. Přílohy k uvedené směrnici se zabývají jednak specifickými regulačními opatřeními proti Cms, jednak legalizovanými metodami k detekci Cms. 1. Regulační opatření Podle Směrnice Rady 93/85/EEC je nutno každoročně zjišťovat přítomnost Cms v hlízách a rostlinách bramboru. Zjistí-li se infekce hlíz nebo rostlin, stanoví se možné zdroje nákazy a zjistí se rozsah rozšíření patogena. Při podezření z výskytu Cms následuje: zákaz přesunu zboží (zásilky, partie), z něhož byly odebrány vzorky, dokud nejsou známy výsledky rozboru; pátrání po původu každé podezřelé zásilky; stanovení rozsahu kontaminace jako důsledku klonálních vztahů, kontaktu s podezřelou partií před a po sklizni nebo během produkce. Je-li přítomnost Cms v bramborách z určitých produkčních míst potvrzena, následují tato opatření: postižené porosty a pozemky, jakož i s nimi spjatá mechanizace, zařízení apod. jsou označeny jako kontaminované; partie brambor a s nimi spjatá mechanizace a zařízení apod., o nichž je známo, že jsou kontaminované, se podrobí úředně dozorovanému zacházení, čištění a dezinfekci; na produkčních místech, která jsou označena jako kontaminovaná, se zavede specifický kontrolní režim; okolo produkčních provozoven se vyznačí zóny, založené na identifikaci kontaminovaných položek a/nebo plochy či pozemku. Následuje stanovení pravděpodobného rozsahu kontaminace a specifických opatření, která se musí provádět okamžitě a nejméně 3 roky po vyznačení zóny. sadbové brambory musí splňovat požadavky nulové tolerance Cms;
8 je-li výskyt Cms potvrzen v sadbových bramborách, všechny klonálně příbuzné musí být testovány na latentní přítomnost patogena. Omezení při obdělávání kontaminovaných pozemků po dobu tří (čtyř) let: pěstitelé musí odstraňovat plevelné brambory; nesmí se vysazovat brambory; na pozemku nebo produkční jednotce se nejméně po dva následné roky před výsadbou prvních brambor nesmí vyskytnout plevelné brambory. Například: jestliže byl pozemek nebo produkční jednotka v roce 2 bez plevelných brambor, pak zde mohou být brambory nejdříve vysazovány v pátém roce, a to za předpokladu, že ve třetím a čtvrtém roce nebyly nalezeny žádné plevelné brambory; když se po uplynutí karantény mají na pozemek opět vysázet brambory (= první rok pěstování), mohou být k sázení použity pouze úředně uznané sadbové brambory. Uskutečnit se musí rovněž úřední prohlídka, která bude zahrnovat laboratorní testování sklizených hlíz; při nejbližším pěstování brambor musí být vysázeny buď oficiálně uznané sadbové brambory, případně sadba konzumních nebo průmyslových brambor. Další omezení v podnicích s kontaminovanými pozemky na nekontaminovaných polích: v prvním roce po potvrzení výskytu Cms se nesmí vysazovat brambory, ale musí se uplatňovat opatření k odstranění plevelných brambor. Alternativně je možné vysazovat úředně testované sadbové brambory, ale pouze konzumní, za předpokladu, že se vyloučí riziko plynoucí z výskytu plevelných brambor. Pěstované plodiny podléhají inspekci a každá plevelná rostlina musí být testována na přítomnost Cms. Uskutečnit se musí úřední prohlídka, která bude zahrnovat laboratorní testování sklizených hlíz; v druhém a třetím roce po potvrzení výskytu se uplatňují obdobná opatření jako v prvním roce, s tím rozdílem, že se může vysazovat úředně testovaná sadba nejen pro konzumní, ale i sadbové účely. 2. Detekce a identifikace Ve státech EU je současný postup při detekci a identifikaci Cms stanoven Směrnicí Rady 93/85/EEC (ANOMYNOUS 1993), přesněji řečeno její novelizací (ANONYMOUS 2006). Postup při testování má zabezpečit detekci latentních infekcí způsobovaných Cms. Přítomnost patogena se považuje za prokázanou, jinými slovy, výsledek je považován za pozitivní, pokud je získán z nejméně dvou screeningových testů založených na odlišných biologických principech a je doplněn izolací, získáním čisté kultury a identifikací této čisté kultury jako Cms. Původní směrnice z roku 1993 (ANONYMOUS 1993) byla v roce 2006 novelizována (ANONYMOUS 2006). Cílem novelizace bylo zajistit optimalizaci citlivosti a specifičnosti detekce patogena a přitom postup neučinit příliš složitým, aby se mohl používat ve všech rostlinolékařských laboratořích v EU a bylo možno dosáhnout stejného výsledku (VAN DER WOLF 2005). Screeningové testy a techniky izolace umožňují detekci prahové koncentrace 10 3 až 10 4 buněk/ml resuspendovaného peletu. Novelizovaný postup detekce a identifikace Cms zavádí povinně kromě IF-testu (imunofluorescenčního testu) ještě druhý rychlý screeningový test, a to FISH- test (fluorescent in situ hybridization) nebo PCR (polymerázovou řetězovou reakci). Předností obou nově zaváděných testů je, že mohou poskytnout výsledky během 24-48 hodin. FISH test využívá oligonukleotidové sondy proti 16S nebo 23S ribozomální RNA/DNA. Tyto sondy mohou být použity pro hybridizaci in situ, neboť jsou schopné difundovat přes buněčnou
9 stěnu mikroorganismů (JANSE 2005). Zavedením FISH a PCR se zvyšuje spolehlivost screeningových testů. B. Výskyt původce bakteriální kroužkovitosti v ČR a výsledky úsilí o jeho eradikaci Výskyt Cms byl v ČR oficiálně potvrzen v roce 1995. Od té doby se stal předmětem soustředěného zájmu pěstitelů brambor, dovozců a vývozců, šlechtitelů brambor a správních orgánů odpovědných za karanténní opatření a uznávání množitelských porostů bramboru. Avšak pěstitelé brambor a fytopatologové v českých zemích se o bakteriální kroužkovitost zajímali již od začátku 20. století (KŮDELA 2007). V reakci na oficiální potvrzení výskytu Cms na území ČR v roce 1995 vyhlásilo MZe eradikační program, jehož cílem bylo do roku 2000 opět nabýt status nezamořeného území. Cíle však nebylo dosaženo. Relativně malý počet nálezů Cms ve vzorcích sadbových brambor zjištěný v roce 1995 (celkem 12) a 1996 (celkem 4) se později ukázal být jen pomyslným vrcholem ledovce signalizujícím existenci latentních infekcí u většího počtu partií brambor pocházejících z různých lokalit v ČR. S postupně se zvyšujícím počtem analyzovaných vzorků hlíz bramboru, a to z necelých 400 vzorků v roce 1995 až na přibližně 7500 vzorků v letech 2000-2002, narůstal i počet pozitivních zjištění Cms. Do roku 2000 byl patogen zjištěn v 289 katastrech v 50 okresech. Stoupal počet podniků a pěstitelů s výskytem patogena, a to z 22 podniků v roce 1996 na 195 podniků v roce 2000. U nemalého počtu podniků byly zaznamenány opakované výskyty Cms po dva až čtyři roky za sebou. Tyto údaje svědčily o nedostatečné účinnosti přijatých eradikačních opatření a (nebo) o nedůslednosti při jejich provádění. Přínosem eradikačních opatření bylo, že se díky patřičné finanční podpoře vybudovala ve Státní rostlinolékařské správě přístrojově i personálně dobře vybavená pracoviště způsobilá každoročně zabezpečovat laboratorní testování vzorků na přítomnost Cms ze všech partií tuzemských a dovážených sadbových brambor a také části partií nesadbových brambor. Účinnost vložených finančních a materiálových prostředků i vynaloženého úsilí lze doložit údaji z let 1998-2006 o poklesu počtu vzorků s prokázaným výskytem Cms. Celkem se testovalo ročně 3200 až 3850 vzorků sadbových brambor. V roce 1998 byla u sadbových brambor četnost pozitivních vzorků na úrovni 1,14 %, v roce 2005 klesla na 0,00 %, ale v následujícím roce 2006 opět mírně stoupla, a to na 0,15 %. Obdobně klesla i četnost pozitivů u vzorků nesadbových brambor, a to přesto, že relativní četnost pozitivů ke konci 90. let byla relativně vysoká (okolo 7-8 %). Z výsledků testování vzorků sadbových brambor je patrné: (i) nulový výskyt pozitivních vzorků v některém roce neznamená, že v žádném z partií sadbových brambor se patogen nevyskytuje; (ii) negativní výsledek testů v určitém roce pouze naznačuje, že při použití stanoveného způsobu inspekce porostů, odběru vzorků a současných detekčních a identifikačních postupů nebyla přítomnost patogena prokázána. II. Vymezení problému Karanténní škodlivý organismus nebo virus je definován jako škůdce, který je potenciálně důležitý pro národní hospodářství země, ale dosud se v ní nevyskytuje nebo je v ní přítomen, avšak není účinně regulován (Anonymous 1992). Politika karantény patří k jedné z nejproblematičtějších v zemědělském sektoru. Předmětem pochybností je na jedné straně
10 problematičnost účinnosti karanténních opatření při současné intenzivní mezinárodní výměně rostlinných produktů, na druhé straně podezření, že karanténní předpisy jsou zneužívány k vytvoření záměrné odborné překážky na ochranu domácího trhu před dovozem cizí produkce. V reakci na kritiku politiky karantény byla vytvořena koncepce analýzy rizika škůdce (pest risk assessment PRA). Podstata analýzy spočívá v hledání odpovědí na tyto otázky (Anonymous 1996): (i) Je škůdce na daném území přítomen? (ii) Je jeho rozšíření lokalizováno? (iii) Podléhá již úřední regulaci? (iv) Má ekonomický význam? Pomineme pochybnosti o ekonomickém významu Cms v podmínkách ČR (KŮDELA 2007). Soustředíme se na možnost zefektivnění postupu při stanovení přítomnosti Cms vzorcích sadbových brambor při respektování oficiální metodiky EU. III. Návrh na zefektivnění postupu při stanovení přítomnosti původce kroužkovitosti v partiích sadbových brambor a jeho zdůvodnění A. Premisy Návrh vychází z těchto předpokladů: Základní (nepodmíněné) jsou náklady na laboratorní testování jednoho vzorku brambor. Závislé (podmíněné) jsou náklady na mimořádná rostlinolékařská opatření nařízená a prováděná při potvrzeném výskytu Cms. Standardizovaný postup laboratorních diagnostických testů uplatňovaný v zemích EU (viz ANONYMOUS 2006) umožňuje zachytit koncentraci 10 4 až 10 5 a více v 1 ml homogenátu rostlinného pletiva. Vzorky hlíz s nižší koncentrací buněk Cms v jednotce objemu homogenátu než je uvedený limit detekce, mohou být vyhodnoceny jako prosté patogena. Metodika EU (viz Anonymous 2006) nestanoví termín, kdy se mají vzorky pro testování odebírat a testovat a v jakých podmínkách se mají vzorky před analýzami nacházet. Efektivnost opatření proti Cms v celostátním měřítku se v dlouhodobém výhledu zvýší, když se podaří minimalizovat podíl vzorků sadbových brambor s koncentrací Cms, která se pohybuje na hranici detekovatelnosti (viz I A2). Ve vzorcích brambor, u nichž se koncentrace Cms pohybuje na hranicích detekovatelnosti lze zvýšit pravděpodobnost detekce změnami, které se týkají: termínu odběru vzorků pro testování; počtu hlíz ve vzorku; uchovávání vzorků po určitou dobu při vyšších teplotách. Navržené úpravy mohou být nařízeny a využity cíleně v podnicích s opakovaným výskytem Cms. Podniky je mohou uplatnit z vlastního popudu s cílem snížit riziko použití sadby, která by poskytla produkci, u níž by se prokázala přítomnost Cms a podnik se musel podrobit veškerým omezením vyplývajícím z povinností uvalených na podnik s potvrzeným výskytem Cms. V konkrétních případech bude moci být využitelnost některého z předložených návrhů posouzena na základě porovnání zvýšených nákladů na rozbory s úsporami výdajů na mimořádná rostlinolékařská opatření, které by bylo nutno v následném roce vynaložit poté, co by se u sklizené partie brambor zjistila přítomnost Cms.
11 B. Vlastní návrh Variantní návrhy 1. Pokud se bude v ČR pokračovat v zavedené praxi odběru vzorku hlíz k analýzám na přítomnost Cms v hlízách přímo na poli, oddálit vlastní odběr hlíz na dobu těsně před sklizní. 2. Místo standardního počtu 200 hlíz bramboru v jednom vzorku jednorázově odebrat a analyzovat 400 hlíz. 3. Místo jednorázové analýzy vzorků o 200 hlízách, analyzovat 2 x 100 nebo 4 x 50 hlíz. 4. Pět až deset týdnů před vlastním odběrem pletiv z hlíz bramboru k analýze udržovat hlízy při teplotě 22 C. 5. V návaznosti na jednorázové analýzy vzorků, které byly odebrány před sklizní a neprokázaly přítomnost Cms, opakovat laboratorní rozbory vzorku odebraného ze sklizených hlíz v odstupu několika týdnů po sklizni. Zdůvodnění Předčasným odběrem hlíz se přeruší u infikovaných trsů přesun bakterií do dceřiných hlíz Pravděpodobnost detekce Cms se zvýší až o 14 %, a to zejména u vzorků s menší četností infikovaných hlíz. U vzorků s menší četností infikovaných hlíz se pravděpodobnost detekce Cms zvýší. Příklad: je-li mezi 200 hlízami jedna infikovaná, bude snadněji detekovatelná, když se bude nacházet mezi 100 nebo 50 zdravými hlízami než mezi 200 hlízami. Uchovávání hlíz při teplotě okolo 22 C podporuje pomnožení Cms v pletivech bramboru a zvyšuje pravděpodobnost detekce původně podprahových koncentrací patogena Viz bod 2. E. Závěr Aplikací předložených návrhů lze zvýšit pravděpodobnost detekce původce bakteriální kroužkovitosti, karanténní bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, v partiích sadbových brambor. Navržené úpravy se týkají změn v termínu odběru vzorků pro testování, v počtu hlíz ve vzorku a v uchovávání vzorků před vlastními rozbory po určitou dobu při vyšších teplotách. Uplatněním těchto návrhů se v dlouhodobém výhledu zvýší efektivnost opatření proti Cms. Navrženými úpravami se sníží počet vzorků sadbových brambor, ve kterých se koncentrace Cms pohybuje na hranici detekovatelnosti. Omezí se tím počet případů, kdy se za prosté nákazy označí partie sadby, které následně poskytnou sklizeň, u níž se prokáže přítomnost patogena. Literatura ANONYM (2004a): Zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů. ANONYM (2004b): Vyhláška č. 330/2004 Sb., o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů. ANONYMOUS (1992): International Plant Protection Convention (1992). FAO, Rome.
ANONYMOUS (1993): Council Directive 9S/85/EEC on the control of potato ring rot. ANONYMOUS (1996): International Standards for Phytosanitary Measures (1996). Part 1 Import regulations. Guidelines for pest risk analysis. Publication No. 2. FAO, Rome, ANONYMOUS (2006): Commission Directive 2006/56/EC amending the Annexes to Council Directive 93/85/EEC on the control of potato ring rot. JANSE J. D. (2006): Phytopathology: Principles and Practice. CAB International, Wallingford. KŮDELA V. (2007): History of bacterial ring rot of potato in the Czech Lands and a proposal for relaxation of strict quarantine measures. Plant Protect. Sci., 43: 35-46. PÁNKOVÁ I., KREJZAR V. (2007): Survival of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in arable crops and weed species. Vědecké práce 16 Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod: 00-00. PÁNKOVÁ I., KREJZAR V., ČEPL J., KŮDELA V. (2007): The incidence of detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in daughter tubers of volunteer plants. Plant Protect. Sci., 43: 00-00. SMITH I. M. et al. (Eds): Quarantine Pests for Europe. Second edition. Wallingford, UK, CAB International. VAN DER WOLF J. M., ELPHINSTONE J. G.,STEAD D. E., METZLER M., MÜLLER P., HUKKANEN A., KARJALAINEN R. (2005): Epidemiology of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in relation to control of bacterial ring rot. Report 95. Plant Research International B.V., Wageningen. 12