Alternativní metody zkoušení bezpečnosti KP

Alternativní metody zkoušení bezpečnosti KP RNDr. Hana Bendová, Ph.D. RNDr. Kristina Kejlová, Ph.D. NRC pro kosmetiku Státní zdravotní ústav Praha

Cíle hodnocení bezpečnosti KP vyloučení nežádoucích účinků intoxikace (perkutánně, ingescí,, sliznicemi) dráždění oka, kůže a sliznic mikrobiální kontaminace navození kontaktní přecitlivělosti (alergie), fotoiritace a fotosenzibilizace genotoxicita,, mutagenita, karcinogenita potvrzení deklarované funkce (např. SPF) ochrana před klamavou reklamou 2

Cíle EU v oblasti KP ochrana zdraví spotřebitele bezpečnost výrobků a jejich ingrediencí ingredience =chemická látka i látky a ingredience, které přinášejí benefit pro člověka, je nutno zkoušet a ověřovat jejich bezpečnost (např. UV filtry) pro zkoušení chemických látek a výrobků existují závazné metodiky, z nichž pouze některé jsou alternativní NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 - zkušební metody k registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek Test Guidelines OECD - metody www.oecd oecd.orgorg 3

Bezpečnost KP v rámci EU SCCS Vědecký výbor pro bezpečnost spotřebitele odborná stanoviska (opinions( opinions) změny v přílohách Kosmetické směrnice (barvy na vlasy, methyldibromo glutaronitril, furokumariny) http://ec ec.europa.eu/consumers/sectors/cosmetics/index_en. /index_en.htm EU varovný systém RAPEX (Rapid Alert System) spotřební výrobky (ročně cca 20 KP, z 3. zemí) stažení výrobků z trhu, zákaz prodeje 4

Toxikologické požadavky na ingredience SCCS (2006) Minimální požadavky Akutní toxicita Dráždivost a leptavost Senzibilizace kůže Kožní absorpce a penetrace Toxicita po opakované dávce (NOAEL MoS) Mutagenita / genotoxicita Pokud se předpokládá požití nebo prokázána absorpce kůží Karcinogenita,, toxicita pro rozmnožování Toxikokinetika, fototoxicita http://ec ec.europa.eu/health/ph_risk/ _risk/committees/04_sccp/docs/sccp_s_04.pdf 5

Legislativa KP Kosmetická směrnice 76/768/EHS 7. dodatek Kosmetické směrnice s (2003/15/ES) zákaz testů fináln lních výrobkv robků na zvířatech od 11.9.2004 zákaz uvádět t na trh výrobky, v jejichž ingredience byly zkoušeny poté,, co existuje validovaná alternativní metoda konečné termíny pro ukončen ení zkoušek ingrediencí na zvířatech : 11.3.2009 většina v zkoušek, 2013 toxicita po opakované dávce, toxicita pro reprodukci a toxikokinetika Zákon 246/1992 Sb. o ochraně zvířat proti týránít novela (z. 77/2004) zapracovala nad rámec r 7. dodatku zákaz z zkoušek KP i ingrediencí, v ČR žádné testy KP na zvířatech 6

Alternativní metody k pokusům na zvířatech princip 3R (Russell & Burch,, 1959) reduction (snížení počtu zvířat) refinement (zmírnění postupů) replacement (náhrada jiným testem bez použití zvířat) u KP ECVAM European Center for Validation of Alternative Methods, ESAC ECVAM Advisory Scientific Committee http://ecvam ecvam.jrc.it 7

Alternativní metody v legislativě Nařízení 440/2008/ES / OECD / ECVAM / ICCVAM Akutní toxicita: B.1 metoda fixní dávky, stanovení třídy akutní toxicity (OECD 420,423). Test cytotoxicity 3T3/NHK (ICCVAM Draft ) Kožní leptavost: B.40 kožní modely, TERtest (OECD 430,431) Kožní dráždivost: EPISKIN, EpiDerm, SkinEthic (ESAC) Fototoxicita: B.41 3T3 NRU test (OECD 432) Oční dráždivost - screening: Organotypické modely BCOP (bovinní), ICE (kuřecí) oko (studie ICCVAM + ESAC Statement 2007) Kožní absorpce a penetrace in vitro: B.45 (OECD 428) Genotoxicita / Mutagenita Genové mutace: B.13/14 Zkouška na reversní mutace u bakterií (OECD 471) B.10 Zk.na chromozomové aberace u savců in vitro (OECD 473) Klastogenicita + aneugenicita: In vitro mikronukleus test (OECD 487 - draft, ESAC Statement 2006) 8

Netestováno na zvířatech v ČR z. 258/2000 (novela z.471/2005, 29) lze uvést, pokud: výrobcem nebo dovozcem nebyly provedeny ani zadány pokusy na zvířatech u prototypu, finálního KP ani ingredience nebyly použity ingredience zkoušené při vývoji KP třetími osobami nemožné splnit podmínky, téměř všechny ingredience (ch( ch.. látky) v minulosti testovány využití pouze metod in vitro a klinických studií na lidských dobrovolnících 9

Přístup uvědomělých firem prohlášení o použití existujících ingrediencí, žádné testy finálních výrobků seznam firem www.peta peta.com (People for Ethical Treatment of Animals) podpis Humane Cosmetics Standard časová hranice ( (cut-off date) - látky otestované po tomto datu nepoužívají, nepodporují novější testování, povolují audity BUAV www.buav buav.org/gocrueltyfreegocrueltyfree (British Union for Abolition of Vivisection,, 1898) www.netestovanonazviratech.cz (Svoboda zvířat) seznam výrobců KP 10

Sekvenční metoda hodnocení bezpečnosti KP vyhodnocení toxikologického profilu ingrediencí, bezpečnost zapracované koncentrace míra expozice osob při aplikaci cílová skupina osob profesionální/běžné použití, předvídatelné chyby použití chemické a mikrobiologické vyšetření vyhodnocení výsledků alternativních metod (buněčné, tkáňové a orgánové kultury) vyhodnocení humánních dat (klinické testy, in-use, post- marketing data, monitoring nežádoucích účinků) 11

Biologické metody in vitro (SZÚ) Test cytotoxicity buněč ěčná linie fibroblastů 3T3 - Neutral Red Uptake Test (NRU) Test kožní iritace 3D modely lidské kůže Test očnío iritace HET-CAM - chorioalantoidní membrána - kuřec ecí embryo, NRU, 3T3 Neutral Red Release (NRR) Test fototoxicity 3T3 NRU test/ 3D modely lidské kůže Penetrace/absorpce prasečí kůže e ex vivo 12

Cytotoxicita Neutral Red Uptake Snížení životnosti narostlé buněčné kultury fibroblastů 3T3 po 24 hod aplikaci testovanému vzorku, příjem vitálního barviva (Neutral( Red Uptake) NRU 50 cytotoxická koncentrace látky snižující životnost buněčné kultury na 50% (ingredience) Nejvyšší necytotoxická koncentrace (finální KP) 13

Test cytotoxicity KP - postup Myší fibroblasty Balb/c 3T3 Pasážování buněk Monolayer 96-j. destičky Aplikace ředěných vzorků 24 h Barvení neutrální červení Měření fluorimetr 14

Nejvyšší necytotoxické koncentrace KP ( g/ml)( Obvyklé rozmezí hodnot: šampon 1 100 zubní pasta 100 2000 EDT, EDP, voda po holení 100 1000 sprchový gel 10 50 kondicioner 50 250 pěna na holení 100 250 tělové mléko 100 500 ústní voda 500 2000 tonik 500 2000 vlasová voda 1000 2000 15

Cytotoxicita - šampony Kategorie Proti lupům - ammonium lauryl sulfate 10-20% -sodiumlaurylsulfate10-35% - zinc pyrithione 2% - salicylic acid 2% - piroctone olamine 1% Běžný šampon, proti lupům s ketoconazolem (léčivo) - sodium lauryl sulfate 5-20% - ketoconazole 0.5% Jemný šampon, pro časté použití - panthenol, rostlinné extrakty Nejvyšší necytotox. konc. (μg/ml) 1-10 10-50 50-100

Cytotoxicita zubní pasty Kategorie Bělicí, antibakteriální pasta - hydrated silica 20% -éterickéoleje -triclosan - sorbitol 30-40% - glycerin 10-40% Běžná pasta Jemná pasta -anorganické soli uhličitan vápenatý hydrogenfosforečnan vápenatý Nejvyšší necytotoxická koncentrace (μg/ml) 100 250-500 1000-2500

Kožní dráždivost 3D modely lidské kůže EpiDerm TM (MatTek,, USA) normální lidské epidermální keratinocyty od 1 dárce, metabolicky aktivní 8-12 vrstev epidermis 10-15 15 vrstev stratum corneum zkoušky: leptavost dráždivost fototoxicita 18

EpiDerm TM - dráždivé účinky na kůži 60 MINUT EXPOZICE 42 HODIN POST- INKUBACE MTT TEST EpiDerm (0.63 cm 2 ) 25 mg/ 30 µl aplikace Životnost > Životnost Endpoint - MTT assay: 1 mg/ml MTT, redukce žlutého barviva na modrý formazan 50% negativní kontroly: nedráždí 50% negativní kontroly: dráždí 19

EpiDerm TM kožní dráždivost 1. příjem tkání 2. aplikace vzorků 3. oplach a inkubace 4. barvení MTT 5. výpočet životnosti 120 100 80 60 40 20 0 20 K VZ1 VZ2 VZ3 VZ4 VZ5

EpiDerm TM - ochranné účinky ingrediencí proti SLS Aloe Vera, Chamomile, Pronalen Sunlife, Pronalen Sensitive Skin, Green Tea, Pronalen Cereal 3D model EpiDerm, SLS 0,75% 300 250 Životnost (%) 200 150 100 50 0 P.Sunlife 5% Chamomile 5% Aloe Vera 5% P. Sens.Skin 0,5% Green Tea 5% P. Cereal 2,5% 21

Klinická studie - ochranné účinky ingrediencí proti SLS potvrzení výsledků in vitro v klinické studii jednorázový uzavřený epikutánní test skupina 20 dobrovolníků aplikace samotného SLS a SLS v kombinaci s ingrediencemi v koncentracích doporučených výrobcem na 4 hodiny odečet reakcí (erytém( erytém,, edém) po 0.5, 24 a 48 hod výpočet IKI Index kožní iritace, průměrné skóre reakcí pro celou skupinu dobrovolníků 22

Klinická studie - ochranné účinky ingrediencí proti SLS nejvýraznější snížení indexu kožní iritace (IKI) u Pronalenu Sensitive Skin, Green Tea a Chamomile IKI 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 SDS 5% P.Sun 2% P.Sun 5% P. Cereal 2,5% P.Cereal 5% GT 5% GT 6% P.SS 0.5% P.SS 5% Aloe 5% CH 5% 0,2 0,1 0 0,5 24 48 čas odečtu (hod) 23

Další 3D modely tkání MatTek,, USA EpiOral EpiVaginal iritace pro sliznice prostředky pro intimní hygienu MelanoDerm bělení / tmavnutí kůže 24

Dráždivé/leptavé účinky na oči 3D modely oční rohovky EpiOcular TM,MatTek HET-CAM test na chorioalantoidní membráně fertilizovaného slepičího vejce buněčné kultury buňky 3T3 Neutral Red Uptake (NRU) a Neutral Red Release (NRR) 25

Oční iritace 3D model EpiOcular TM lidské keratinocyty - skvamozní epitelium modelující rohovku aplikace tekutých i tuhých látek, nerozpustných ve vodě chemické látky (ingredience) (aplikace 30 min, cut-off 60% životnost oproti kontrole) formulace (ředění 20%, aplikace 3 časy výpočet ET ET 50 ) klasifikace dle ET 50 : nedráždí >256-26.5 26.5 min mírně dráždí <26.5-11.7 min středně dráždí<11.7-3.45 min silně dráždí <3.45 min 26

Oční ční iritace - HET CAM (Hen s Egg Test - Chorioallantoic Membrane) fertilizovaná vejce (8-10 dní), aplikace látek na membránu sledování změn (5 min.): hemoragie, lýza,, koagulace 27

Oční iritace - HET-CAM Výpočet iritačního skóre a potenciálu sledování prvního výskytu: hemoragie (H), lýzy (L) a koagulace (C) po dobu 300 s (tj. 5 min) výpočet iritačního skóre: (301 H) x 5 (301 L) x 7 (301 C) x 9 IS = + + 300 300 300 výpočet iritačního potenciálu: průměr IS 0 0,9 žádná iritace 1 4,9 lehká iritace 5 8,9 mírná iritace 9 21 silná iritace 28

Oční iritace - HET- CAM Změny po aplikaci šamponu pro děti hemoragie, lýza 30 s neporušená membrána 5 min iritační potenciál 8,3 mírná iritace 29

Oční iritace HET-CAM oční stíny, řasenky žádná iritace rozpouštědlo lepidla na umělé řasy iritační potenciál 17,2 - silná iritace 30

Oční iritace - Neutral Red Release surfaktanty,, chemické látky rozpustné ve vodě monolayer buněk obarven neutrální červení (NR) aplikace látky 1 min uvolnění NR po destrukci membrán výpočet koncentrace způsobující uvolnění 50% NR (NRR( 50 ) 31

Oční iritace tenzidové přípravky kombinace testu cytototoxicity NRR a NRU, EpiOcular,, HET-CAM NRR EpiOcular NRU HET-CAM NRR 50 (mg/ml) ET50 (min.) NRU 50 ( g/ml) Iritační skóre Dětský šampon 332.4 ± 105.8 44.9 382.8 ± 33.9 4.8 ± 2.5 Šampon proti lupům s pyrithionem zinečnatým 60.1 ± 6.1 16.1 9.8 ± 3.7 8.8 ± 3.1 Sprchový gel s pantenolem 83.1 ± 26.1 32.4 56.4 ± 9.6 16.5 ± 1.6 Šampon pro běžné použití 172.0 ± 44.4 38.3 15.3 ± 1.6 10.9 ± 2.0 Ekologické tekuté mýdlo 544.4 ± 174.5 84.4 193.6 ± 78.0 7.6 ± 1.9 Šampon proti lupům s piroctonem olaminu 85.4 ± 30.4 41.8 59.6 ± 4.0 10.0 ± 2.0 Sprchový šampon pro běžné použití 51.7 ± 18.0 33.5 51.2 ± 3.7 7.8 ± 0.6 Dětské tekuté mýdlo 343.1 ± 63.3 41.9 61.2 ± 3.7 15.4 ± 1.5 Sprchový gel s minerálními solemi 131.9 ± 52.8 38.5 99.3 ± 18.9 8.8 ± 0.7

Kožní absorpce a penetrace výpočet Margins of Safety (hranice bezpečnosti) doporučeno zkoušení ingredience zapracované ve finálním výrobku in vitro: využití prasečí kůže ex vivo aplikace 24 h, 13 frakcí kůže (povrch, epidermis 8 stripů, dermis,, receptor fluid) po extrakci analyzováno HPLC, GC/MS 33

UV filtr - kožní absorpce a penetrace in vitro Penetrace 24.4. a 5.6. 2008 50.00 45.00 40.00 35.00 30.00 25.00 20.00 % z n á s a d y 15.00 10.00 5.00 0,0 0,0 0.00 cap surface rec. Fluid strip 1 strip 2 strip 3 strip 4 strip 5 strip 6 strip 7 strip 8 strip 9 strip 10 s trip 11 strip 12 strip 13 strip 14 strip 15 s trip 16 epidermis dermis 5.6.2008 24.4.2008 34

Fototoxicita Zkouška fototoxicity 3T3 NRU in vitro - fotoaktivní látka + světlo = toxicita projevy erytém,, edém, pigmentace - 8 konc.. látky na dvou destičkách, jedna ozářená 5J UVA, druhá ve tmě - výpočet: fotoiritační faktor PIF - porovnání cytotoxických koncentrací látky snižujících životnost buněčné kultury na 50% v přítomnosti a nepřítomnosti záření EC 50 (-UV) PIF = -------------- EC 50 (+UV) EC 50 Látka je fototoxická : PIF 5 Pravděpodobně fototoxická : PIF 2 35

EpiDerm TM zkouška fototoxicity - 5 koncentrací látky na 4 tkáních, dvě ozářené 6J UVA, dvě ve tmě - Látka je fototoxická, pokud aspoň v jedné koncentraci po ozáření je životnost tkání snížena nejméně o 30% oproti životnosti tkáně exponované stejné koncentraci, ale bez ozáření. UV + UV - MTT (%životnosti) 120 100 80 60 40 20 0 LEMON +UV -UV 0.03 0.10 0.32 1.00 3.16 [%] 36

Studie fototoxicity éterických olejů Přítomnost fotoaktivních látek látek (hmotn.%) - chromatografická analýza GC/MS Citrus bergamia - bergamotové oleje BO-A A (ČR) / BO-B B (ČR) - žádné fotoaktivní látky BO-S S (Něm.) / BO-SCH (Něm.) - bergapten, bergaptol, bergamotin, neral, geranial, citropten (0,9-0,2 %) Litsea cubeba LC-A A (ČR) - neral (21 %), geranial (31 %) LC-B B (ČR) - neral (29 %), geranial (39 %) 37

Studie fototoxicity éterických olejů Přítomnost fotoaktivních látek (hmotn( hmotn.%) Pomeranč PO-A A (ČR) - neral (0,1 %), geranial (0,2 %) PO-E E (ČR) - neral (0,1 %), geranial (0,3 %) Pomeranč bez terpenu PO-KH (ČR) - neral (0,4 %), geranial (0,9 %) Citron CO-A A (ČR) - neral (1,8 %), geranial (4,1 %) CO-E E (ČR) - neral (1,9 %), geranial (3,2 %), oxypeucedanin (stopy) Citron bez terpenu PO-KH (ČR) - neral (14,4 %), geranial (21,7 %), oxypeucedanin (0,1 %) 38

Výsledky studie penetrace Bergapten Citral (neral neral/geranial geranial) surface strip 1-2 strip 3-4 strip 5-6 strip 7-8 strip 9-10 strip 11-12 strip 13-14 strip 15-16 epidermis dermis rec.fluid 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Pokus 1 kůže I Pokus 1 kůže II Pokus 2 kůže I Pokus 2 kůže II 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Pokus 1 kůže I Pokus 1 kůže II Pokus 2 kůže I Pokus 2 kůže II % ze stanoveného množství % ze stanoveného množství surface strip 1-2 strip 3-4 strip 5-6 strip 7-8 strip 9-10 strip 11-12 strip 13-14 strip 15-16 epidermis dermis rec.fluid Biologická dostupnost fotoaktivní látky je nezbytná pro rozvoj fototoxické reakce 39

Výsledky fototoxicity in vitro (1) Éterický olej Označení 3TR NRU PT EpiDerm TM Bergamot BO-A (ČR) NF NF BO-B (ČR) NF NF BO-S (Něm.) F F BO-SCH (Něm.) F F Litsea cubeba LC-A (ČR) F NF LC-B (ČR) F NF 40

Výsledky fototoxicity in vitro (2) Éterický olej Označení 3TR NRU PT EpiDerm TM Pomeranč PO-A A (ČR)( F F PO-E E (ČR)( F F Pomeranč bez terpenu PO-KH (ČR)( F F Citron CO-A A (ČR)( F F Citron bez terpenu CO-E E (ČR)( CO-KH (ČR)( F F F F 41

Photopatch test u dobrovolníků maximáln lní nefototoxické koncentrace z testu na 3D modelu jednorázov zový uzavřen ený kožní test v okluzi, spodní část zad, 10 cm od pátep teře e nalevo i napravo doba aplikace 1 h ozářen ení jedné sady vzorků solárn rním m simulátorem: - dávka UVA 5 J/cm 2, - intenzita zářenz ení 5 mw/cm 2, - doba zářenz ení cca 15-20 min. sada bez ozářen ení = kontrola odečet et reakcí: erytém,, edém intervaly odečtu: ihned po ozářen ení,, 24 h, 48 h, 72 h

Výsledky fototoxicity in vivo (1) Éterický olej Bergamot BO-A (1%) Bergamot BO-B (1%) Bergamot BO-S (0,1%) Bergamot BO-SCH (0,0316%) Litsea cubeba LC-A (0,1%) Litsea cubeba LC-B (0,1%) Intervaly odečtu / pozitivní reakce 24 h 0 / 5 0 / 5 5 / 5 5 / 5 48 h 0 / 5 0 / 5 5 / 5 5 / 5 72 h 0 / 5 0 / 5 5 / 5 5 / 5

Výsledky fototoxicity in vivo (2) Éterický olej Pomeranč PO-A (1%) Pomeranč PO-E (0,1%) Pomeranč PO-KH (0,1%) Citron CO-A A (1%) Citron CO-E E (0,1%) Citron CO-KH (0,1%) Intervaly odečtu / pozitivní reakce 24 h 6 / 10 1 / 10 6 (5*) / 10 2 (1*) / 10 1 (1*) / 10 48 h 6 / 10 5 (3*) / 10 3 / 10 72 h 4 / 10 1 / 10 5 (3*) / 10 2 / 10 * dráždiv divé reakce

Výsledky fototoxicity in vivo (3) bezpečnostní faktor 10 - koncentrace 10 x nižší Éterický olej Pomeranč PO-A (0,1%) Pomeranč PO-E (0,01%) Pomeranč PO-KH (0,01%) Citron CO-A A (0,1%) Citron CO-E E (0,01%) Intervaly odečtu / pozitivní reakce 24 h 48 h 72 h Citron CO-KH (0,01%)

Fototoxicita - glycerinová mýdla varování může vyvolat fotosenzibilitu 3T3 NRU zkouška fototoxicity Název obsah silic PIF Fototox. Litsea Litsea cubeba 0,18% 1,275 NE Grapefruit Citrus paradis 0,31% 1,219 NE Pomeranč Citrus sinensis 0,26% 1,238 NE Vánoční pohoda Citrus sinensis 0,044% 1,015 NE Litsea cubeba 0,03% 46

Závěry Obecné závěry alternativní testy nedílnou součástí hodnocení bezpečnosti KP kožní dráždivost možnost ověření epikutánním testem u lidí oční dráždivost baterie testů nutná pro zjištění mechanismu (Mode of Action) snášenlivost pro oční okolí možné ověřit až následně in-use testem Fototoxicita pro rozvoj fototoxické reakce je nezbytná biologická dostupnost fototaktivní látky - zkouška penetrace zkouška 3T3 NRU PT je závazná metoda pro hodnocení fototoxicity látek - příliš citlivá zkouška fototoxicity na rekonstruovaných modelech kůže je následnou zkouškou v případech nejednoznačných výsledků získaných při zkoušce v buněčné kultuře a u látek s topickou aplikací zkouška fototoxicity ve skupině dobrovolníků je potvrzující zkouškou nepřítomnosti potenciálu fototoxicity zejména finálních výrobků fototoxicita - startovací koncentrace pro zkoušky u lidí, bezpečnostní faktor 10 47

Děkuji za pozornost. RNDr. Hana Bendová, Ph.D. tel. +420 267082321 e-mail: hbendova@szu.cz RNDr. Kristina Kejlová, Ph.D. tel. +420 267082327 e-mail: kejlova@szu szu.cz 48