ENVIRONMENTÁLNÍ TOXIKOLOGIE TOXIKOLOGIE V PRAXI RNDr. Klára Kobetičová, Ph.D. Ústav chemie ochrany prostředí Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
OSNOVA REACH Testy SLP Ochrana zvířat Alternativní metody testování Klasifikace, vyhodnocení a zpracování dat 2
REACH Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals Registrace, hodnocení a povolování chemických látek 1. června 2007 na základě nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. prosince 2006. Registrace se vztahuje na chemické látky vyráběné v zemích EU a na chemické látky do EU dovážené jako takové nebo jako součást přípravků či výrobků v množství rovném nebo vyšším než 1000 kg ročně. Registraci podléhají chemické látky klasifikované jako nebezpečné a také nebezpečné chemické látky, které se uvolňují z výrobku při jeho řádném používání v množství 1000 kg ročně a vyšším celkově za typ výrobku. 3
REACH VÝJIMKY Z LEGISLATIVY REACH se nevztahuje na: radioaktivní látky látky pod celním dohledem neizolované meziprodukty přepravované látky odpad látky použité v zájmu obrany 4
REACH VÝJIMKY Z LEGISLATIVY potraviny nebo krmiva humánní a veterinární léčivé přípravky zpětně získané látky zpětně dovezené látky polymery použití látek pro účely výzkumu a vývoje zaměřeného na výrobky a postupy. 5
REACH ETAPY REGISTRACE Do 1.12.2010: látky CMR > 1 t/rok, látky nebezpečné pro ŽP > 100 t/rok látky > 1000 t/rok Do 1.6.2013: látky > 100 t/rok Do 1.6.2018: látky > 1 t/rok. 6
REACH DŮVODY VZNIKU Odstavec 1 úvodu direktivy uvádí: Toto nařízení by mělo zajistit vysokou úroveň ochrany lidského zdraví a životního prostředí a volný pohyb látek samotných a obsažených v přípravcích a v předmětech a současně zvýšení konkurenceschopnosti a inovace... rovněž by mělo podpořit rozvoj alternativních metod hodnocení rizik látek. 7
REACH Pro každou látku se vyžaduje vypracování technické dokumentace, jejíž obsah závisí na množství vyráběné nebo dovážené látky za rok s nastavenými hladinami 1, 10, 100 a 1000 tun. Pro látky vyráběné nebo dovážené v množství 10 tun a více se vyžaduje zpracování zprávy o chemické bezpečnosti. Registrační dokumentace se předkládá Evropské chemické agentuře (ECHA) společně s poplatkem. Pokud Evropská chemická agentura nesdělí námitky proti předložené registrační dokumentaci je možno po uplynutí tří týdnů od data registrace zahájit výrobu nebo dovoz chemické látky. 8
REACH K před-registraci chemických látek, k registraci chemických látek a k dalším účelům byl vyvinut software IUCLID 5.5. Za registraci látek jsou zodpovědní jejich výrobci a dovozci. Evaluaci provádí Evropská agentura pro chemické látky. Rozhodnutí o evaluaci vydává EK. 9
EXPOZIČNÍ SCÉNÁŘE Expoziční scénář k řízení rizika expozice nebezpečných chemických látek a směsí. Zahrnuje celý životní cyklus výrobku. IT nástroj: Chesar 2.2 nejnovější verze Umožňuje registrantům generovat jejich expoziční scénáře. http://chesar.echa.europa.eu/web/chesar/support/manualstutorials (manuály jak spravovat databázi). 10
CHEMICKÉ LÁTKY VZBUZUJÍCÍ ZNAČNÉ ZNEPOKOJENÍ (SVHC) V lednu 2009 ECHA vybrala 7 prioritních nebezpečných chemikálií na seznam látek pro autorizaci (povolení). Mezi těmito látkami jsou hexabromocyklododekan (HBCD), chlorované parafíny s krátkým řetězcem (SCCPs), tři ftaláty, xylenové pițmo a diaminodifenyletan (DMA). V lednu 2010 bylo na seznam látek vzbuzujících obavy dalších 14 chemických látek: 11
CHEMICKÉ LÁTKY VZBUZUJÍCÍ ZNAČNÉ ZNEPOKOJENÍ (SVHC) Zařazení látek na seznam je prvním krokem v procesu autorizace podle směrnice REACH, Evropská agentura pro chemické látky hodnotí zdravotní a ekologická rizika každé látky a prověřuje, zda je možné ji nahradit bezpečnější. Výsledkem procesu bude autorizace, kterou může být zachování stávajícího použití, jeho omezení nebo dokonce úplný zákaz výroby a dovozu do Evropské unie. Směrnice REACH stanoví povinnost poskytovat spotřebitelům informace o výskytu nebezpečnějších látek zařazených na kandidátní listinu ( látek vzbuzujících mimořádné obavy - SVHC). Jde o látky karcinogenní, mutagenní, reprotoxické, perzistentní, bioakumulativní a toxické. Spotřebitelé tedy mohou od prosince 2008 požadovat informace o obsahu SVHC a při nákupu se pak vyhnout zboží s některou nebezpečných látek. 2013 už celkem 145 látek. 12
SOCIOEKONOMICKÁ ANALÝZA (SEA) použitelná k vyhodnocení nákladů a výnosů pro společnost (aby převážil zisk a ztráty nebyly neekonomické). Třeba posoudit vliv na životní prostředí a zdraví obyvatelstva V případě, že neexistuje vhodná alternativa možnost povolení i SVHC látek. Zpracování SEA: 1. Stanovení cílů 2. Stanovení rozsahu scénáře použití 3. Identifikace a posouzení dopadů povolení oproti zamítnutí 4. Interpretace a posouzení důsledků 5. Výsledky 6. Nejistoty 13
METODY PRO ÚČELY REACH NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 ze dne 30. května 2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (736 stran) ve znění dalších předpisů. Fyzikálně-chemické Toxikologické Ekotoxikologické 14
FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ METODY (A) 1 ) BOD TÁNÍ/BOD TUHNUTÍ 2 ) BOD VARU 3 ) RELATIVNÍ HUSTOTA 4 ) TLAK PAR 5 ) POVRCHOVÉ NAPĚTÍ 6 ) ROZPUSTNOST VE VODĚ 7 ) ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT 8 ) BOD VZPLANUTÍ 9 ) HOŘLAVOST (PEVNÉ LÁTKY) 10) HOŘLAVOST PLYNŮ 11) HOŘLAVOST (PŘI STYKU S VODOU) 12) PYROFORICKÉ VLASTNOSTI PEVNÝCH LÁTEK A KAPALIN 13) VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI 14) BOD SAMOZÁPALU (KAPALINY A PLYNY) 15) RELATIVNÍ TEPLOTA SAMOZÁPALU PEVNÝCH LÁTEK 16) OXIDAČNÍ VLASTNOSTI (PEVNÉ LÁTKY) 17) POČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOST A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ 18) OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V POLYMERECH 19) CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ NEBO EXTRAKCI VE VODĚ 20) OXIDAČNÍ VLASTNOSTI (KAPALINY) 15
TOXIKOLOGICKÉ METODY (B) 1.a) AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA METODA FIXNÍ DÁVKY 1.b) AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY 2) AKUTNÍ TOXICITA (INHALAČNÍ) 3) AKUTNÍ TOXICITA (DERMÁLNÍ) 4) AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI 5) AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ/LEPTAVÉ ÚČINKY NA OČI 6) SENZIBILIZACE KŮŽE 7) ORÁLNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE) 8) INHALAČNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE) 9) DERMÁLNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE) 10) MUTAGENITA ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE U SAVCŮ IN VITRO 11) MUTAGENITA ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE V BUŇKÁCH KOSTNÍ DŘENĚ SAVCŮ IN VIVO 12) MUTAGENITA TEST SAVČÍCH ERYTROCYTÁRNÍCH MIKROJADER IN VIVO 13/14) MUTAGENITA ZKOUŠKA NA REVERZNÍ MUTACE S BAKTERIEMI 15) ZKOUŠENÍ MUTAGENITY A SCREENING KARCINOGENITY ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE U SACCHAROMYCES CEREVISIAE 16
TOXIKOLOGICKÉ METODY 16) ZKOUŠKA NA MITOTICKOU REKOMBINACI U SACCHAROMYCES CEREVISIAE 17) MUTAGENITA ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE V BUŇKÁCH SAVCŮ IN VITRO 18) ZKOUŠKA NA POŠKOZENÍ A REPARACI DNA NEPLÁNOVANOU SYNTÉZU DNA V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO 19) ZKOUŠKA NA VÝMĚNU SESTERSKÝCH CHROMATID IN VITRO 20) ZKOUŠKA NA RECESIVNÍ LETÁLNÍ MUTACE VÁZANÉ NA POHLAVÍ U DROSOPHILA MELANOGASTER 21) ZKOUŠKY NA TRANSFORMACE SAVČÍCH BUNĚK IN VITRO 22) DOMINANTNÍ LETÁLNÍ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH 23) ZKOUŠKA NA CHROMOSOMOVÉ ABERACE VE SPERMATOGONIÍCH SAVCŮ 24) SPOT TEST NA MYŠÍCH. 25) ZKOUŠKA NA DĚDIČNOU TRANSLOKACI U MYŠÍ 26) ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY NA HLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ INHALAČNÍ EXPOZICE NA HLODAVCÍCH) 27) ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY NA NEHLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE) 17
TOXIKOLOGICKÉ METODY (B) 28) STUDIE SUBCHRONICKÉ DERMÁLNÍ TOXICITY (90DENNÍ OPAKOVANÁ KOȚNÍ APLIKACE NA HLODAVCÍCH) 29) STUDIE SUBCHRONICKÉ INHALAČNÍ TOXICITY (90DENNÍ OPAKOVANÁ INHALAČNÍ EXPOZICE NA HLODAVCÍCH) 30) ZKOUŠKA CHRONICKÉ TOXICITY 31) STUDIE PRENATÁLNÍ VÝVOJOVÉ TOXICITY 32) ZKOUŠKA KARCINOGENITY 33) KOMBINOVANÁ ZKOUŠKA CHRONICKÉ TOXICITY A KARCINOGENITY 34) JEDNOGENERAČNÍ ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRODUKCI 35) DVOUGENERAČNÍ STUDIE REPRODUKČNÍ TOXICITY 36) STUDIE TOXIKOKINETIKY. 18
EKOTOXIKOLOGICKÉ METODY (C) 1) AKUTNÍ TOXICITA PRO RYBY 2) ZKOUŠKA AKUTNÍ IMOBILIZACE DAFNIÍ (DAPHNIA SP.) 3) ZKOUŠKA INHIBICE RŮSTU ŘAS 4) STANOVENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOST ČÁST II. ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC (Metoda C.4-A) ČÁST III. MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD (Metoda C.4-B) ČÁST IV. ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ CO2 (Metoda C.4-C) ČÁST V. ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ (Metoda C.4-D) ČÁST VI. ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH (Metoda C.4-E) ČÁST VII. ZKOUŠKA MITI (Metoda C.4-F) 5) ROZKLAD BIOCHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU 6) ROZKLAD CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU 7) ABIOTICKÝ ROZKLAD HYDROLÝZA JAKO FUNKCE ph 8) TOXICITA PRO ŽÍŽALY 19
EKOTOXIKOLOGICKÉ METODY (C) 9) BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST ZAHN WELLENSOVA ZKOUŠKA 10) BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM 11) BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST ZKOUŠKA NA INHIBICI DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU 12) BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS 13) BIOAKUMULACE: PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH 14) RŮSTOVÁ ZKOUŠKA NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH 15) ZKOUŠKA KRÁTKODOBÉ TOXICITY NA RYBÍM EMBRYU A VÁČKOVÉM PLŮDKU 16) ZKOUŠKA AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU 17) VČELA MEDONOSNÁ ZKOUŠKA AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY 18) STANOVENÍ ADSORPCE/DESORPCE ŠARŽOVITOU ROVNOVÁŽNOU METODOU 19) ODHAD ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (KOU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY POMOCÍ VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC) 20) ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRODUKCI DAPHNIA MAGNA 20
EKOTOXIKOLOGICKÉ METODY 21) PŮDNÍ MIKROORGANISMY: ZKOUŠKA NA TRANSFORMACI DUSÍKU 22) PŮDNÍ MIKROORGANISMY: ZKOUŠKA NA TRANSFORMACI UHLÍKU 23) AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V PŮDĚ 24) AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V SYSTÉMECH VODA/SEDIMENT + 25) AEROBNÍ MINERALIZACE V POVRCHOVÉ VODĚ 26) ZKOUŠKA INHIBICE RŮSTU Lemna sp. 21
KLASICKÉ TESTY TOXICITY Testovací organismy: laboratorní potkan, myš, morče, králík, (pes, kočka, prase, opice - makak) Testy: akutní, subchronické, chronické efekty Expozice: orální, dermální (popřípadě i dráždivost očí) Endpointy mortalita, podráždění, vliv na reprodukci, karcinogenní/mutagenní účinky Jednogenerační, vícegenerační. Chovy + pokusy: konvenční podmínky (nemají patogeny) bariérový chov ventilovaný chov, hygienická smyčka, pouze specifičtí mikrobi (SPF chovy) chov v izolátorech (bezmikrobní zvířata pouze 1 nebo 2 druhy bakterií, aby zvířata mohla vůbec žít), např. nu-nu myši. Tzv. Gnotobionti. Využití v imunologii. 22
SPRÁVNÁ LABORATORNÍ PRAXE (SLP) Soubor pravidel tvořících systém práce testovacích zařízení při provádění neklinických studií bezpečnosti chemických látek a chemických přípravků; tato pravidla se týkají podmínek, za kterých se tyto studie plánují, kontrolují, zaznamenávají, předkládají a archivují. Výkonný orgán v ČR: ASLAB (Středisko pro posuzování způsobilosti laboratoří), VÚV TGM v Praze. Povinnost testovacích zařízení zavést zásady SLP stanovuje zákon č. 356/2003 Sb. ve znění pozdějších předpisů. Správná laboratorní praxe není určena pro laboratoře provádějící rutinní kontrolní analýzy, např. provozní kontroly, analýzy pitných vod nebo ovzduší. 23
SPRÁVNÁ LABORATORNÍ PRAXE 24
SLP/GLP podrobné vedení veškeré dokumentace o plánování a provedení pokusu: - pořízení zvířat, jejich aklimatizace - časový plán, design pokusu - složení a množství podávané potravy, - průběžná hmotnost a zdravotní stav zvířat, - podmínky prostředí (teplota, vlhkost, osvětlení), - chování organismů, - dokumentace jednotlivých odběrů (krev, moč, stolice) - o provedení euthanasie a pitvy (odběr jednotlivých tkání a orgánů). - výsledky studie a jejich zpracování, interpretace, - závěrečná zpráva pro zákazníka. 25
SLP/GLP Podmínky pro založení pracoviště Peníze Prostory Kvalifikovaní zaměstnanci (manažer kvality, toxikologické pracoviště veterinární lékař, ) Know-how (věda, management). Vydání osvědčení o způsobilosti: SÚKL, ASLAB. 26
POUŽITÍ LABORATORNÍCH ZVÍŘAT V POKUSECH Ikea hlodavci 27
OCHRANA ZVÍŘAT Pravěk ochočení zvířat, zkoušení účinků přirozených jedů Demokritos, Hipokrates pitvy těl Středověk pitvy lidí nepřípustné, pouze pitvy zvířat Pol. 19.stol. Claude Bernard definoval zásady experimentů na zvířatech Rozmach po 2.svět.válce rozvoj základního výzkumu, farmaceutický průmysl 1959 zásada 3R (refinement zlepšení podmínek, replacement nahrazení, reduction snížení počtu používaných pokusných zvířat) Od 80.let 20.století a celé 21.století - Rozvoj alternativních metod ctících zásadu 3R. 28
ZÁKON NA OCHRANU ZVÍŘAT PROTI TÝRÁNÍ je český zákon ze dne 15. dubna 1992, č. 246/1992 Sb. ve znění pozdějších předpisů, který reguluje práva zvířat a stanoví podmínky nakládání s nimi. Jeho účelem je chránit zvířata před týráním, poškozováním jejich zdraví a jejich bezdůvodným usmrcováním člověkem. Obecná ustanovení mj. definuje zvíře jako živého obratlovce, kromě člověka, nikoliv však plod nebo embryo, a jako živého tvora schopného pociťovat bolest a utrpení; zcela zakazuje jejich bezdůvodné usmrcování, týrání i propagaci takového týrání. 29
ZÁKON NA OCHRANU ZVÍŘAT PROTI TÝRÁNÍ Ochrana zvířat při usmrcování, použití znecitlivění a ochrana zvířat při veřejných vystoupeních obsahuje ustanovení o možnostech a způsobech porážení a utrácení zvířat, o technických a jiných požadavcích na jatka; dále zakazuje se zvířete zbavit nebo je vyhnat (kromě vypuštění do jeho přirozeného prostředí) a reguluje také veřejná vystoupení zvířat. Ochrana zvířat při přepravě reguluje způsobilost zvířat k přepravě, maximální dobu přepravy, postupy při přepravě i technické požadavky na přepravní prostředky a odborné požadavky na přepravující osoby. 30
ZÁKON NA OCHRANU ZVÍŘAT PROTI TÝRÁNÍ 4. Ochrana hospodářských zvířat, zvířat v zájmových chovech a volně žijících zvířat kromě obecných podmínek pro chov hospodářských zvířat a zvířat v zájmových chovech jsou zde obsaženy podmínky nakládání s volně žijícími, toulavými a opuštěnými zvířaty, stejně jako se zvířaty handicapovanými. 5.Ochrana pokusných zvířat stanoví podmínky pro lékařské nebo vědecké pokusy na zvířatech. 6.Orgány ochrany zvířat dává především Ministerstvu zemědělství, Státní veterinární správě a obecním úřadům obcí s rozšířenou působností konkrétní pravomoci při působnosti v oblasti ochrany zvířat. 7.Správní delikty obsahuje jak přestupky, kterých se může v oblasti ochrany zvířat dopustit kterákoli fyzická osoba, tak správní delikty právnických nebo podnikajících fyzických osob, a sankce za ně. 31
ZÁKON NA OCHRANU ZVÍŘAT PROTI TÝRÁNÍ Laboratorní chovy: - manipulace, plánování, vedení, kontrola, provedení experimentů, jejich ukončení pouze proškolené osoby: - 1. absolventi VŠ přírodovědného zaměření, pracovníci příslušných laboratoří (vždy min. 1 jeden veterinář), - 2. laboranti (SŠ, práce se zvířaty). Proškolení, písemná (a ústní VŠ pracovníci) zkouška, získání certifikátu celoživotně. Podrobné vedení záznamů: 1. předchozí naplánování pokusu a jeho schválení odbornou komisí 2. o průběhu experimentu (počet zvířat, jejich zdravotní stav, množství potravy, vody, hmotnost, počet přeživších zvířat na konci experimentu, počet zemřelých, výsledky experimentu. 32
ALTERNATIVNÍ METODY QSARs (metody in silico) In vitro metody (mikroorganismy, buněčné a tkáňové kultury) Kožní terčíky (model lidská kůže) Metoda LLNA (Local Lymph Nodus Assay) Hovězí rohovka (metoda BCOP pro testování oční dráždivosti metoda pro zákal a propustnost rohovky) Ryby, obojživelníci embryo-larvální testy Ryby metoda prahové koncentrace. 33
QSARS (Quantitative Structure Activity Relationships) Vliv struktury/vlastností chemických látek na jejich biologický účinek (mortalita jedinců, reprodukční schopnost, vitalita buněk,...). Statistické modely pro skupiny látek se stejným mechanismem účinku. Praktická ukázka 34
POSTUP PŘI TESTOVÁNÍ Např. výroba nového léku/výrobku - Výběr z mnoha látek postupné snižování počtu látek, které budou dále analyzovány. - Cílem je zisk látky/přípravku, který nebude jedovatý pro člověka a jiné organismy a nebude mít nevhodné vlastnosti. - Celkovým testováním projde jen několik nebo jen jediná. 35
POSTUP PŘI TESTOVÁNÍ 1.Krok zisk informací 2. Krok testy na buňkách a tkáních - testy genotoxicity, mutagenity (tkáně, buňky) 3. Krok - testy akutní toxicity na savcích (pokud nelze použít některou z alternativních metod) 4. Krok - testy subchronické/chronické toxicity, reprodukční toxicita, karcinogeneze 5. Krok - toxikokinetika Léčiva, kosmetické přípravky a účinné látky - Epidemiologické studie v pracovním nebo životním prostředí. - Klinické studie 36
MODEL LIDSKÉ KŮŽE (např. EpiSkin, EpiDerm) Princip: Testovaný materiál se nanáší na povrch trojrozměrného modelu lidské kůțe sestávající z rekonstruované epidermis s funkční stratum corneum. Následně se zjišťuje účinek látky na țivotnost buněk. Cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy měřením aktivity tvorby formazanu z MTT (țlutá tetrazoliová sůl). Provedení: Testované materiály jsou umístěny na stratum corneum epidermálního modelu (jeden vzorek (koncentrace) na epidermis) ve 2 expozičních časech. Expozice je ukončena omytím fosfátovým pufrem. Poté jsou tkáně inkubovány MTT (țlutá tetrazoliová sůl). Pokud jsou buňky țivé, MTT je v mitochondriích redukován sukcinát-dehydrogenázou na formazan. Ten je přes noc z buněk vyextrahován okyseleným isopropylalkoholem a kvantifikován spektrofotometricky. Omezení testu: Nelze pouțít pro látky přímo redukující MTT. Úspora zvířat: pouțívají se uměle vypěstované epidermis z keratinocytů nebo koțní tkáň z kosmetických operací. 37
METODA LLNA (LOCAL LYMPH NODUS ASSAY) In vivo metoda, modelový organismus myš mladé dospělé samice kmene CBA (8 12 týdnů staré) 20 ks Lymfatické uzliny proliferace lymfocytů v místě působení alergenu. Tato proliferace je úměrná dávce a účinnosti aplikovaného alergenu a představuje jednoduchý prostředek k získání kvantitativního údaje o míře senzibilizace. možnost snížení počtu zvířat použitých do pokusu. (30 morčat) Kontrola vehikulum (např. aceton s olivovým olejem). 38
METODA BCOP (BOVINE CORNEAL OPACITY AND PERMEABILITY) Účelem této zkušební metody je popsat postupy používané k hodnocení potenciálních leptavých nebo silně dráždivých účinků zkoušené látky na oči měřené její schopností způsobit zákal a zvýšit propustnost v oddělené rohovce skotu. Toxické účinky na rohovku se měří: 1) sníženou propustností světla (zákal) 2) zvýšenou prostupností barviva fluoresceinu sodného (propustnost). Zkušební metoda BCOP používá oddělené rohovky z očí čerstvě poráženého skotu. Zákal rohovky se měří kvantitativně jako množství průchodu světla rohovkou (opacitometr). Propustnost se měří kvantitativně jako množství barviva fluoresceinu sodného, které prochází celou tloušťkou rohovky a zjišťuje se v mediu zadní komory (spektrometricky). 39
EKOTOXIKOLOGIE - EMBRYONÁLNÍ TESTY Ryby (kapr, pstruh, Danio rerio) Obojživelníci (Drápatka vodní Xenopus leavis) FETAX (The Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus) Hodnocení přežívání, malformací, chování. 40
EKOTOXIKOLOGIE - PRINCIP PRAHOVÉ KONCENTRACE (RYBY) Nařízení OECD SG number 126 (ryby) Testování chemických látek modelové organismy různých trofických úrovní (rostliny, bezobratlí živočichové, obratlovci, mikroorganismy)/producenti, konzumenti, destruenti). Pro analýzu rizik se poté využijí data z testu s nejcitlivějším organismem: riziko (RQ) = PEC/PNEC PEC < PNEC ne risk PEC = predikovaná environmentální koncentrace PNEC = predikovaná koncentrace, která ještě nezpůsobuje efekt (získaná z laboratorních dat). 41
PRINCIP PRAHOVÉ KONCENTRACE Test na řasách a Test na bezobratlých (dafnie) EC50 např. 5 mg/l EC50 např. 10 mg/l vybere se nejnižší EC50 jako tzv. Threshold Concentration (TC), ta se otestuje na rybách (7 ryb, 96 hodin) mortalita nulová mortalita úplná zkouška testování ukončeno (výpočet LC50) LC50 > TC 42
KLASIFIKACE LÁTEK A SMĚSÍ Zařazení dle GHS (globálně harmonizovaný systém) platný od roku 2008. - Až do 1.6.2015 přechodný stav, platí obě klasifikace. Starší klasifikace: R - věty S - věty Nově: H věty: standardní věty o nebezpečnosti P věty: standardní pokyny pro bezpečné zacházení. 43
KLASIFIKACE, HODNOCENÍ A ZPRACOVÁNÍ DAT Akutní toxicita Dříve test pro stanovení LD limitní test (2000 mg/kg), pokud uhyne nějaký organismus - provedení testu s více koncentracemi. LD < 25 mg/kg vysoce toxická látka LD = 25 200 mg/kg toxická látka LD = 200 2000 mg/kg zdraví škodlivá látka. 44
KLASIFIKACE, HODNOCENÍ A ZPRACOVÁNÍ DAT Akutní toxicita Nyní metoda fixní dávky 4 dané testovací dávky 5, 50, 300, 2000 mg/kg Zařazení dle GHS (globálně harmonizovaný systém) kategorie LD 1 0-5 mg/kg 2 5-50 mg/kg 3 50-300 mg/kg 4 300 2000 mg/kg 5 2000 5000 mg/kg 45
KATEGORIE PŘÍKLAD - AKUTNÍ LÁTKA http://www.unece.org/fileadmin/dam/t rans/danger/publi/ghs/ghs_rev01/engl ish/06e_annex2.pdf 46
KATEGORIE ŽP-AKUTNÍ TOXICITA http://www.unece.org/fileadmin/dam/t rans/danger/publi/ghs/ghs_rev01/engl ish/06e_annex2.pdf 47
KATEGORIE - ŽP- AKUTNÍ TOXICITA http://www.unece.org/fileadmin/dam/t rans/danger/publi/ghs/ghs_rev01/engl ish/06e_annex2.pdf 48
KATEGORIE ŽP- CHRONICKÁ TOXICITA 49 http://www.unece.org/fileadmin/dam/trans/danger /publi/ghs/ghs_rev01/english/06e_annex2.pdf
KATEGORIE Poleptání kůže znamená způsobení nevratného poškození kůže po aplikaci testovací látky po dobu až 4 hodiny. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jediné harmonizované kategorie. Podráždění kůže znamená způsobení vratného poškození kůže po aplikaci testovací látky po dobu až 4 hodiny. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jediné harmonizované kategorie. Pro orgány, jako jsou regulátoři pesticidů, které chtějí míce než jednu úroveň podráždění kůže, se poskytuje dodatečná kategorie mírného podráždění. Vážné poškození očí znamená způsobení poškození tkáně oka nebo vážnou fyzikální poruchu zraku, následující po aplikaci testovací látky na přední povrch oka, které není plně vratné do 21 dnů od aplikace. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jediné harmonizované kategorie. Podráždění očí znamená změny v oku následující po aplikaci testovací látky na přední povrch oka, které jsou plně vratné do 21 dnů po aplikaci. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jediné harmonizované kategorie. Pro orgány, jako jsou regulátoři pesticidů, které chtějí míce než jednu úroveň podráždění očí, lze vybírat jednu ze dvou podkategorií, v závislosti na tom, zda jsou změny vratné do 21 nebo do 7 dnů. 50
KATEGORIE Senzibilizace dýchacích orgánů znamená, že látka po inhalaci vyvolává hypersenzitivitu dýchacích cest. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jediné harmonizované kategorie. Senzibilizace kůže znamená, že látka po kontaktu s kůží vyvolává alergickou reakci. Definice "senzibilizace kůže" je ekvivalentní "kontaktní senzibilizaci". Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jediné harmonizované kategorie. Mutagenita v zárodečných buňkách znamená, že činidlo způsobuje zvýšený výskyt mutací v populaci buněk a/nebo organismů. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jedné ze dvou harmonizovaných kategorií. Kategorie 1 má dvě podkategorie. Karcinogenita znamená, že látka nebo směs látek vyvolává nádorové bujení nebo zvyšuje jeho výskyt. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jedné ze dvou harmonizovaných kategorií. Kategorie 1 má dvě podkategorie. 51
KATEGORIE Toxicita pro reprodukci zahrnuje nežádoucí účinky na pohlavní funkci a plodnost u dospělých mužů a žen, stejně jako vývojovou toxicitu u potomků. Látky a směsi s reprodukčními nebo vývojovými účinky se řadí do jedné ze dvou kategorií, "známý nebo předpokládaný" a "podezřelý". Kategorie 1 má dvě podkategorie pro reprodukční a vývojové účinky. Látky, které mohou znamenat nebezpečí pro kojence, mají samostatnou kategorii, Účinky při nebo prostřednictvím kojení. Toxicita pro specifické cílové orgány (TOST) je třída, která rozlišuje mezi jednorázovou a opakovanou expozicí pro účinky na cílové orgány. Všechny významné účinky na zdraví, jinak specificky nezahrnuté do GHS, které mohou narušit funkci, jak vratně tak nevratně, ihned nebo s prodlevou, jsou zahrnuty do třídy nesmrtné toxicity pro specifické cílové orgány (TOST). Narkotické účinky a podráždění dýchacích orgánů se považují za systémové účinky pro cílové orgány následující po jednorázové expozici. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti pro jednorázovou expozici jsou řazeny do jedné ze tří kategorií. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti pro opakovanou expozici jsou řazeny do jedné ze dvou kategorií. Nebezpečí při vdechnutí zahrnuje akutní účinky, jako je chemická pneumonie, různého stupně postižení dýchacích orgánů nebo smrti po vdechnutí. Vdechnutí je vstup kapaliny nebo tuhé látky přímo přes ústní nebo nosní dutinu, anebo nepřímo vdechnutím zvratků, do průdušnice a dolních cest dýchacích. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jedné ze dvou kategorií na základě jejich viskozity. 52
KATEGORIE Nebezpečnost pro životní prostředí Akutní nebezpečí pro vodní prostředí znamená přirozenou vlastnost materiálu způsobovat při krátkodobé expozici poškození vodních organismů. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazeny do jedné ze tří kategorií na základě akutní toxicity: LC 50 (ryby), EC 50 (korýši) nebo ErC 50 (řasy nebo jiné vodní rostliny). V některých regulačních systémech mohou být tyto kategorie pro některé sektory dále děleny nebo rozšiřovány. Chronické nebezpečí pro vodní prostředí znamená potenciální nebo skutečné vlastnosti materiálu způsobovat nežádoucí účinky na vodní organismy při expozicích, které jsou určeny v relaci k životnímu cyklu organismů. Látky a směsi této třídy nebezpečnosti jsou řazey do jedné ze čtyř kategorií na základě toxicity a osudu v životním prostředí: LC 50 (ryby), EC 50 (korýši) nebo ErC 50 (řasy nebo jiné vodní rostliny), a degradace nebo bioakumulace. 53
VÝSTRAŽNÉ SYMBOLY NEBEZPEČNOSTI GHS01 - výbušné látky GHS02 - hořlavé látky GHS03 - oxidační látky GHS04 - plyny pod tlakem GHS05 - korozivní a žíravé látky GHS06 - toxické látky GHS07 - dráždivé látky GHS08 - látky nebezpečné pro zdraví GHS09 - látky nebezpečné pro životní prostředí GHS10 - látky s neznámými vlastnostmi 54
TESTOVACÍ STRATEGIE PODRÁŽDĚNÍ KŮŽE 55
TESTOVACÍ STRATEGIE PODRÁŽDĚNÍ KŮŽE 56
TESTOVACÍ STRATEGIE AKUTNÍ TOXICITA 57
TESTOVACÍ STRATEGIE PODRÁŽDĚNÍ OČÍ 58
DALŠÍ TESTOVACÍ STRATEGIE Karcinogenita Mutagenita Reprodukční toxicita Opakovaná toxicita Poměrně složité testovací strategie, různé postupy pro látky vyráběné v různých tonážích. 59
NEPLACENÉ ZDROJE INFORMACÍ 60
DĚKUJI ZA POZORNOST Tento projekt (57/2013/B4: Inovace předmětu Environmentální toxikologie) je podporován ze zdrojů Fondu Rozvoje Vysokých Škol. Literární zdroje: Legislativa REACH - Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ve znění pozdějších a souvisejících předpisů. Vybrané přednášky z konference Průmyslová toxikologie a ekotoxikologie 2013. Červen 2013, Kouty nad Desnou. Zákon na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 Sb. ve znění pozdějších předpisů. Zákon o Správné laboratorní praxi č. 356/2003 Sb. ve znění pozdějších předpisů. 61