Cvičení č. 1: Mikroskopie živých buněk A. Teorie SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE Složený světelný mikroskop, který užívá viditelné spektrum vlnových délek světla žárovky, zůstává stále nejdůležitějším nástrojem pro základní mikroskopická pozorování buněk. Prostým lidským okem nelze rozlišit dva objekty, jestliže jsou blíže než 0,1 mm. Pomocí světelného mikroskopu (při použití velmi kvalitních čoček) lze rozlišit dva objekty vzdálené 0,2 µm. Protože rozlišovací schopnost objektivu, tj. vzdálenost dvou blízkých bodů, které lze ještě rozlišit jako dva body, závisí na číselné apertuře objektivu (A) a na vlnové délce použitého světla (d = λ/a), je právě vlnová délka použitého světla jedním z limitujících faktorů. To je důvod, proč se někdy používá modré světlo, které má kratší vlnovou délku. Také konstrukční parametry a optické vlastnosti mikroskopu značně ovlivňují jeho rozlišovací schopnost. Objektivy s větší rozlišovací schopností mají větší aperturu (např. objektiv 10x s A=0,25 má rozlišovací schopnost asi 1,8 µm, objektiv 40x s A=0,65 asi 0,8 µm). Rozlišovací schopnost světelných mikroskopů se pohybuje obvykle kolem 0,4 0,7 µm, u těch nejkvalitnějších dosahuje maximálně 0,2 µm. Celkové prospěšné zvětšení světelného mikroskopu je rovno součinu čísel zvětšení okuláru a objektivu; dosahuje maximální hodnoty 1200 1500 násobku. Světelný mikroskop tedy umožňuje sledovat biologické objekty mikrometrových rozměrů s limitující jejich vzdáleností 0,2 µm. To znamená, že můžeme pozorovat jak běžné rostlinné, tak živočišné buňky, ale můžeme rozlišit i některé detaily jejich vnitřního uspořádání. Další zvětšení nad tuto mez pomocí silnějšího okuláru dává jen prázdné zvětšení, tj. obraz je větší, ale bez dalších nových detailů. Kvalitu mikroskopického obrazu značně ovlivňuje intenzita a množství procházejících světelných paprsků, proto je důležité clonění. Přicloněním roste hloubka ostrosti a kontrast obrazu, ale zhoršuje se rozlišovací schopnost. Zejména u nativních preparátů je nutné zvýšit kontrast, proto se více cloní, a to ztlumením světla žárovky. Hloubka ostrosti představuje výšku objektu, která se daným objektivem zobrazí ostře. Je tím větší, čím je menší apertura a zvětšení použitého objektivu. Objektivy o velké apertuře a zvětšení zobrazují ostře jen jednu úzkou optickou rovinu a všechny struktury, které jsou mimo ni, nejsou vidět nebo jsou neostré. Při správném mikroskopování je třeba neustále proostřovat do různých optických rovin, aby se získala lepší představa o prostorovém utváření pozorovaného objektu. Proto se při mikroskopování zásadně používají obě ruce (jednou se proostřuje, druhou se buď vyhledává vhodný objekt v preparátu, nebo se objekt kreslí). 1.2.1 Práce s mikroskopem Mikroskop zapneme v případě potřeby. Během přípravy preparátů, kdy nemikroskopujete, vypínejte, prosím, žárovku. Prodloužíte tak její životnost. Vlastní pozorování začínáte vždy objektivem s nejmenším zvětšením (obvykle 10x), použitý okulár je 10x zvětšující. Při zaostřování dávejte pozor, abyste čelní čočkou objektivu nenarazili na preparát (volná pracovní vzdálenost je 7-8 mm). Někdy nemůžete objekt v preparátu najít. V takovém případě je vhodné nejprve zaostřit na hranu krycího sklíčka (objekt je v téže optické rovině) a poněkud snížit intenzitu světla přicloněním (ovládací knoflík je uprostřed dole na přední straně stativu mikroskopu). Nezapomeňte, že obraz v mikroskopu se pohybuje opačným směrem než preparát a že s rostoucím zvětšením objektivu se zmenšuje skutečné zorné pole (při použití celkového zvětšení 100x je průměr zorného pole přibližně d = 1,8 mm, při zvětšení 400x je d = 450 µm).
Protože konstrukce mikroskopu zajišťuje paracentrální zmenšování zorného pole, musíte mít vždy sledovaný objekt uprostřed zorného pole mikroskopu. Jinak byste při použití většího zvětšení pozorovaný objekt nemuseli nalézt. 1,8 mm 900 μm 450μm 100x 200x 400x 1.2.2 Nejčastější chyby při mikroskopování A) celé zorné pole nebo jeho část jsou tmavé a) nesvítí žárovka mikroskopu podívejte se, zda je elektrická šňůra zapojena do zásuvky. b) uzavřená clona žárovky odcloníte. c) objektiv není v optické ose otočíte měničem objektivů. B) obraz nelze zaostřit při větším zvětšení a) máte-li preparát (např. krevní nátěr) bez krycího sklíčka, je preparát položen na stolku mikroskopu obráceně (tj. buňkami ke kondenzoru) preparát otočíte. b) příliš vysoký preparát buď je silný pozorovaný objekt, nebo je vysoká vrstva balzámu v takovém případě je třeba opravit preparát anebo ho pozorovat jen při malém zvětšení. c) čočka objektivu je namočená do vody nebo jiného média, či špinavá od balzámu objektiv je nutné vyčistit (jemným hadříkem namočeným v destilované vodě). d) objekt nelze vůbec nalézt je vhodné při malém zvětšení si nalézt hranu krycího sklíčka, trochu přiclonit, pak vyhledat objekt, a teprve pak hledat objekt při velkém zvětšení. C) znečištění optiky či preparátu se pozná podle pohybu některými částmi mikroskopu a) preparátu nečistota se pohybuje spolu s preparátem vyčistíte krycí a podložní sklíčko b) okuláru otáčením okuláru se nečistoty otáčejí současně vyčistíte horní čočku okuláru c) objektivu pohnutím objektivem nečistoty se pohybují současně vyčistíte čelní čočku objektivu nejprve vodou, nepomůže-li to, pak lihem. POZOROVÁNÍ ŽIVÝCH BUNĚK NATIVNÍ PREPARÁT Nativní preparát dovoluje pozorovat živé nezměněné buňky, které si zachovávají své vitální funkce, tj. pohyb, exocytózu, množí se, reagují na podněty vnějšího prostředí (např. taxe, osmotické jevy, projevy odumírání poškozených buněk apod.). Abychom mohli pozorovat živé buňky, musíme je uchovávat ve fyziologických tekutinách (voda, fyziologický roztok, PBS, kultivační médium). Nevýhodou nativních preparátů je, že snadno vysychají a nehodí se pro dlouhodobé pozorování objektu. Dříve se preparáty upravovaly orámováním krycího sklíčka směsí parafínu a včelího vosku nebo lakem. Dnes se k dlouhodobému pozorování živých buněk (např. při videomikrografii) používá speciálních kultivačních komůrek v různém provedení a modifikacích. Druhou nevýhodou nativních preparátů je to, že při pozorování ve světlém poli jsou vidět jen přirozeně zbarvené struktury nebo struktury lišící se různou propustností světla. Absorpce
světla buněčnými strukturami se projeví zmenšením intenzity procházejícího záření, která je úměrná čtverci amplitudy. Pokud se v preparátu absorbuje souměrně světlo celého spektra, objekt se zobrazí černobíle ve světlém zorném poli. Je-li některá vlnová délka světla absorbována více, preparát se jeví barevný, a to v barvě komplementární k barvě absorbované. Tedy pokud světlo procházející objektem mění svou vlnovou délku a amplitudu, oko to rozeznává jako rozdíly v barvě objektu a v intenzitě světla. Viditelnost většiny biologických preparátů je třeba zlepšit barvením, nebo se musí použít speciální mikroskopické metody (fázově kontrastní, interferenční mikroskopie aj.), které umožňují pozorovat živé a nezbarvené buňky. SUPRAVITÁLNÍ A POSTVITÁLNÍ BARVENÍ K docílení lepší pozorovatelnosti živých, zejména živočišných buněk, které nejsou přirozeně zbarvené, lze použít barvení buněk tzv. vitálními barvivy. Protože prakticky není žádná barvicí metoda, která by buňky nějak nepoškozovala, pozorují se buňky již jen přežívající (tzv. supravitální barvení). Vitální barviva jsou vesměs barviva málo toxická a používají se silně zředěná, takže buňky neusmrcují okamžitě. V důsledku toho je možné alespoň krátkodobě pozorovat různé buněčné pochody (především aktivní transport molekul barviva, které je střádáno v některých organelách). Častým supravitálním barvivem je neutrální červeň, která je střádána ve vakuolách rostlinných buněk nebo je přijímána pinocytózou a ukládána v sekundárních lysozomech živočišných buněk. Z dalších barviv je to Janusova zeleň, která se střádá v mitochondriích, nebo akridinová oranž barvící jádro a jadérko (zde je však nutné použít fluorescenční mikroskop). Některá barviva živé buňky nebarví, jsou jimi barveny pouze buňky mrtvé, proto hovoříme o tzv. postvitálním barvení. Charakter molekul těchto barviv (např. trypanová modř) brání jejich průniku přes nepoškozenou cytoplazmatickou membránu živých buněk. Jakmile se změní permeabilita membrány u mrtvých buněk, barvivo difunduje do buňky a celou ji obarví. Pomocí supravitálních i postvitálních barviv lze diferencovat mezi živými a mrtvými buňkami, čehož se využívá k tzv. testům vitality. Trypanová modř se často používá k orientačnímu zjišťování životnosti buněk při jejich pěstování in vitro. K testování cytotoxicity tuhých látek, jejich roztoků či extraktů se užívá spíše testů v různých uspořádáních a modifikacích s neutrální červení. Živá živočišná buňka ukládá barvivo aktivně do sekundárních lysozomů, ale po poškození membrány toxickým vlivem se barvivo uvolní do okolního prostředí a poškozené buňky se odbarví (jsou nezbarvené). FÁZOVÝ KONTRAST Kvalitu zobrazení mikroskopických objektů charakterizují zvětšení, rozlišovací schopnost mikroskopu a obrazový kontrast. Sama rozlišovací schopnost mikroskopu však ještě nezaručí, že v mikroskopickém obrazu uvidíme strukturní detaily. Jsou vidět, jen když je dostatečný kontrast (tj. rozdíl jasu) mezi nimi a jejich okolím. Primárním zdrojem kontrastu je interakce mikroskopických objektů s osvětlujícím zářením. Uplatnit se může např.: difrakce, rozptyl světla, lom světla, fluorescence, absorpce, ohyb světla, dvojlom polarizovaného světla. Který z jevů se bude podílet na vzniku a kvalitě obrazu, závisí na konstrukci mikroskopu a použité mikroskopické technice. Nezbarvený neabsorbující objekt, pokud ho chceme pozorovat v mikroskopu, se musí od svého okolí lišit alespoň indexem lomu, který spolu s tloušťkou objektu ovlivňuje fázi procházejícího světla. Na rozhraní mezi objektem a okolím dochází také k odrazu a lomu světla, malé strukturní detaily světlo rozptylují. Za určitých podmínek se tak může stát, že část zobrazujícího světla je vržena mimo objektiv a tedy se nepodílí na zvýšení celkového jasu
obrazu. To je důvod, proč např. buněčná stěna nebo membrány buněk a velkých organel (např. vakuola), ač jsou nezbarvené, se jeví při pozorování ve světlém poli tmavší než pozadí. Takovým objektům se říká fázové objekty. Metody pozorování fázových objektů lze rozdělit do dvou kategorií: metody využívající šikmé osvětlení (slouží ke zvýraznění těch objektů, které výrazně mění směr šíření jimi procházejícího světla) - pozorování v temném poli metody umožňující přímou detekci fázových posunů procházejícího světla - fázový kontrast, - interferenční mikroskopie, - Nomarského diferenciální interferenční kontrast - polarizační mikroskopie Fázový kontrast V nezbarvených objektech, jako jsou živé živočišné buňky, se nemění amplituda procházejícího světla, ale dochází k posunu jeho fáze v těch místech objektu, která se liší optickou hustotou, tj. indexem lomu. Avšak malé fázové rozdíly oko nerozezná, proto se tyto objekty jeví průhledné a bezstrukturní. Podstata fázově kontrastního zařízení spočívá v tom, že fázové rozdíly světla, které prošlo objektem, převádí na rozdíly amplitudové, které jsou již okem viditelné jako změny intenzity světla. Za vynález této mikroskopie byla F. Zernikovi udělena v roce 1953 Nobelova cena. Zpravidla fáze paprsků je posunuta jen málo, od 1/10 do 1/4. K dosažení nejlepšího kontrastu je třeba snížit intenzitu dopadajícího světla a uměle posunout jeho fázi o 1/4 v pozitivním nebo negativním smyslu. Dosáhne se toho tím, že do kondenzoru se zařadí prstenčitá clona, která propouští jen část dopadajícího světla. V objektivu je vložena fázová destička tvarem a velikostí odpovídající tvaru clony v kondenzoru. Jestliže fázová maska zpožďuje nedifraktované záření, dostaneme negativní fázový kontrast - objekty s větším indexem lomu než okolí se jeví světlejší na tmavším pozadí. Častěji se využívá pozitivní fázový kontrast, kdy fázová maska zpožďuje difraktované záření o 1/4. Objekty s větším indexem lomu se potom jeví tmavší na světlejším pozadí, přitom čím je objekt silnější, tím je tmavší. Obě clony (v kondenzoru i objektivu) si odpovídají velikostí a musí se krýt. Velikost fázového posunu závisí na vlnové délce použitého světla, proto se nejčastěji užívá monochromatického žlutozeleného světla, pro které je lidské oko nejcitlivější. Určitou nevýhodou fázového kontrastu je tzv. halo efekt, který je způsoben lomem světla na strukturách s velkým rozdílem indexu lomu (např. na cytoplazmatické membráně kulatých buněk v suspenzi v kultivačním médiu). Projevuje se jasně zářícím rozhraním mezi objektem a prostředím a tím se ztrácí hranice objektu.
B. Praktické cvičení 1) Pozorování živých buněk v kultivační lahvičce Kultivační lahvička s buňkami (3T3-SA myší fibroblasty, NHDF lidské dermální fibroblasty) Pozorujte buňky se v kultivační lahvičce se zvětšením 100x. Při zvětšení 200x zakreslíte buňky s pozorovanými detaily, struktury popíšete a uvedete použité zvětšení a odhad velikosti buňky a celkové zvětšení nákresu. Příklad: Buňku pozorujete při zvětšení 200x, přitom zaujímá přibližně 1/3 průměru zorného pole, její odhadnutá velikost je tedy 150 μm. Vy ji však nakreslíte velikou v průměru 5 cm, tj. 50 000 μm. Konečné zvětšení nakreslené buňky je rovné poměru: aktuální velikost obrázku (v μm) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- = 333x odhadnutá velikost buňky (v μm) 2) Nativní preparát buněk bukální sliznice Podložní a krycí sklíčka, vatové tyčinky, stěr z bukální sliznice, destilovaná voda, kádinky, čtverek buničité vaty. Před odebráním bukální sliznice si důkladně vodou vypláchněte ústa, aby se odstranily baktérie a zbytky jídla. Potom jedním koncem vatové tyčinky několikrát seškrábnete povrch bukální sliz-nice a získaný materiál rychle rozetřete v tenké vrstvě na čisté podložní sklo, přikryjete krycím sklíčkem a přes buničitou vatu bříškem palce přitlačíte. Tento nativní preparát pozorujete v normálním světlém poli. Při zvětšení 400x zakreslíte buňky s pozorovanými detaily, struktury popíšete, uvedete zvětšení mikroskopu a odhad velikosti buňky. 3) Určení viability buněk trypanovou modří Podložní a krycí sklíčka, suspenze buněk, trypanová modř. Suspenzi buněk smícháte v poměru 1:1 s roztokem trypanové modři. Pipetou několikrát resuspendujeme a necháme 5 minut inkubovat. Kapku obarvené buněčné suspenze dáte na čisté podložní sklo a přikryjete krycím sklem. Prohlížíte ve fázovém kontrastu při zvětšení 100x živé buňky jsou kulaté, nezbarvené, jeví se jako svítící body, jejich povrch je obvykle hladký. Mrtvé buňky jsou modré, jeví se jako matné. Jejich povrch může být zvrásněný v podobě drobných kuliček a puchýřků, tzv. blebs, event. se obsah buněk může vylévat v podobě hernií. Jádro obvykle v těchto kulatých buňkách není vidět. Spočítejte poměr mrtvých a živých buněk a stanovte procento živých buněk alespoň v 10-ti zorných polích.