ZOBRAZOVACÍ METODY V OPTICKÉ MIKROSKOPII Prof.RNDr.Antonín Mikš,CSc. Katedra fyziky, FSv ČVUT, Praha miks@fsv.cvut.cz Úvod Jedním z nejrozšířenějších optických přístrojů je mikroskop, který nachází široké uplatnění v řadě oblastí vědy a techniky. Při studiu vlastností předmětů vyšetřovaných pomocí mikroskopu se používá celé řady technik (metod) a to v závislosti na charakteru vyšetřovaného předmětu. I když je mikroskop znám několik století, dosáhly mikroskopové techniky největšího rozvoje v minulém století. Při vyšetřování vlastností předmětu pomocí optické (světelné) mikroskopie se využívá elektromagnetické záření jehož vlnová délka se nachází v oblasti vlnových délek zhruba od 180 nm do 1300 nm. Při interakci elektromagnetického záření s vyšetřovaným předmětem dochází ke změně charakteristik záření, kterými jsou: amplituda, polarizace, fáze a frekvence (vlnová délka). Elektromagnetické záření také silově působí na vyšetřovaný předmět a tohoto jevu lze např. využít pro manipulaci s mikroskopickými objekty (optická pinzeta). Jedním z úkolů mikroskopu je kvalitně a věrně zobrazit vyšetřovaný předmět a poskytnout pozorovateli co nejvíce informací o jemné struktuře předmětu, která je jinak okem nerozlišitelná. Úkolem mikroskopových technik je pak poskytnout pozorovateli hlubší a podrobnější kvantitativní informace o struktuře vyšetřovaného předmětu. Je zde třeba zdůraznit, že kvalita získaných informací je zcela závislá na kvalitě optických soustav (objektivů, okulárů, kondenzorů, filtrů apod.) použitých v daném mikroskopu. Mikroskopové metody Mikroskopové metody se vyvíjely postupně a v řadě případů byl jejich rozvoj podmíněn stavem vědy a techniky v daném časovém období. Fyzikálním základem řady mikroskopových metod je princip superpozice elektromagnetických polí jejichž vlastnosti jsou ovlivňovány jednak vyšetřovaným předmětem, jednak řízeným zásahem do vlastností pole (amplituda, polarizace, fáze, frekvence) v závislosti na dané mikroskopové metodě.
Mezi první mikroskopové metody patřilo barvení biologických preparátů vhodnými barvivy, což způsobilo ovlivnění amplitudy světla prošlého preparátem, který pak byl snadno pozorovatelný a jeho jednotlivé struktury byly vzájemně barevně rozlišeny. Nevýhodou tohoto způsobu bylo to, že při procesu barvení byly biologické preparáty většinou usmrceny. Další metodou je tzv. metoda temné pole. Princip metody spočívá v tom, že předmět je osvětlen pomocí kondenzoru se clonou ve tvaru mezikruží (která se nachází v jeho předmětové ohniskové rovině) tak, že numerická apertura světelného svazku vystupujícího z kondenzoru je větší než numerická apertura mikroskopového objektivu použitého k pozorování daného předmětu (kondenzor je centrálně zacloněn). Do objektivu se tedy dostane jen to světlo, které je rozptýleno předmětem. Předmět se pak jeví jako svítící na tmavém pozadí a je dobře viditelný. Pro tuto metodu dodávají firmy speciální kondenzory (paraboloidní nebo kardioidní) pro temné pole, které se zasunou na místo normálního kondenzoru. Metodou obdobnou metodě temného pole je metoda vícebarevného osvětlení, jejíž princip spočívá v tom, že do předmětové ohniskové roviny kondenzoru umístíme clonku např. ve tvaru mezikruží, kde střední část obsahuje filtr propouštějící světlo určité barvy (např. zelený filtr) a vnější část obsahuje filtr propouštějící světlo jiné barvy (např. červený filtr). Předmět se pak jeví červeně zabarvený na zeleném pozadí. Průměr středního filtru musí být zvolen analogicky jako u metody temného pole. Metoda šikmého osvětlení je další metodou, která nám umožňuje zkontrastnit pozorovaný předmět. Její princip spočívá v tom, že do předmětové ohniskové roviny kondenzoru umístíme clonku s kruhovým otvorem vhodného průměru, jehož střed leží mimo optickou osu kondenzoru a kterou lze volně otáčet. Na předmět pak z kondenzoru dopadá šikmý svazek pod určitým směrem, což má pro pozorovatele ten efekt, že se mu předmět jeví plasticky a je dobře viditelný. Vhodným natočením clonky a vhodnou volbou průměru otvoru v clonce lze tento efekt optimalizovat pro daný předmět. Tuto metodu lze snadno realizovat u mikroskopů opatřených tzv. velkým Abbeho osvětlovacím aparátem (kondenzor doplněný vysunovací irisovou clonou). Významným krokem vpřed bylo, když v roce 1934 prof. Frits Zernike objevil metodu fázového kontrastu, za což dostal v roce 1953 Nobelovu cenu. Princip metody spočívá v cílené změně fáze vlnového pole (nejčastěji kvasimonochromatického) neovlivněného vyšetřovaným předmětem, vzhledem k fázi pole ovlivněného tímto předmětem. Pomocí této metody dosáhneme kontrastního obrazu fázového předmětu tj. předmětu, který prakticky neovlivňuje amplitudu vlnového pole, které jím prochází, ale ovlivňuje pouze jeho fázi (např. bakterie, buňky apod.). Výhodou této metody je, že nepoškozuje živé biologické objekty a umožňuje jejich pozorování v čase. Kombinujeme-li metodu fázového kontrastu s metodou šikmého osvětlení, získáme tzv. metodu reliefního fázového kontrastu. Metoda fázového kontrastu vyžaduje většinou speciální objektivy a kondenzor. V současné době nabízí řada firem ke svým mikroskopům zařízení pro fázový kontrast, která se svým technickým provedením značně liší a pozorujeme-li tentýž fázový předmět metodou fázového kontrastu na mikroskopech různých firem, nebude výsledný obraz vždy stejný.
Hoffmanův modulační kontrast je další metodou, která umožňuje dosáhnout zvýšení kontrastu obrazu pozorovaného předmětu. Princip metody spočívá v tom, že pomocí speciální clony nacházející se v předmětové ohniskové rovině kondenzoru a amplitudového filtru v obrazové ohniskové rovině objektivu je ovlivňováno (modulováno) množství přímého světla propuštěného objektivem. Další metodou, která doznala velkého rozšíření a popularity, je metoda interferenčního kontrastu. Princip metody spočívá v tom, že spolu necháme interferovat dvě (nebo více) vlnová pole (buď kvasimonochromatická nebo polychromatická), z nichž první (tzv. předmětové pole) interaguje s vyšetřovaným předmětem a druhé pole je referenční. Je-li referenčním polem mírně modifikované předmětové pole, potom mluvíme o tzv. difereciálním interferenčním kontrastu. V případě dvou polí mluvíme o dvousvazkové interferenci (nejvíce užívané), v případě více polí o vícesvazkové interferenci. Nejrozšířenější metodou v mikroskopii je Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC Nomarski). Pozorování objektů v polarizovaném světle je základem polarizační mikroskopie, která nachází široké uplatnění zejména v mineralogii. Pozorujeme-li dvojlomný objekt v bílém světle a umístíme-li jej mezi dva polarizátory, jejich propustné směry spolu svírají nějaký úhel, potom se nám předmět jeví v různých místech různě zabarven v závislosti na tom, jak velký je dvojlom v daném místě předmětu. Klasický mikroskop zobrazuje vždy celý objem předmětu, přičemž ostrá (dostatečně kontrastně zobrazená) je jen určitá objemová vrstva tohoto předmětu, jejíž tloušťka závisí na hloubce ostrosti mikroskopového objektivu a akomodační hloubce ostrosti pozorovatelova oka. Ostatní části jsou neostré a pozorovatel musí provádět zaostření (posunem objektivu vůči předmětu), chce-li pozorovat jinou vrstvu předmětu. Do pozorovatelova oka se však dostává světlo i z jiných částí předmětu a obraz je tedy zatížen šumem. Tuto nevýhodu klasického mikroskopu odstraňuje konfokální mikroskop, který umožňuje ostře zobrazit vždy jen určitou, velmi tenkou, vrstvu předmětu. Zobrazení této vrstvy je zatíženo šumem mnohem méně, než v případě klasického mikroskopu. Toho je dosaženo tím způsobem, že je předmět osvětlen prakticky bodovým zdrojem a v obrazové rovině objektivu je umístěna dírková clona (velmi malého průměru), která propustí jen světlo pocházející z té vrstvy předmětu, která se nachází v předmětové rovině mikroskopového objektivu. Můžeme tak skenováním svazku vystupujícího z mikroskopového objektivu (pomocí vhodného skenovacího systému) a jeho postupným zaostřováním zobrazit jednotlivé vrstvy předmětu a poté provést např. jeho počítačovou rekonstrukci. Fluorescence je jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po ozáření (excitaci) světlem určité vlnové délky.excit vyzařují (emitují) světlo jiné vlnové délky.emit >.excit. Ze zdroje světla je pomocí tzv. excitačního filtru propuštěno pouze světlo určité vlnové délky.exci, které dopadá na vyšetřovaný vzorek. Zde dochází k fluorescenci, přičemž vzorek emituje světlo o vlnové délce.emit >.excit. Pomocí tzv. bariérového filtru je do oka pozorovatele propuštěno jen světlo emitované vzorkem a oko vidí jen ty části vzorku, které emitují světlo o vlnové délce.emit.
Využití tohoto jevu v mikroskopii se stalo základem tzv. fluorescenční mikroskopie, která nachází široké uplatnění zejména v oblasti přírodních věd a v medicíně. Pokud např. na jednu protilátku navážeme fluorescein (emituje zelené světlo při excitaci modrým světlem) a na jinou rhodamine (emituje červené světlo při excitaci žluto-zeleným světlem), pak můžeme porovnávat vzájemné pozice různých molekul ve stejné buňce apod. Nevýhodou klasického fluorescenčního mikroskopu je, že části vzorku nad a pod zaostřenou rovinou jsou také excitovány a světlo pocházející z těchto oblastí přispívá k rozmazání obrazu. Dalším jevem s kterým se setkáváme je tzv. fotovybělování (Photobleaching), při kterém fluorofor trvale ztrácí schopnost emitovat záření. To se děje při intenzivním ozáření fluoroforů, ve kterých dochází k nevratným strukturním změnám vedoucím až k úplnému vyblednutí. Spojení totálního odrazu světla na rozhraní dvou prostředí s fluorescencí je základem další mikroskopové metody zvané TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy). Princip metody spočívá v tom, že při totálním odrazu světla na rozhraní dvou různých prostředí proniká část světla z prvního prostředí do druhého prostředí, přičemž hloubka průniku je velmi malá. Nachází-li se v tomto prostoru nějaký objekt, pak nastává rozptyl světla na tomto objektu a daný objekt můžeme pozorovat. Je-li v objektu obsažen fluorofor citlivý na extitační světlo, pak dochází k fluorescenci. Objekty nacházející se mimo oblast průniku světla nejsou pozorovatelné. Metoda umožňuje zobrazit i takové objekty, jejichž velikost leží pod mezí rozlišení použitého mikroskopového objektivu. GFP Zelený fluorescenční protein (Green fluorescent protein) Funkce a chování proteinů je výrazně ovlivněno navázáním specifických protilátek. Proto je tento přístup využíván pro pozorování statického rozmístění proteinů a je uplatněn hlavně na zafixovaných (mrtvých) buňkách. Navíc při použití protilátek v živých buňkách je nutné zajistit jejich zavedení do buněk, ke kterému se nejčastěji používá mikroinjekce. Protože navázání protilátky změní a často úplně potlačí skutečnou úlohu proteinu, je tento postup užíván hlavně při zkoumání vlivu inhibice tohoto proteinu na chování buňky. Za účelem studia dynamického chování proteinů byla vyvinuta technika, při které je buňka geneticky pozměněna tak, že produkuje fluorescenční formu daného proteinu. Tato technika využívá vlastností GFP. FRAP Obnovení fluorescence po fotovybělení (Fluorescence Recovery After Photobleaching) K analýze dynamiky proteinů se využívá těchto GFP-fúzních proteinů, které se vybělí uvnitř vybrané oblasti v buňce. Difúzí nevybělených proteinů do vybělené oblasti dochází k postupnému obnovení fluorescence v této oblasti a z měření rychlosti obnovení fluorescence v této oblasti lze získat řadu informací o pohybu daného proteinu. Tato metoda se nazývá FRAP. V posledních letech navíc dochází k vývoji fotoaktivovatelných forem GFP (PA- GFP), které naopak umožňují fotoaktivovat (UV zářením) GFP molekuly ve vybraných místech v buňce. FRET Fluorescenční rezonanční přenos energie (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Tato technika umožňuje studovat interakci mezi dvěma různými molekulami (proteiny). Tyto molekuly jsou označeny odlišnými fluorochromy, které jsou zvoleny tak, aby se emisní spektrum jednoho z nich překrývalo s excitačním spektrem druhého. Pokud tyto
molekuly vzájemně reagují a jejich fluorochromy se dostanou velice blízko (méně než na 4 nm), energie excitovaného světla se může přenést z jednoho fluorochromu na druhý. Tedy při osvícení komplexu excitačním světlem prvního fluorochromu dostaneme emisní světlo odpovídající druhému fluorochromu. Obvykle je tato metoda používána s dvěma odlišnými spektrálními variantami GFP například při měření interakce mezi signální molekulou a jejím receptorem. STED (Stimulated Emission Depletion) mikroskopie. Jedná se o fluorescenční mikroskopii umožňující dosáhnout rozlišení (30 nm) vyšší než je klasická mez (0,6./NA). Princip metody spočívá v tlumení fluorescence excitovaných molekul v krajních partiích stopy (rozptylové funkce) skenujícího laserového svazku a to pomocí dvou časově synchronizovaných a prostorově koincidujících (souosých) laserových pulsů z nichž první (excitační) provádí excitaci fluorochromů a druhý (STED puls) tlumí (ochuzuje) saturací emisi. K tlumení emise dochází v okrajových partiích stopy excitačního svazku, její střed však není tlumen. Dochází tak k podstatnému zmenšení fluorescenční stopy a tím k výraznému zvýšení rozlišení (Point Spread Function engineering). Holografická mikroskopie je další metodou v mikroskopii, která nám umožňuje provést záznam vlnového pole modulovaného vyšetřovaným předmětem a poté provést jeho rekonstrukci. Princip holografie spočívá v tom, že vyšetřované vlnové pole necháme interferovat s nějakým známým vlnovým polem (referenčním polem). Takto vzniklé interferenční pole zaznamenáme na detektor (fotografická deska, CCD senzor apod.) a získáme tak interferogram, který je trvalým záznamem vyšetřovaného vlnového pole. Z tohoto interferogramu pak můžeme vyšetřované pole kdykoliv zrekonstruovat a to buď fyzicky nebo digitálně. Takto zrekonstruované vlnové pole můžeme dále analyzovat a aplikovat na něj různé mikroskopové metody jako např. fázový a interferenční kontrast, temné pole atd. a to v době, kdy již vyšetřovaný předmět není k dispozici. Existuje ještě celá řada dalších mikroskopových metod jako např. 4Pi mikroskopie, FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), FSC (Fluorescence Correlation Spectroscopy), SNOM (Scaning Near-field Optical Microscopy) atd.