16. BIOREMEDIAČNÍ TECHNOLOGIE K ODSTRANĚNÍ POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ ZE ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ

16. BIOREMEDIAČNÍ TECHNOLOGIE K ODSTRANĚNÍ POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ ZE ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ 16.1 Bioremediační technologie 16.1.1 Úvod Během posledních let jsme svědky enormního rozvoje kontrolovaného, praktického využití biologických systémů pro rozkládání chemických polutantů v životním prostředí. Tyto různé technologie jsou závislé na biodegradační aktivitě mikroorganismů a rostlin a jsou zaměřeny na zvýšení již existujícího biodegradačního procesu přímo v přírodě nebo v různých typech reaktorů, kde je umožněn přímý kontakt chemikálie s degradujícími organismy. Oproti chemickým a fyzikálním metodám využitelným pro odstraňování nežádoucích polutantů mají biologické procesy řadu výhod, z nichž lze jmenovat velkou flexibilitu biologických systémů, jednoduchost aplikace a v neposlední řadě nízkou cenu. Za nevýhodu se považuje omezené využití pro odstraňování anorganických sloučenin, delší doba procesu a nutnost detailní charakterizace znečištěné lokality. V dalších kapitolách budou podrobněji probrány jednotlivé bioremediační technologie a podmínky jejich využití. 16.1.2 Obecná charakteristika bioremediace Cílem bioremediace je degradace organických polutantů tak, aby jejich koncentrace byla buď pod hranicí detekčního limitu nebo taková, že by nepřevyšovala koncentrační limit daný příslušnou vyhláškou. Bioremediace lze využít pro čištění půdy, spodních vod, odpadních vod, kalů a plynů. V současné době je počet sloučenin, které mohou podléhat biologické destrukci, značný. Vzhledem k závažnosti účinků některých polutantů na zdraví nebo ekologické riziko se bioremediační technologie v současnosti soustřeďují zejména na degradaci ropy a ropných produktů, polycyklických aromatických uhlovodíků, chlorovaných aromatických a alifatických uhlovodíků a v poslední době se ukazuje i perspektivnost využití těchto technologií pro POPs, konkrétně polychlorované uhlovodíky. Praktické využití biodegračních procesů je však limitováno řadou faktorů, které vlastní proces bioremediace v konkrétním prostředí ovlivňují. Faktory, které ovlivňují úspěšnost použité bioremediační technologie jsou následující: přítomnost organismů (mikroorganismů, rostlin), které jsou schopné efektivně degradovat polutant schopnost těchto organismů transformovat organický polutant akceptovatelnou rychlostí na výslednou koncentraci polutantu povolenou zákonem při degradaci vznik látek (meziproduktů), které by v dosažené koncentraci byly toxické na zkontaminované lokalitě přítomnost dalších chemických látek nebo jejich směsí, které by potlačovaly růst a metabolickou aktivitu degradační mikroflory dostupnost polutantů mikroorganismům na lokalitě zajištění nezbytných podmínek stimulujících růst a degradační metabolismus použitých organismů např. anorganické živiny, kyslík nebo vhodné akceptory elektronů, stopové prvky, vlhkost prostředí, odpovídající teplota, ph, zdroj uhlíku a energie pro růst, induktor katabolické dráhy VII-75

cena technologie musí být nižší nebo při nejhorším stejná jaké cena jiné technologie schopné destruovat cílový polutant. K výše uvedeným faktorům dále přistupují např. možnosti přípravy adaptovaných bakterií se zvýšenou degradační schopností nebo, v posledně době tolik diskutované, využití geneticky modifikovaných bakterií a rostlin Pro dosažení uspokojivých výsledků sanace jsou všechny uvedené faktory stejně významné a nemohou být opomíjeny. 16.1.3 Rozdělení bioremediačních technologií Bioremediační technologie lze rozdělit dle místa jejich aplikace na: in situ, které jsou aplikovány přímo na zkontaminované lokalitě; jsou relativně levné, ale jejich průběh je obtížně kontrolovatelný ex situ, ve kterých je kontaminovaný materiál odstraněn z původní lokality a buď k degradaci dochází na místě odstranění (on site) nebo je odstraněná kontaminovaná matrice převezena na jiné místo kde probíhá vlastní biodegradační proces na dekontaminační ploše nebo v bioreaktoru (off site). Přemisťování kontaminované zeminy či spodní vody sice značně zvyšuje celkové náklady, ale proces je velmi dobře kontrolovatelný. Mezi in situ technologie patří bioventing, podpořená bioremediace (enhancing bioremediation), přirozená atenuace (natural attenuation) a fytoremediace. Ex situ technologie zahrnují bioremediace v suspenzním systému (slurry phase bioremediation), bioremediace v pevné fázi (solid phase bioremediation), do které patří technologie jako jsou land farming a kompostování a jejich modifikace. 16.1.3.1 In situ metody 16.1.3.1.1 Bioventing Metodu lze využít pro pro kontaminanty, které jsou degradovatelné za aerobních podmínek a mají tlak par nižší než 1 atm. Lehce těkající organické látky se spíše odpaří než by byly zdegradovány. Tuto metodu lze aplikovat v prostupné nenasycené půdní zoně, tj. nad vrstvou vody a je založena na zavádění vzduchu do půdy buď metodou přímé injektáže nebo cirkulací přes vakuový extrakční systém (obrázek 16-1). Vháněný vzduch usnadňuje těkání některých organických kontaminantů a souběžně zajišťuje vhodné prostředí pro biodegradaci méně těkavých látek.teplota a ph půdy může významně ovlivnit průběh celého procesu. V současné době byla popsána celá řada variant tohoto procesu, ale základní požadavek tj. zajištění optimálního přísunu vzduchu, a tím i kyslíku, pro degradační procesy aerobní mikroflory přítomné v kontaminované půdě, je ve všech stejná. Přísun vzduchu do nenasycené zony může být prováděn buď přes horizontální nebo vertikální vrty a v některých případech může být bioventing kombinován s extrakcí par z půd, což umožňuje zlepšit kontrolu toku zaváděného vzduchu. VII-76

Metodu lze s výhodou použít pro BTEX, fenol a dále pro TCE, chloroform, DCE, vinylchlorid, chlorbenzen. Není vhodná pro odstraňování tetrachlorethylenu a polychlorovaných bifenylů (PCBs). 16.1.3.1.2 Zlepšená bioremediace (Enhanced bioremediation, Biostimulace) Při této technologii se využívá přímý přídavek živin do půdy, který tím že podporuje růst přítomné přirozené mikroflory, zvyšuje i biodegradaci organických polutantů. Tento postup má řadu nevýhod. Je značně pomalý, velmi těžko se zajišťuje rovnoměrná aplikace živin a kontrola biodegradačního procesu. Současně může docházet i k odplavování organických látek event. těžkých kovů do spodních vod nebo dochází k emisím snáze těkajících organických látek. V těchto případech musí být zajištěna spolehlivá kontrola obou možných procesů. Hlavní výhodou této metody jsou velmi nízké náklady na vybavení a průběh technologie. Obrázek 16-1: Základní schéma bioventingové technologie Další variantou této metody je land farming (viz dále), kdy se stejným způsobem ošetřuje odtěžená půda, což umožňuje lepší kontrolu celého procesu. Obě uvedené metody se s výhodou používají pro odstraňování kontaminace ropou a ropnými uhlovodíky. Pro biodegradaci PCBs není tato metoda vhodná. 16.1.3.1.3 Přirozená atenuace Přirozená atenuace je založená na přirozených metabolických procesech, které probíhají v mikrobiálních a rostlinných buňkách. V průběhu těchto procesů se odstraňují organické polutanty z kontaminovaných míst. Přirozená atenuace byla demonstrována na několika případech čištění spodních vod. Pro její stanovení jsou vyžadovány tři typy informací: VII-77

data z dlouhodobého monitorování cílové lokality, která jasně ukazují, že koncentrace kontaminantu v průběhu sledování klesá; sledování koncentrace musí probíhat dlouhou dobu a sledovaná lokalita musí být podrobně charakterizována koncepční a prediktivní model k dosažení přirozené atenuace stanovení rizika pro ekosystém a pro lidskou populaci Pokles koncentrace cílového polutantu během sledované doby může mít řadu důvodů, z nichž jenom jeden je kompletní mineralizace. Důvody jsou odpařování, adorpce na částice půdy, biotransformace, chemická a fotochemická oxidace. Přirozenou atenuaci lze využít pouze pro biodegradovatelné organické látky. Bylo navrženo několik prediktivních modelů, které by mohly umožnit předpovědět biodegradabilitu různých organických látek, ale žádný z nich nám dosud neumožňuje spolehlivou předpověď zda bude sledovaný polutant mineralizován a jaké intermediáty metabolismu se budou v průběhu procesu hromadit. Tyto modely jsou založeny na fyzikálních a termodynamických vlastnostech polutantů event. na bioakumulaci a rychlosti biodegradace polutantů za laboratorních podmínek. Koncepční modely jsou spíše založeny na konkrétních znalostech biochemických procesů podílejících se na biodegradaci než na degradační kinetice a přenosu hmoty polutantu. Přirozenou atenuaci ovlivňuje řada faktorů jako je původ polutantu jeho biodegradabilita, rozpustnost, koncentrace a toxicita. Dále pak celková charakteristika kontaminovaného místa tj. vlastnosti půdy, velikost částic, ph, teplota, přítomnost těžkých kovů a jiných toxických látek. V neposlední řadě potom i vlastnosti přítomné mikrobiální populace, přítomnost příslušných katabolických genů. Do dnešní doby byla přirozená atenuace využita převážně pro halogenovaná rozpouštědla a ropné uhlovodíky. Mezi další polutanty, které mají předpoklady pro přirozenou atenuaci patří chlorbenzeny, chlorfenoly, chlorbenzoáty a PCBs. PCBs jsou dehalogenovány kometabolicky za methanogenních podmínek. Bylo popsáno již několik případů tohoto procesu. Mineralizace takto vzniklých nízkochlorovaných kongenerů je v zásadě možná. Jak ukazují i poslední výzkumy, do přeměny PCBs jsou zahrnuty i rostliny jejichž produkty uvolňované do půdy mohou také stimulovat degradaci PCBs. Výhoda přirozené atenuace spočívá v minimálních nákladech, ale celý proces je dlouhodobý a může trvat i několik let a vyžaduje důsledný kontrolní systém. 16.1.3.1.4 Fytoremediace Fytoremediace je definována jako užití zelených rostlin k přesunu, akumulaci a odstranění polutantů z životního prostředí nebo zmírnění jejich škodlivého šíření. V mnoha studiích bylo prokázáno, že rostliny jsou schopné akumulovat a přeměňovat anorganické i organické polutanty. Mezi anorganické látky znečišťující životní prostředí patří především těžké kovy mangan, zinek, kobalt, olovo, kadmium a z organických látek jsou to ropné uhlovodíky, muniční odpady (TNT, DNT), nitrosloučeniny nebo chlorovaná rozpouštědla (TCE, PCE), bojové chemické látky, polyaromatické uhlovodíky, chlorované pesticidy, organofosfátové insekticidy (parathion) a polychlorované uhlovodíky. Pro účinnou fytoremediaci je důležité, aby znečišťující látky byly snadno dostupné kořenovému systému rostlin, který tyto látky dále transportuje do rostlinných tkání, kde jsou přeměňovány a ukládány. Na celém procesu se podílejí také mikroorganismy, které žijí v symbióze s rostlinami, zejména v oblasti rizosféry kořenové části rostlin. VII-78

Rostliny při dekontaminaci uplatňují několik mechanismů:. přímou absorpci kořeny, následný přesun do rostlinné tkáně a akumulaci ve formě nefytotoxických metabolitů; některé rostliny absorbují organické látky přímo z kontaminované půdy; nerozpustné látky se většinou váží pevně na povrch kořenů, látky s vyšší rozpustností jsou transportovány přímo do rostlinných tkání, kde mohou být různými detoxikačními mechanismy přeměňovány na nefytotoxické sloučeniny a dále pak ukládány např. do vakuol nebo ve formě ligninu do buněčné stěny (obrázek 16-2). uvolňování enzymů do prostředí, které podporují mikrobiální aktivitu a biochemickou transformaci v půdě; ve vzorcích půd z kontaminovaných míst bylo identifikováno pět enzymových systémů, které se pravděpodobně podílejí na transformaci organických látek v životním prostředí. Patří mezi ně dehalogenasy, reduktasy organických sloučenin, peroxidasy, lakasa (fenoloxidasa) a nitrilasy. zvýšenou mineralizací látek v rhizosféře, která je typická pro činnost hub a mikrobiálních konsorcií; v kořenovém systému rostlin je obvykle přítomno nejvíce bakterií (asi 10 6-10 8 ) a dále asi 10 5 aktinomycet a 10 3 hub na gram půdy. Rostliny napomáhají mikrobiální mineralizaci v rhizosféře tím, že uvolňují do půdy látky, které mohou sloužit mikroorganismům jako zdroj uhlíku a energie pro kometabolismus organických látek znečišťujících životní prostředí. Rostlinné exudáty obsahují hlavně enzymy, alifatické a aromatické látky (fenoly, terpeny, flavonoidy), aminokyseliny a cukry. Některé z těchto látek mohou působit též jako induktory bakteriálních drah degradace některých organických xenobiotik (např. PCBs). X GSH 1 X-SG ATP X ADP+P i Vakuola transformace X CP450 X X- UDP-glukosa 2 X-glc ATP ADP+P i? 3 ER První fáze Druhá fáze Třetí fáze Obrázek 16-2: Mechanismus transformace organických polutantů v rostlinných buňkách X.organické xenobiotikum ER endoplazmatické retikulum GSH glutathion CP450 cytochrom P450 VII-79

Rostliny používají pro transformaci polutantů, na rozdíl od mikroorganismů, zcela odlišné mechanismy. Ty můžeme rozdělit dle způsobu uplatnění: Fytoextrakce (fytoakumulace) založená na schopnosti rostlin přijímat a akumulovat škodlivé látky ve svých kořenech i nadzemních částech. Transformace (fytodegradace) je přímá degradace organických polutantů na méně toxické nebo netoxické sloučeniny. Rhizosférní degradace využívá činnosti rostlin a mikroorganismů. Rhizofiltrace, při které dochází k adsorpci nebo absorpci polutantů, přítomných v nejbližším okolí, do kořenů rostlin. Tento mechanismus je podobný fytoextrakci, ale používá se pro odstranění polutantů ze spodních vod, spíše než z půdy. Pokusy mohou být prováděny in situ nebo je voda přečerpána do speciálních nádrží vyplněných kořeny příslušných rostlin. Předpěstovávané rostliny žijí ve vodných prostředích s nízkou hladinou kontaminace a až po určité době jsou přesazeny přímo na kontaminované místo. Z mnoha testovaných rostlin se jako jedny z nejúčinnějších ukázaly hydroponicky pěstované slunečnice, např. využívané k odstranění radionuklidů z povrchové vody v okolí Černobylu. Fytostabilizace napomáhá stabilizovat kontaminované místo, snaží se omezit rozšiřování polutantů např. erozí nebo prosakování do spodní vody jejich pevnější vazbou na půdní částice. Používá se při rekultivacích kontaminovaných ploch, kde přes poměrně nízké hladiny koncentrací polutantů neroste přírodní vegetace. Převedení do plynné fáze, kdy některé polutanty procházejí rostlinou do listů a vypařují se do atmosféry ve stejné nebo částečně modifikované formě. Jak bylo prokázáno u topolů, 90 % TCE (trichlorethylenu) odebraného z půdy bylo odpařeno. Užití rostlin pro odstranění polutantů ze vzduchu, které využívá schopnosti některých rostlin vázat polutanty přítomné v ovzduší na povrch listů např. schopnost vázat olovo zachycené z benzínových zplodin Fytoremediace může být aplikována při odstraňování anorganických i organických polutantů přítomných v pevných částech (půda), kapalných částech (voda) a ve vzduchu. Je také známo, že fytoremediace je nejlépe využitelná na velkých plochách, kde kontaminace dosahuje maximálně do 5 metrů hloubky. Výhodou fytoremediace je její vysoká efektivita, produkce biomasy může dosáhnout až 100 tun na hektar plochy za rok. Při růstu rostlin nedochází k poškozování životního prostředí, jelikož nejsou potřeba těžké stroje ani převoz zeminy. Používání fytoremediace je též akceptováno veřejností. Nevýhodou fytoremediace je negativní ovlivnění jejího průběhu a výsledné kontaminace různými vlastnostmi půdy a životními podmínkami v místě znečištění. Struktura půdního profilu, ph, koncentrace solí, polutantů a přítomnost dalších toxínů - tyto faktory mohou být limitující s ohledem na toleranci použité rostliny. Kontaminanty se mohou hromadit v listech a mohou být znovu uvolňovány (např. při opadávání listů) do prostředí. V některých případech se zvyšuje rozpustnost polutantů a může dojít k jejich rozšíření do okolního prostoru Fytoremediace je také pomalejší než běžné jiné biologické či fyzikální a chemické metody, a proto je nutné uvážit i časové hledisko při výběru metody. Některé limitující faktory fytoremediace by mohly být odstraněny s použitím geneticky modifikovaných rostlin. Takové rostliny by byly získávány transformací po vložení specifických genů pro tvorbu bílkovin nebo peptidů, které se účastní vazby a transportu xenobiotik nebo zvýšením produkce a aktivity rostlinných bidegradačních enzymů a zajištění jejich přednostního transportu do rhizosféry a podpory půdních bakterií, které žijí v nejbližším okolí rostlinných kořenů. VII-80

Lze tedy říci, že fytoremediace je metoda při níž dochází k odstraňování xenobiotik šetrně a poměrně levně ve srovnání s fyzikálně-chemickými metodami. V příštích letech by se mohla stát velmi využívanou metodou díky výhodám jež poskytuje. Americká Společnost rostlinné fyziologie (ASPP) vypočetla před několika lety, že zavedené způsoby dekontaminace půdy stojí přibližně 1000 dolarů/1 tunu půdy, zatímco přečištění pomocí fytoremediace vyjde na 30 dolarů za tunu půdy. Tato čísla jsou průměrná a v každém jednotlivém případě je potřeba přihlédnout k různým faktorům, jako jsou typ polutantu, půdní typ a rozloha kontaminovaného místa atd. I přesto je fytoremediace významně levnější než běžné metody. Mezi zatím nejpoužívanější typy fytoremediace patří fytoextrakce, hlavně pro transport a akumulaci kovů z půdy, a rhizofiltrace, při které kořeny rostlin rostoucích ve vodě absorbují přítomné polutanty. Přímo pro tyto dvě metody připravený rozpočet ukázal, že je potřeba počítat s 25 100 dolary za tunu přečištěné půdy a 0,6 6,0 dolaru /1000 galonů (3 785 l) znečištěného vodního systému. Oblasti kontaminované určitým typem organických látek nebo anorganických látek, vyžadují specifický typ rostlin nebo větší počet rostlin ve skupině. Často se používá vojtěška pro svojí schopnost fixovat dusík a vlastnostem kořenů, které zasahují do vhodné hloubky. Dále se pro fytoremediace osvědčily stromy z rodu Salicaceae (topoly a vrby), které jsou značně odolné a relativně rychle rostou. Řebříček vodní (vodní mor kanadský) byl využit pro odstraňování škodlivých látek za spodních vod. 16.1.3.2 Ex situ metody 16.1.3.2.1 Bioremediace v suspenzním systému (slurry phase bioremediation) Tato technologie byla úspěšně aplikována na dekontaminaci půd a kalů. Polutanty k jejichž odstranění byl použit tento systém jsou následující: polyaromatické uhlovodíky, pesticidy, ropné uhlovodíky, heterocyklické a chlorované aromatické sloučeniny. Poměrně široký rozsah látek, které lze tímto způsobem odstraňovat ze životního prostředí, se odráží i v řadě konkrétních případů kdy byla technologie použita. V modifikaci in situ, bioremediace v suspenzi v laguně (slurry lagoon bioremediation), byla při čištění dosažena koncentrace pro vinylchlorid menší než 5 ppm a celkový obsah PCBs, benzenu a benzo[a]pyrenu byl nižší než 10 ppm. Obvykle je technologie v suspenzním systému prováděna jako vsádkový proces v reaktoru, kterým může být laguna, otevřené nádoby nebo uzavřený systém. Prvním krokem při čištění je odtěžení půdy, odstranění velkých kamenů a příprava vodní suspenze (60-95 váhových %). Po ukončení bioremediace se oddělí vodní a pevná fáze. Různé typy suspenzních reaktorů se od sebe liší ve způsobu okysličování a způsobem míchání suspenze. Výhody této bioremediační technologie spočívají v možnosti lepší a efektivnější kontroly procesu, zajištění zvýšené rozpustnosti organických látek, homogenizaci pevných částic v suspenzi, zlepšeném kontaktu mezi mikroorganismy a kontaminanty. Probíhá-li bioremediace v uzavřeném systému lze zvýšit rozpustnost látek přídavkem surfaktantu a k urychlení procesu přispívá i dodávání živin a jejich lepší distribuce event. přídavek vhodných mikroorganismů. Nevýhodou technologie jsou vyšší nároky na energii, nutnost přemísťování zeminy a její úprava a separace vodního a pevného podílu suspenze v závěru procesu. Finančně je tento způsob remediace náročnější než landfarming a kompostování, ale je mnohem levnější než fyzikální způsoby dekontaminace a navíc je rychlejší. 16.1.3.2.2 Bioremediace v pevné fázi (solid phase bioremediation) Land farming technologie se obvykle provádí přímo v povrchových vrstvách půdy (in situ - viz Obrázek 16-3) anebo na separovaných dekontaminačních plochách. Kontaminovaná půda je VII-81

dostatečně pohnojena N-P-K hnojivem, provlhčena a rozprostřena na nepropustnou podložku tak, aby se vrstva zeminy pohybovala v rozmezí 40-60 cm. Při dostatečné katabolické aktivitě mikroorganismů přirozeně osidlujících kontaminovanou zeminu se neprovádí žádná další inoulace mikroorganismy. Půda je v průběhu dekontaminace provzdušňována přehazováním. Průběžně se kontroluje vlhkost půdy, koncentrace živin a koncentrace polutantu. Technologie byla použita pro čištění různých typů odpadů a pro odstraňování nebezpečných chemikálií. Pro půdy kontaminované BTEX a PCBs lze využít pro dekontaminaci vanový reaktor (bed reactor) (obrázek 16-3). Ten je umístěn v hale opatřené filtry pro zachycování případně vznikajících, potenciálně toxických, těkavých produktů metabolické aktivity mikroorganismů. Kontaminovaná půda nebo kal je umístěn do uzavřené vany (lože) s drenáží, která odvádí nebezpečný výluh pro další zpracování např. v bioreaktorech. Kontaminovaná půda je vzdušněna systémem trubek aeračního zařízení. Nad vanou je umístěn zavlažovací systém, který umožňuje případné dodávání dalších živin nebo mikrobiální suspenze s odpovídající katabolickou aktivitou. Obrázek 16-3: Schéma vanového reaktoru (bed reactor) Obě uvedené technologie mohou být použity i pro sanaci kontaminovaných vod, kdy je voda nastřikována na půdu, ve které probíhá vlastní degradace polutantu. Při kompostování je kontaminovaný materiál míchán s organickým materiálem (sláma, piliny, kůra aj.) a obohacen zdrojem N a P, případně dalšími anorganickými živinami. Materiál může být uložen rotačních bubnech, cirkulačních tancích, otevřených nádobách, silech nebo na otevřené hromadách (biopiles) nebo záhonech (windrow composting). V průběhu kompostování je materiál pravidelně vlhčen a vzdušněn přehazováním, otáčením nebo vzdušnícím systémem. Teplota během procesu je obvykle okolo 50-60 o C. Proces může probíhat za aerobních nebo anaerobních podmínek. Během posledních 25 let se kompostování stalo jednou ze základních technologií pro čištění městských odpadů. Dále bylo popsáno využití této technologie pro odstraňování těžkých olejů, polyaromatických uhlovodíků, chlorovaných fenolů a výbušnin (TNT, RDX, HMX). 16.1.4 Závěr Všechny dosud popsané a používané bioremediační technologie nemají obecné, široké použití. Při hledání metody pro odstraňování polutantů s určité lokality je nutné vycházet z kompletní charakterizace znečištěné lokality a zvážit celou řadu kriterií, na jejichž základě lze vybrat metodu vhodnou pro určitý případ. S ohledem na cílový kontaminant se při výběru vhodné remediační metody sledují zejména celkové náklady na proces, minimální dosažitelná koncentrace polutantu, spolehlivost, účinnost metody, náklady na úpravy po ukončení bioremediace, a také další možné využití vyčištěné VII-82

půdy. Mimo tato kriteria je nutné brát do úvahy i to, jak by bylo zavedení vybrané metody akceptováno širokou veřejností. 16.2 Polychlorované bifenyly 16.2.1 Úvod Vzhledem k fyzikálně-chemickým vlastnostem je degradace PCBs fyzikálně - chemickými metodami značně náročná, a hlavně drahá. Jednou z možných metod je spalování PCBs ve vysokých martinských pecích za vysokých teplot (nad 1 300 C). V podmínkách, které jsou v současné době v České republice, je tento postup prakticky nerealizovatelný. Hlavním důvodem je nutnost udržení konstantní teploty, aby spalováním nedošlo ke vzniku ještě toxičtějších látek - dioxinů, tento požadavek s sebou nese značnou finanční náročnost celé technologie. Alternativní využití mikroorganismů (vhodnými adepty bioremediace jsou některé druhy půdních bakterií a ligninolytických hub a některých druhů rostlin) se jeví jako ekologicky šetrné a z hlediska finančních nákladů výhodné řešení. 16.2.2 Bakteriální degradace PCBs Mikroorganismy, a to především aerobní a anaerobní bakterie, byly studovány jako jedny z prvních organismů s ohledem na jejich schopnosti degradovat PCBs (původně považováné za látky vůči mikrobiální transformaci rezistentní). Za anaerobních podmínek podléhají PCBs redukční dechlorinaci, při které dochází k odstraňování chloru z více chlorovaných kongenerů v polohách meta a para, čímž dochází ke snižování toxicity a ke kumulaci ortho-chlorovaných mono-, di- a trichlorbifenylů. Chlor je na bifenylovém jádře nahrazen vodíkem. Vzniklé níže chlorované kongenery mohou být degradovány aerobními bakteriemi. Při tomto aerobním metabolismu dochází k oxidačnímu ataku bifenylového jádra a k jeho následnému rozštěpení za vzniku chlorbenzoových a 5-C chloralifatických kyselin. Některé bakterie jsou schopné za aerobních podmínek degradovat PCBs na vodu a kysličník uhličitý. Ačkoliv monochlorbifenyly mohou pro některé druhy bakterií sloužit jako zdroj uhlíku a energie, kongenery obsahující dva a více atomů chloru jsou transformovány prostřednictvím kometabolismu. Při kometabolismu slouží např. bifenyl jako zdroj uhlíku a zároveň jako induktor enzymů degradační dráhy PCBs. Úplná mineralizace PCBs vyžaduje přítomnost dvou sad genů, které kodují transformaci PCBs na chlorbenzoáty, respektive degradaci chlorbenzoátů. V přírodě se tyto sady genů obvykle nevyskytují v jednom organismu, a proto pro kompletní mineralizaci je nutná přítomnost více bakteriálních kmenů. S hlediska praktického využití to pro biodegradaci PCBs znamená aplikaci směsných kultur. V naší laboratoři byla experimentálně, za optimalizovaných podmínek (poměr počtu buněk obou kmenů, doba jejich inokulace apod.), ověřena účinnost aplikace směsi bifenylového a chlorbenzoátového kmene na degradaci PCBs. Vytvořením mikrokosmu kmenů bakterií schopných degradovat kongenery PCBs a chlorbenzoáty lze dosáhnout mineralizace 2-chlor-; 3-chlor-; 4-chlor-; 2,4-dichlor- nebo 3,5-dichlorbifenylů. Avšak aplikace této směsi bakterií na kontaminovanou půdu nebo vodu v reálných podmínkách nezaručuje dodržení stejných podmínek a tudíž i dosažení uspokojivých výsledků. Jednou z dalších možností je příprava rekombinantních kmenů bakterií nesoucích kompletní genetickou výbavu nutnou pro degradaci PCBs. Takové kmeny byly sestrojeny v několika laboratořích, ale jejich použití naráží na na řadu problémů. Mimo stabilitu kmene a schopnost přežití těchto buněk v reálných podmínkách v soutěži s běžnou mikroflórou, je to i legislativa, která by užívání takových kmenů povolila. VII-83

16.2.2.1 Metabolická dráha PCBs Zásadní a také nejprostudovanější metabolickou dráhou aerobní degradace bifenylu a PCBs půdními bakteriemi je čtyřstupňový proces (bph operon) zahajovaný oxidací v nesubstituovaných polohách 2 a 3 (nebo 5, 6) nechlorovaného nebo méně chlorovaného kruhu (I) (obrázek 16-4). Tento iniciační krok realizuje enzym bifenyl-2,3-dioxygenasa. Vzniklý intermediát je dehydrogenován bifenyldihydrogendiol-dehydrogenasou na 2,3-dihydroxybifenyl, který podléhá tzv. meta-štěpení 2,3- dihydroxybifenyl-dioxygenasou. Tento třetí krok je klíčový pro degradaci PCBs, protože dochází k otevření bifenylového kruhu. V posledním kroku katalyzovaného hydroxylasou dochází ke vzniku chorbenzoátu a pentadienové kyseliny. Bifenyl-2,3-dioxygenasa je rozhodující enzym při degradaci PCBs, protože jeho specifita určuje pořadí degradovatelnosti jednotlivých kongenerů. Na základě tohoto zjištění vyvodil Furukawa pět základních principů degradace PCBs, založených na vztahu mezi strukturou kongenerů a jejich biodegradabilitou: biodegradabilita klesá se stoupajícím počtem atomů chloru, dva atomy chloru v polohách ortho (tzn. 2,6- a 2,2 -) zvyšují rezistenci k biotransformaci, kongenery s nesubstituovaným kruhem jsou obecně transformovány rychleji než kongenery se substitucí na obou kruzích, tetra- a pentachlorbifenyly jsou transformovány mnohem snadněji, když jeden z kruhů je substituován v polohách 2 a 3, iniciační oxidace obvykle probíhá na méně substituovaném kruhu. Poloha substituentů na metabolizovaném kruhu zvyšuje účinnost biodegradace v pořadí: ortho > meta > para. VII-84

I bpha O2 II H H bphb NAD + NADH + H + III bphc O2 O CO IV bphd H 2 O + CO V+ VI CO Obrázek 16-4: Metabolická dráha bifenylového operonu (bph) VII-85

Touto cestou dochází k transformaci méně substituovaných kongenerů. Byly však isolovány a popsány bakteriální kmeny schopné degradovat široké spektrum PCBs: Acinetobacter sp. P6, Corynebacterium sp. MB1, Alcaligenes eutrophus H850 a Pseudomonas sp. LB400. Kmen Acinetobacter sp. P6 při růstu na bifenylu nebo 4-chlorbifenylu může oxidovat široké spektrum PCBs kongenerů (tetrachlorbifenyly, některé pentachlorbifenyly a hexachlorbifenyly). Mohou být oxidována i některá disubstituovaná jádra, významná jsou ta se substitucí v polohách 2,3 a 3,4, ale žádný z těchto kmenů není schopen oxidovat jádra trisubstituovaná. Bakteriální kmeny Alcaligenes eutrophus H850 a Pseudomonas sp. LB400 byly vyizolovány v různých obdobích a z různých lokalit, přesto mají nápadně podobné kongenerové specifity. Oba kmeny vykazují velkou schopnost degradovat kongenery se substitucí v polohách 2; 2,4; 2,5; 2,3,6 a 2,4,5. Díky tomu degradují mnoho tetra- a pentachlorbifenylů a některé hexachlorbifenyly. Kromě toho však mohou oxidovat i 2,5,2,5 tetrachlorbifenyl, tedy kongener, který má substituované 2,3 polohy, což vedlo k závěru, že kromě 2,3- dioxygenasy mají tyto dva kmeny ještě 3,4-dioxygenasu. Kongenerová selektivita 3,4-dioxygenasy je odlišná od 2,3-dioxygenasy, a proto pro tuto cestu platí odlišné obecné principy založené na vztahu mezi strukturou kongeneru a jeho biodegradabilitou: tetra- a pentachlorbifenyly substituované v polohách 2,5 jsou degradovány více než méně chlorované kongenery substituované v obou para polohách (polohy 4,4 ), mnoho di-ortho-substituovaných kongenerů (2,2 -dichlor-; 2,3,6- a 2,5,2 -trichlor- a 2,5,2,5 tetrachlorbifenyly) a několik tri- a tetra-ortho-substituovaných kongenerů (2,4,6,2,5 pentachlor-; 2,3,5,6,2,5 - a 2,3,6,2,3,6 -hexachlorbifenyly) je degradováno rychleji, vícechlorované bifenyly substituované v polohách 2 a 3 jsou méně přístupné k degradaci než ty, které jsou substituované v polohách 2 a 5, kongenery s nesubstituovaným kruhem jsou obecně transformovány rychleji než kongenery se substitucí na obou kruzích, 2,4,4 - a 2,5,4 -trichlorbifenyly jsou degradovány cestou ataku a štěpení disubstituovaného kruhu za vzniku stejného produktu: 4-chlorbenzoátu. 16.2.2.2 Metabolická dráha chlorbenzoových kyselin Chlorbenzoové kyseliny vznikají jako majoritní metabolit při biodegradaci PCBs. Do životního prostředí však vstupují ze tří zdrojů: 1) jako herbicidy 2) jako produkty degradace herbicidů 3) jako produkty degradace PCBs. Chlorbenzoáty jsou metabolizovány na nejrůznější produkty. Existují tři mechanismy aerobního metabolismus chlorbenzoátů. Průběh této metabolické dráhy souvisí s původní strukturou PCBs a substrátovou specifitou příslušných bakterií (obrázek 16-5): chlorbenzoáty substituované v poloze ortho(x) jsou atakovány iniciační o-chlorbenzoát-1,2- dioxygenasou (OCBD). Druhý krok, při němž je samovolně uvolňován CO 2 a H(XI) (dehalogenační dekarboxylace), probíhá spontánně za vzniku 1,2-benzendiolu(XII), chlorbenzoáty substituované v para poloze(xiii) jsou hydrolyticky dehalogenovány (dehalogenasa) přes 4-chlorbenzoylCoA(XIV) na 4-hydroxybenzoylCoA(XV), který hydrolyzuje na 4-hydroxybenzoát(XVI), který je monooxygenasou hydroxylován na protokatechát(xvii), chlorbenzoáty substituované v poloze meta(xviii) jsou účinkem dioxygenasy (benzoát-1,2- dioxygenasa) oxidovány a dekarboxylovány(xix) na chlorbenzendioly(xx), které jsou dále metabolizovány tzv. modifikovanou ortho dráhou na 2-chlor-cis,cis-mukonovu kyselinu(xxi) spontánně cyklizující na cis-5-karboxy-2,4-pentadien-4-olid(xxii). Zajímavé je, že chemicky by dehalogenace probíhala při extrémních podmínkách (koncentrovaný Na, 300 C) u bakterií (např. Pseudomonas sp. CBS3) probíhá za fysiologických podmínek. VII-86

a) COO H cbdabc CO + + 2 NAD C O 2 NADH + H + O + H X XI XII CO CoASH COSCoA COSCoA b) dehalogenasa ATP AMP + PP i H O 2 H XIII XIV XV COSCoA CO CO monooxygenasa - CoASH XV XVI XVII c) CO clcabc CO H + NADH + H + O 2 NAD + CO 2 XVIII XIX XX CO CO CO O H O XX XXI XXII Obrázek 16-5: Metabolismus chlorbenzoátů a) ortho dráha b) para dráha c) meta dráha VII-87

Existují však bakteriální kmeny, které dokáží degradovat široké spektrum chlorbenzoových kyselin a využívají k tomu více drah najednou. To znamená, že takový kmen je schopen použít k degradaci chlorbenzoátů například ortho dráhu i meta dráhu. Mezi nejvíce prostudované bakteriální kmeny s těmito schopnostmi patří Pseudomonas aeruginosa JB2 a Pseudomonas putida P111. Schopnost bakteriálních kmenů degradujících PCBs metabolizovat také chlorbenzoáty byla objevena také u směsných kultur. Například směsná kultura označená MIXE1 a skládající se z bakteriálních kmenů Pseudomonas a Alcaligenes, které byly schopné degradovat nízkochlorované kongenery v přítomnosti 4-chlorbifenylu jako kosubstrátu degradovala i vybranou směs mono- a dichlorbenzoátů. Vedle diskutovaných výsledků bylo však také prokázáno, že při přeměně chlorbenzoátů v půdních mikrokosmech může vedle mineralizace dojít ke tvorbě protoanemoninu - antibiotika rostlinného původu, jehož toxicita má zcela zásadní vliv na přežívání mikroorganismů v půdě. Kromě gramnegativních bakterií schopných degradovat chlorbenzoáty (převážně rodu Pseudomonas) existují i grampozitivní bakterie s touto schopností. Patří mezi ně i Rhodococcus oparus GM-14, aktinomyceta, které využívá jako jediný zdroj uhlíku široké spektrum halogenovaných aromatických sloučenin. Kromě derivátů benzenu a fenolu mezi ně také patří deriváty benzoátu, zejména pak 3- chlorbenzoát. 16.2.2.3 Možnosti přípravy rekombinantních kmenů bakterií degradujících PCBs Jak již bylo uvedeno výše, jednou z možností zvýšení biodegradační aktivity u mikroorganismů je příprava geneticky modifikovaných kmenů. Divoké bakteriální kmeny izolované z půd kontaminovaných PCBs, u nichž byla prokázána značná schopnost utilizovat PCBs nebo produkty jejich metabolismu, mají z hlediska genových manipulací několik, ve svém důsledku však negativních vlastností, např. rezistenci k široké škále antibiotik, velmi dlouhou lag-fázi v laboratorních podmínkách a přítomnost velkých - často špatně izolovatelných plasmidů. Tyto negativní vlastnosti jsou potlačeny konstrukcí rekombinantních kmenů bakterií, z nichž lze získat požadovanou DNA ve vhodné koncentraci a maximální čistotě. Takto získaný genetický materiál je používán ke konstrukci bakteriálních kmenů schopných degradace PCBs v přírodních podmínkách. Horizontální genový přenos je jednou z možností aplikace takto zkonstruovaných rekombinantních bakteriálních kmenů v životním prostředí. Jedná se o transfer schopnosti degradovat polutanty na původní bakteriální kmeny, které tyto schopnosti před aplikací s konstrukty neměly. Přenos genetické informace je realizován třemi mechanismy: a) transformací, b) transdukcí, c) konjugací. Konjugace je uplatňována nejvíce, její úspěšnost závisí na mnoha faktorech, především na charakteru donorového a recipientního kmene, na vlastnostech samotného plasmidu a na podmínkách kultivace. Důkazem horizontálního přenosu velkých katabolických plasmidů v půdě je úspěsná konjugace 80kb plasmidu pjp4 kmene Alcaligenes eutrophus JMP134, který degraduje 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinu do recipientních organismů v nesterilní půdě v mikrokosmu, které tuto degradační schopnost nemají. Ověření přenosu byla v tomto případě rezistence ke rtuti nesené plasmidem pjp4, kterou původní divoká kultura získala a která u ní před přenosem nebyla zjištěna. Díky horizontálnímu přenosu plasmidu pjp4 stoupla v mikrokosmu rychlost degradace 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny. Pro detekci bakteriálních kmenů inokulovaných do mikrokosmu je vhodné použit bioluminiscenčních markerů obsahujících geny pro emisy světla. Spojení obou vlastností - degradačních a detekčních je možné dvěma způsoby, a to buď vnesením bioluminiscenčních markerů do bakteriálních kmenů s degradačními schopnostmi, nebo vnesením katabolických konjugativních plasmidů s geny pro biodegradaci i bioluminiscenci do nových bakteriálních kmenů. VII-88

Do chromozomu bakteriálního kmene Pseudomonas fluorescens byl naklonován lux operon s geny kódujícími bakteriální luciferasu. Tento rekombinantní kmen byl využit pro oba typy spojení degradačních a detekčních vlastností. Bakteriální luciferasa je enzym izolovaný z organismů: Vibrio fischeri, Photobacterium leiognati, Vibrio harveyi a Xenorhabdus luminiscens. Geny luxab byly vneseny do bakteriálního kmene Alcaligenes eutrophus H850, který byl aplikován při studiu přenosu bph genů mezi půdními bakteriemi vysetými do mikrokosmu. Byl pozorován vliv typu půdy na horizontální přenos bph genů a na přežití H850Lr. Opačným příkladem využití lux genů jako markeru je vnesení katabolického konjugativního plasmidu ppb111 z kmene Pseudomonas putida P111 nesoucího geny pro chlorbenzoát-1,2-dioxygenasu do recipientního kmene Pseudomonas fluorescens, do kterého byl předtím transformací přenesen Tn7-luxCDABE marker. Bioluminiscenční aktivita rekombinantního kmene Pseudomonas fluorescens 2-79 RLD, míra jeho vitální schopnosti a fyziologického stavu v půdě, byla monitorována měřením produkce světla vzorků půdy mikrokosmu. Dalším typem markeru vhodného pro značení gramnegativních bakteriálních kmenů je green fluorescent protein (GFP), izolovaný z organismu Aequorea victoria, se silnou viditelnou absorbancí a fluorescencí z p-hydroxybenzylidenimidazolidinonového chromoforu. Tento protein má mimořádný význam při monitorování genové exprese a lokalizaci proteinů v žijících buňkách, protože detekce intracelulárního GFP vyžaduje expozici pouze v blízkosti UV nebo modrého světla, není tedy limitována použitím žádného bioluminiscenčního substrátu. Protože nebyla objevena interference s buněčným růstem a funkcí, může být GFP použit jako indikátor transformace, a také být jedním z markerů, který umožňuje selekci buněk na základě fluorescenční aktivity. GFP je vitálním markerem, takže vypovídá i o pohybu a buněčném růstu in situ. 16.2.2.4 Výzkum biodegradační aktivity bakterií V České republice je pouze omezený počet pracovišť, které by se zabývaly a studiem biologických systémů schopných degradovat PCBs. Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha má v tomto ohledu za sebou již několik let výzkumu v této oblasti. Jako degradační organismy byly použity bakterie a rostliny ( spolupráce s ÚOCHB AV ČR). Ze vzorků kontaminovaných půd z různých lokalit v ČR byly isolovány konsorcia bakterií schopných růstu na bifenylu, které byly po adaptační fázi testovány s ohledem na jejich schopnosti degradovat PCBs. Později byla pro screening kmenů zavedena metoda umožňující stanovit schopnost degradovat PCBs přímo na tuhých mediích z bifenylem. Metoda spočívá v postřiku narostlých kolonií 4-brombifenylem v etheru. Kolonie schopné degradace kolem sebe vytváří průhlednou zonu během 24-48 hodin. V průběhu posledních let bylo isolováno několik mikrobiálních konsorcia/nebo isolátů schopných s vyšší či nižší účinností degradovat PCBs. Směs dvou isolátů bakterií byla aplikována při ověřovacím pokuse v Žamberku, kde na základě povolení SZÚ bylo v roce 1995 prováděno odstraňování PCBs ze spodních vod (viz dále). Při mikrobiologickém rozboru vzorku hlíny odebrané na skládce v Lhenici bylo zjištěno, že v půdě jsou zastoupeny aerobní, anaerobní a sporulující bakterie (tabulka 16-1, obrázek 16-6). Růstem na selekčním mediu byla prokázána přítomnost pseudomonád, které mají obecně širokou schopnost degradovat organické látky. VII-89

Tabulka 16-1: Počty bakterií isolovaných z 1g nevegetované půdy kontaminované PCBs na skládce v Lhenici Bakterie Vzorek 1 počet bakterií.g -1 půdy Vzorek 2 počet bakterií.g -1 půdy Celkový počet MO 2,1 x 10 7 3,9 x 10 7 Anaerobní 2,0 x 10 5 3,6 x 10 5 Aerobní sporulující 3,5 x 10 5 4,9 x 10 5 Koliformní 0 0 Bakterie rodu Pseudomonas 3,9 x 10 6 8,3 x 10 6 Isolované konsorcium bakterií bylo použito pro degradaci PCBs. Výsledek je uveden na obrázku 16-7 (Pomocí GC bylo stanoveno 22 píků, z nichž každý representuje jeden až tři individuální kongenery. 90 zbytkové koncentrace PCB (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 číslo píku Obrázek 16-6: Degradace PCBs mikrobiálním konsorciem isolovaným z kontaminované půdy Inkubace probíhala 14 dní, s 50 µg.ml -1 PCBs při 28 C. Z konsorcia byly isolovány jednotlivé kmeny a ty byly identifikovány jako: Pseudomonas fluorescens, Ps. stutzeri, Ps. pseudoalcaligenes, Ps. alcaligenes, Ps. fragi, Burkholderia sp, Burkholderia pickettii, Alcaligenes xylooxidans Schopnost isolovaných bakterií degradovat PCBs byla za laboratorních podmínek sledována v minimálním tekutém kultivačním mediu obsahujícím jako jediný zdroj uhlíku a energie bifenyl (50 mg.l -1 ) a komerční preparát PCB Delor 103 (50 mg.l -1 ). Dále byly studovány optimální podmínky degradace, možnost náhrady bifenylu jako zdroje uhlíku a energie jiným substrátem. Některé z výše uvedených bakterií byly schopné růst v přítomnosti bifenylu, avšak schopnost degradace PCBs jednotlivými isoláty byla ve srovnání s konsorciem poměrně nízká. Pravděpodobným důvodem může být skutečnost, že jednotlivé isoláty nemají při testování biodegradačních schopností podporu ostatních mikrobiálních druhů přítomných v konsorciu. Tento předpoklad podporují i výsledky dalšího testování vlastností isolovaných bakterií, u nichž kromě výše uvedené schopnosti VII-90

degradovat PCBs, byla testována i schopnost růst v přítomnosti chlorbenzoových kyselin jako jediného zdroje uhlíku a energie. V případě mikrobiálních konsorcií může přítomnost bakterií s touto aktivitou hrát klíčovou úlohu, protože tyto bakterie snižují koncentraci chlorbenzoátů, vzniklých z PCBs, a inhibujících průběh horní degradační dráhy. V našem případě byla schopnost využívat chlorbenzoové kyseliny nalezena u některých sporulujících bakterií (pravděpodobně rodu Bacillus), získaných z téhož zdroje, a potvrdila se i jejich schopnost některé chlorbenzoové kyseliny degradovat. Výše popsaná zjištění se potvrdila i v případě dalších vzorků kontaminované půdy. Studie opět potvrdily, že bakteriální konsorcia vykazují vyšší schopnost degradovat PCBs než jediný kmen. V několika případech se přesto kultivací pod selekčním tlakem bifenylu podařilo isolovat jednotlivé kmeny s dobrými degradačními schopnostmi. Byl vybrán jeden isolát vykazující poměrně vysokou schopnost degradovat PCBs, který byl nejdříve s využitím klasických biochemických testů, později i analysou 16S rrna identifikován jako Pseudomonas sp. P2 a byl používán k dalším fyziologickým, biochemickým a genetickým studiím. 16.2.3 Degradace PCBs houbami bílé hniloby Určité podobnosti s bakteriální degradací PCBs byly zaznamenány i při degradaci houbami bílé hniloby. Tyto houby primárně degradují lignin a polymery skládající se z různých skupin, ve kterých se objevuje i bifenyl. V přírodě houby produkují řadu enzymů peroxidásového typu, které degradují lignin a uvolňují celulosu, sloužící houbám jako zdroj energie a uhlíku. Jedním z hlavních rozdílů mezi bakteriální a houbovou degradací PCBs je to, že houby jsou schopné degradovat širší rozsah kongenerů PCBs než bakterie a produkují výlučně monooxygenásy (bakterie dioxygenasy). Dřevokazná houba Phanerochaete chrysosporium je schopna degradovat i výše chlorované bifenyly, avšak jen v nízkých koncentracích. Stejně jako u bakterií závisí schopnost degradace na počtu chlorů na bifenylovém jádře. Mechanismus, kterým houby štěpí bifenylový kruh není zatím popsaný, málo informací je i o možných metabolických intermediátech. Ačkoliv houby bíle hniloby prokázaly schopnost účinně degradovat PCBs za laboratorních podmínek, jejich aplikace v bioremediačních technologiích na čištění zkontaminované hlíny naráží na to, že přirozeným substrátem pro tyto houby je dřevo a v půdě samotné mají velmi nízkou PCB biodegradační aktivitu. Tento problém se snaží odstranit studie zaměřené na aplikaci hub na nosičíchpřirozených substrátech. 16.2.4 Metabolismus PCBs u rostlin Rostliny odbourávají PCBs jiným mechanismem a o produktech tohoto odbourávání je známo poměrně málo. Na rozdíl od bakterií a živočichů nebyl dosud prováděn žádný systematický výzkum schopnosti různých rostlinných druhů metabolizovat PCBs. Hlavním předpokládaným mechanismem uplatňujícím se v metabolismu PCBs v savčích buňkách je reakce katalyzovaná enzymem monooxygenasou (isoenzymy cytochromu P 450) a vznik intermediátů arenoxidů. Během následné reakce pak může dojít i k přesmyku a výměně posice a skupin. Tak byly identifikovány metabolity 4,4 -dichlorbifenylu jako 4,4 -dichlor-3-hydroxybifenyl, 3,4 -dichlor-4-hydroxybifenyl a 4 -chlor-4-hydroxybifenyl. V nedávné době byl potvrzen další neenzymatický vznik fenylbenzochinonů, které mohou, jak již bylo výše uvedeno, přispívat k oxidativnímu stresu. První zmínky o přeměně PCBs rostlinnými buňkami se objevily v 70. letech a jako první krok přeměny PCBs byla zjištěna hydroxylace. Tím se rostlinný metabolismus podobá i metabolismu živočišnému. Při dalším studiu vznikajících hydroxyderivátů byla vyslovena hypotéza, že kongenery s chlorem v ortho poloze podléhají přeměně v rostlinných buňkách snadněji než ostatní kongenery. VII-91

V našich pokusech jsme sledovali přeměny monochlorbifenylů a dichlorbifenylů nejprve buňkami kultury lilku - Solanum nigrum SNC-90. U dichlorbifenylů pokusy potvrdily účinnější metabolisaci kongenerů s chlorem v ortho-poloze. Naopak ze tří existujících monochlorbifenylů byl nejsnadněji metabolisován 4-chlorbifenyl. V další fázi těchto pokusů byla sledována přeměna monochlorbifenylů čtyřmi kulturami rostlinných buněk (Solanum nigrum SNC 90 lilek černý, Armoracia rusticana K 54 křen selský, Nicotiana tabacum - tabák viržinský, Medicago sativa vojtěška setá) a srovnáním se standardy identifikovány jako metabolity některé hydroxychlorbifenyly. Kromě hydroxychlorderivátů byly pomocí GC-MS identifikovány další možné produkty vznikající přeměnou PCBs - benzoová kyselina, chlorbenzoová kyselina, hydroxybifenyly i bifenyl. Z výsledků vyplynulo, že různé rostlinné druhy mohou metabolisovat tytéž PCBs na strukturně odlišné chlorhydroxyderiváty; 4-chlorbifenyl může být metabolisován na různé produkty, avšak 4-chlor-4 hydroxybifenyl vzniká v každém případě; během přeměny může dojít k přesmyku a přesunu polohy chloru (což bylo publikováno i dříve, jak u živočišných buněk, tak u buněk rostlinných). Přeměnou PCBs rostlinnými buňkami mohou vznikat látky s jednodušší strukturou, které byly identifikovány i u mikroorganismů. Z tohoto faktu plyne i velká pravděpodobnost účasti jiných enzymových systémů než monooxygenasy cytochromu P450. Vzhledem k podobnosti intermediátů mikrobiální degradace PCBs s produkty metabolismu rostlin, existuje velká pravděpodobnost, že rostlinné produkty PCBs jsou pro bakterie snadněji dostupné a lépe degradovatelné substráty. 16.2.5 Vzájemná interakce bakterií a rostlin při degradaci PCBs V přírodě se na metabolismu xenobiotik podílí řada biologických systémů. Všechny organismy existují v úzké vazbě se svým abiotickým i biotickým prostředím. Významné jsou především vazby, které přímo souvisí se zajištěním výživy, rozmnožováním a jak se v poslední době prokázalo i s metabolismem xenobiotik a detoxifikací prostředí. Jak bylo již výše uvedeno, v minulosti byly chování a vlastnosti jednotlivých typů organismů z hlediska jejich schopností metabolisovat xenobiotika studovány odděleně a bez hledání souvislostí a vzájemného ovlivňování. Jako základní funkce mikroorganismů v tomto směru lze formulovat: modifikace rhizosfery, produkce nejrůznějších enzymů a látek, které mohou positivně ovlivňovat růst rostlin, uzpůsobení prostředí deficientního na živiny, ovlivnění schopností zvýšeného příjmů některých minerálů rostlinami. Úloha rostlin spočívá v: produkci exudátů, které obsahují látky působících jako zdroj uhlíku a energie a dalších živin pro mikroorganismy, produkci látek, které mohou sloužit jako induktory mikrobiálních degradačních genů, zadržování a příjmu vody, produkci oxidu uhličitého a ovlivnění tense kyslíku. Z literatury je dále známo, že tzv. allelopatické vztahy organismů jsou i v nekontaminované přírodě klíčové a hrají positivní i negativní úlohu. Přenos informací se děje pomocí produkce specifických chemických sloučenin, které jsou vylučovány do okolního prostředí. Za allelochemikálie jsou považovány mnohé sekundární metabolity, jako fenoly, flavony, isoflavony, alkaloidy, fytoalexiny, terpeny, mastné kyseliny atd., které se do prostředí dostávají z nadzemních částí rostlin, kořenovými exudáty a rozkladem rostlinné biomasy. VII-92

V nedávné době se řada vědeckých pracovišť začala zabývat i otázkou vzájemného ovlivňování organismů, jejich vztahy v kontaminovaném prostředí a jejich úlohou při odstraňování kontaminantů anorganického i organického původu. V otázce biodegradace PCBs byla významným a dosud nezodpovězeným problémem indukce mikrobiálních genů kodujících degradaci PCBs. V laboratoři se jako zdroj uhlíku a současně induktor používá bifenyl, který je málo rozpustný a též sám o sobě toxický a v případě velkých objemů kontaminované půdy je obtížně použitelný. Jednou z možností je využití schopnosti některých látek rostlinného původu, uvolňovaných do půdy, působit podobně jako bifenyl. Donelly a kol. (1994) testovali tři bakteriální kmeny Pseudomonas sp. LB 400, Corynebacterium sp. MB1a Alcaligenes eutrophus H850 s ověřenými degradačními vlastnostmi v přítomnosti bifenylu, z hlediska jejich schopnosti růstu a degradace PCBs v minimálním mediu a v přítomnosti některých rostlinných terpenů a flavonoidů jako jediných růstových látek a induktorů degradace PCBs. Bakterie byly schopné odlišně využívat tyto látky. Růst a srovnatelná degradace jako s bifenylem byla zjištěna např. s katechinem, naringinem, myricetinem, nebo floridzinem. Obdobně Gilbert a Crowley (1997) testovali degradační schopnosti bakterie Arthrobacter sp. B1B v přítomnosti terpenů. Zjistili, že buňky vykazují nejvyšší schopnost degradovat PCBs v přítomnosti karvonu. Jako zdroj uhlíku byla v tomto případě do media přidávána fruktosa, karvon byl použit jako induktor exprese genů bph operonu. Podobný efekt způsobovaly přídavky limonenu, isopropylbenzenu a cymenu. V našem případě jsme testovali některé látky fenolické povahy kyseliny vanilovou, ferulovou, skořicovou a flavonoidy quercetin a morin ve třech koncentracích 0.2, 1, 2 g.l -1. Byly použity dva bakteriální kmeny, již výše popsaný Pseudomonas sp. P2 a Pseudomonas stutzeri 12, které byly testovány z hlediska schopnosti růstu a degradace PCBs v přítomnosti výše zmíněných látek, jako jediného zdroje uhlíku a energie a možného induktoru genů bph operonu. Buňky bakterie Ps. sp. P2 vykázaly relativně dobrý růst na všech substrátech kromě kumarinu. Růstové vlastnosti bakterie a schopnost využívat zvolené látky jako jediný zdroj uhlíku a energie v koncentraci 0,2 g.l -1 vyjadřuje tabulka 16-2. Tabulka 16-2: Růstové charakteristiky kmene Pseudomonas sp. P2 v přítomnosti různých substrátů v koncentraci 0,2 g.l -1 Použitá látka µ [hod -1 ] T [hod] Bifenyl 6,8 x 10-3 102 Kumarin* 0 0 Kyselina ferulová 1,3 x 10-3 531 Kyselina skořicová 3,9 x 10-3 177 Kyselina vanilová 2,8 x 10-3 246 (R)-(+)-limonen 1,6 x 10-3 431 (S)-( )-limonen 1,5 x 10-3 460 Morin 7,5 x 10-3 92 Quercetin 11,2 x 10-3 62 Pozn: µ specifická růstová rychlost, T generační doba * - lyse buněk Výše uvedený pokus prokázal schopnost bakterie Pseudomonas sp. P2 využívat kromě bifenylu i další látky, fenolické kyseliny, flavonoidy jako jediný zdroj uhlíku a energie. V další fazi byla sledována VII-93