MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2007 MICHAL ROHRER

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Testování vektorů pro rezistenci k virovým onemocněním u rostlin Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Pavel Hanáček, Ph.D. Vypracoval: Michal Rohrer Brno 2007

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma..... vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. dne.... podpis bakaláře....

PODĚKOVÁNÍ Rád bych poděkoval svému školiteli Ing. Pavlu Hanáčkovi, Ph.D.za vedení práce, trpělivost a za ochotu mi vždy s čímkoli pomoci. Dále bych chtěl poděkovat Haně Pecůchové za pomoc při pasážování a práci s kultivovanými rostlinami tabáku.

ABSTRAKT V této práci byla testována účinnost vektorového systému Agrobacterium tumefaciens kmene EHA 105 obsahujícím plazmid pwell07a, který nese fragment viru PSbMV sense/antisense pod CAMV 35s promotorem, pomocí transformace tabáku. Transformace byla prováděna metodou kokultivace listových disků. Regenerované rostliny tabáku byly selektovány na médiu s fosfinotricinem. Pro ověření úspěšnosti transformace jsme použili histochemický GUS test. Dopěstováním transgenní rostliny z listových disků tabáku jsme prokázali schopnost vektorového systému transformovat dvouděložné rostliny a možnost použití tohoto vektorového systému pro získání transgenního hrachu se zvýšenou odolností proti virovému patogenu PSbMV. Klíčová slova: transformace rostlin, Agrobacterium tumefaciens, GUS test, PSbMV, hrách setý, tabák viržinský ABSTRACT The efficiency of the Agrobacterium tumefaciens EHA 105 vector system pwell07a was tested by transformation of tobacco. The plasmid pwell07a has incorporated PSbMV viral DNA fragments in sense/antisense orientations under the control of CAMV 35s promotor. The tobacco transformation was carried out by leaf disc cocultivation method. Regenerated tobacco plantlets were selected on a medium containing phosphinothricin. The transformation efficiency was tested by the histochemical GUS test. Regeneration of transgenic plants from tobacco leaf discs has proven the ability of the used vector system to transform dicotyledonous plants and the possibility to obtain transgenic pea plants with enhanced resistance to the viral pathogen PSbMV. Key words: plant transformation, Agrobacterium tumefaciens, GUS test, PSbMV, pea, tobacco

OBSAH 1. ÚVOD... 8 1.1. Cíl práce... 8 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 2.1. Genetické inženýrství... 9 2.2. Metody izolace genů a mapování genomu... 10 2.3. Vektory, mechanizmy a metody transgenoze... 12 2.4. Transgenoze prostřednictvím bakterií Agrobacterium... 12 2.4.1. Ti-plazmid Agrobacterium tumefaciens... 13 2.4.1.1. Úsek virulence plazmidu Ti... 13 2.4.1.2. Integrace T-DNA do genomu rostlinných buněk... 14 2.4.2. Princip vektorů... 15 2.4.3. Binární vektory... 16 2.4.4. Signální (reportérové) geny... 17 2.4.4.1. Transgen pro β-glukuronidasu (GUS)... 17 2.4.4.2. Transgen pro chloramfenikolacetyltransferasu... 18 2.4.4.3. Transgen pro luciferasu (LUC)... 19 2.4.4.4. Transgen pro zeleně fluoreskující protein (GFP)... 19 2.4.5. Selekční geny... 19 2.5. Přímá transgenoze... 21 2.5.1. Transgenoze protoplastů... 21 2.5.1.1. Elektroporace... 21 2.5.1.2. Mroinjekce... 21 2.5.2. Transformace pletiv a orgánů... 22 2.5.2.1. Mikroprojektily... 22 2.6. Šlechtění rostlin... 22 2.6.1. Šlechtění na rezistenci... 23 2.6.1.1. Obecné mechanizmy obrany rostlin proti patogenům... 23 2.6.2. Transgeny pro rezistenci k virům... 23 2.6.2.1. Rezistence zprostředkovaná genem pro plášťový protein... 24 2.6.2.2. Rezistence k proteinu pro přenos z buňky do buňky... 24 2.6.2.3. RNA interference... 24

3. Materiál a metody zpracování... 26 3.1. Použitý materiál... 26 3.1.1. Rostlinný materiál... 26 3.1.2. Bakteriální kultura... 26 3.1.3. Média složení... 27 3.1.4. Zásobní roztoky pro přípravu roztoku na histochemický GUS test... 29 3.2. Metodika... 29 3.2.1. Transformace listových disků... 29 3.2.2. Selekce transformovaných disků... 30 3.2.3. Histochemický GUS test transformovaných rostlin... 31 3.2.4. Ozdravování kontaminovaných listových disků... 31 4. Výsledky... 32 4.1. Založení pokusu... 32 4.2. Ověření transformace listových disků... 32 4.3. Kultivace rostlin tabáku... 33 4.4. Ověření transformace regenerovaných rostlin... 34 5. Diskuse... 35 5.1. Závěr... 35 6. Seznam použité literatury... 36

1. ÚVOD Na začátku rohu 2005 ukázal průzkum u komerčního osiva hrachu setého infekci PSbMV (Virus semenem přenosné mozaiky hrachu) v rozsahu od 0,3 % do 23 %. Virus semenem přenosné mozaiky hrachu redukuje výnos a způsobuje snížení klíčivosti semen. PSbMV způsobuje u hrachu symptomy, které pěstitelé často zaměňují za symptomy způsobené nedostatkem živin a podceňují tak ekonomický dopad. PSbMV se přenáší semenem a sekundárně mšicemi hlavně Kyjatkou hrachovou. Ztráty výnosu mohou dosahovat až 25 % u osiva s infekcí 6,5 % (www.grdc.com.au). Ochrana hrachu setého před virózami může být pěstováním tolerantních odrůd, hubením přenašečů, dodržováním izolačních vzdáleností porostů a výsevem zdravého osiva. Detekce infikovaného semene je možno provést pomocí sérologických testů (např. ELISA). Z ekonomického hlediska je perspektivní pěstovat rezistentní (tolerantní) odrůdy. V moderním šlechtění jsou stále více používány metody genového inženýrství (transgenoze). Vnesením fragmentu genu plášťového proteinu viru semenem přenosné mozaiky hrachu v sense/antisense orientaci by mělo dojít k navození obranného mechanizmu rostlinných buněk postranskripční utišení genu (PTGS). Rostlinné buňky pak reagují na přítomnost virové RNA, která je pak enzymy degradována a znemožní tak propagaci viru. Transgenní hrách by měl být rezistentní vůči PSbMV. 1.1. Cíl práce Transgenoze hrachu je však obtížná. Při pokusech se supervirulentními kmeny A. tumefaciens (AgL0, AgL1 a EHA105) se pohybovala účinnost transformace rostlin hrachu od 0,7 do 4,1 %. Přítomnost integrovaného genu pak byla prokázána pomocí PCR. Southernův přenos prokázal stabilní začlenění T-DNA do potomstva (Pniewski a Kapusta, 2005). Nejvyšší frekvence transformací lze dosáhnout u pletiv tabáku Nicotiana tabacum. Již i u jiných druhů rodu Nicotiana může být frekvence podstatně nižší (Ondřej a Drobník, 2002). Cílem této práce je vyzkoušet účinnost vektorového systému Agrobacterium tumefaciens kmene EHA 105 nesoucím plazmid pwell07a s 35s-PSbMV sense/antisense právě na tabáku. 8

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Genetické inženýrství Konvenční metody šlechtění rostlin byly v průběhu posledních dvou desetiletí rozšířeny o techniky genového inženýrství. Genové inženýrství pracuje s izolovanými definovanými úseky DNA, které představují geny nebo další sekvence DNA. V 80. letech došlo k prudkému rozvoji biotechnologií důsledkem rozvoje jednoho stěžejního metodologického principu: schopnosti skládat dohromady in vitro DNA molekuly odvozené z různých zdrojů. Tyto techniky jsou nazývané jako genové manipulace. Genetické manipulace s rostlinou buňkou všechny nekonvenční techniky prováděné in vitro, kterými lze modifikovat rostlinný genom. Genetické manipulace u rostlin dělíme na: buněčné inženýrství zahrnuje modifikace genetické informace recipientního organizmu prostřednictvím přenosu celých buněk nebo izolovaných organel genové inženýrství (genetická transformace, transgenoze) Techniky genového inženýrství zahrnují: základní manipulace s rostlinnými geny restrikční štěpení rostlinné vysokomolekulární DNA pomocí enzymů restrikčních endonukleas klonování rostlinné DNA v bakteriálních plazmidech konstrukce genových knihoven genetické mapování a sekvenování DNA integraci cizorodé DNA do rostlin Transgenoze je vnášení jednotlivých genů do rostlinného dědičného základu (genomu) metodami genového inženýrství. Jde o přenos přesně definovaných sekvencí DNA (transgenů), které se exprimují v pořadí aminokyselin v konečném translačním produktu (proteinu) s definovanou úlohou v biosyntetických drahách. Prakticky to znamená cílenou, předem plánovanou změnu jediného znaku vlastnosti rostliny 9

(Bednář, 2000). Tyto metody odstartovaly v roce 1977, kdy bylo jednoznačně prokázáno, že půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens vnášejí svou DNA do rostlinného genomu (Chilton a kol., 1977), ale byly předjímány již mnohem dříve. Bakteriální transformace byly známy již ve čtyřicátých letech a předpokládalo se, že podobný jev musí existovat i u eukaryontních buněk. Provádělo se mnoho pokusů s exogenní DNA, ale jejich jednoznačné interpretaci bránila neadekvátní metodická výbava (Ledoux a Huart, 1968; Ledoux a kol., 1974; Hess, 1969; Hess a kol., 1976). Teprve metody genového inženýrství umožnily získat jednoznačný důkaz přenosu a zapojení cizorodé DNA do dědičné informace rostlinných buněk. Transgenoze se tak stala dalším z bohaté palety nástrojů, které moderní šlechtění využívá. Termín transformace je vyhrazen pro vnášení DNA do bakterií, kde mechanizmy pronikání do buněk a integrace do chromozomů jsou jiné než u eukaryont. Kromě toho se termínem transformace již označovaly změny charakteru buněk savčích tkáňových kultur (Ondřej a Drobník, 2002). Genové modifikace je termín, který se vlivem legislativy EU ustálil jako synonymum pro techniky rekombinantní DNA. Výsledkem jsou geneticky modifikované organizmy GMO, geneticky modifikované rostliny (linie, odrůdy, hybridy) GMR. Transgenní rostliny (GMR) jsou rostliny, do jejichž dědičného základu byl vnesen jeden nebo několik klonovaných genů, tedy genů získaných metodami genového inženýrství. Takové geny mohou pocházet z dědičného základu samotné rostliny, nebo mohou pocházet z libovolně systematicky vzdáleného organizmu (Bednář, 2000). 2.2. Metody izolace genů a mapování genomu Nové metody molekulární genetiky umožňují aplikovat celou řadu strategií při izolaci a identifikaci rostlinných genů. Patří mezi ně především konstrukce knihoven cdna z populací izolovaných mrna. Jejich subtrakční hybridizace, kdy jsou srovnávány cdna-klony připravené z různých genotypů nebo orgánů, umožňují izolovat geny, které jsou známé pouze svým fenotypovým projevem. Cenným nástrojem ke srovnávání příbuznosti genotypů i ke konstrukci vazebných map je polymorfizmus délky restrikčních fragmentů DNA (RFLP, restriction fragment length polymorphism), detekovaná pomocí hybridizace na membránách se značenými 10

sondami DNA. Polymerázová řetězová reakce (PCR) pak umožňuje izolovat a sekvenovat úseky DNA lokalizované mezi dvěma známými oligonukleotidovými sekvencemi. S pomocí oligonukleotidů s náhodnou sekvencí je také možno analyzovat genomovoý polymorfizmus a provádět mapování genomu (například technikou RAPD, random amplified polymorphic DNA). Identifikaci genů odpovídajících za změněný fenotyp nebo studium specifické genové exprese v různých pletivech a orgánech umožňuje technika srovnávání radioaktivně značených produktů polymerázové řetězové reakce (tzv. differential display), tvořených z templátů cdna připravených reverzní transkripcí z populace izolovaných polyadenylovaných mrna (RT-PCR, reverse transcription PCR). Při lokalizaci genu v genomu se obvykle vychází z genomových knihoven (obsahujících velké úseky genomové DNA klonované v bakteriofázích nebo umělých kvasinkových chromozomech) a z možnosti zjištění chromozomální pozice neznámého genu ve vazbě k již klonované sekvenci DNA. Další analýza potom probíhá pomocí hybridizace DNA/DNA a případně i sekvenováním DNA v překrývajících se klonech genomové DNA (tzv. procházení chromozomem, chromosome walking). Proces je ukončen buď identifikací hledaného genu, nebo alespoň, po dosažení nejbližšího markeru na opačné straně genu, vymezením genomového úseku, kde je hledaný gen lokalizován. Vypracování postupů pro rutinní vnášení genů do rostlin (transgenoze) pak poskytuje možnost inzerční transpozonové mutageneze (gene tagging): pomocí agrobakteriálních vektorů a náhodné integrace cizorodých sekvencí DNA (například T-DNA nebo mobilních genetických elementů) do rostlinného genomu je možné detekovat jeho strukturní a funkční změny a nakonec prostřednictvím cizorodé DNA jako hybridizační sondy izolovat odpovídající geny. Izolace genu z genomové banky připravené s takto modifikované rostliny je obvykle usnadněna začleněním plazmidového počátku replikace a bakteriálního selekčního genu do transponované sekvence DNA (tzv. metoda plasmid rescue). Pomocí inzerční mutageneze je možné izolovat i rostlinné promotory. V tomto případě je do rostlin vnášen signální gen postrádající promotorovou sekvenci a k jeho expresi tedy může dojít pouze v případě, kdy je integrován za jakýkoli funkční promotor. Prostřednictvím konstrukce chimérických genů vzniklých fúzí izolovaných promotorů se strukturními signálními geny je možné po jejich vnesení do rostlin analyzovat orgánovou a pletivovou specifitu jejich exprese (Procházka a kol., 1998). 11

2.3. Vektory, mechanizmy a metody transgenoze Tranzientní neboli dočasná exprese je exprese signálního transgenu, ke kterému dochází v důsledku toho, že do buněčných jader pronikne větší množství úseků T-DNA. Ještě dříve než se stačí integrovat do genomu nebo degradovat nukleázami, dojde k jejich expresi. Tranzientní expresi lze provádět jak s bakteriemi Agrobacterium, tak přímým vnášením plazmidové DNA do protoplastů elektroporací a v neposlední řadě také vnášení cizorodých genů do rostlinných buněk virovými vektory. Prakticky je využitelná k orientačnímu porovnání účinnosti různých promotorů nebo různých způsobů aplikace u určitého materiálu nebo porovnání účinnosti téhož konstruktu v různých materiálech. Výhody tranzientní exprese: Výsledek, který informuje o účinnosti použitých regulačních sekvencí v daném genomu, lze získat již za dva dny. Může být aplikována na celá pletiva, orgány a rostliny. Může docházet k expresi několika genů najednou. Mohou být současně ovlivněna velká množství různých rostlinných tkání. Tento typ hodnocení exprese je možný u mnoha různých druhů rostlin a mnoha různých genotypů, dokonce i takových, u kterých nedochází k integraci T-DNA 2.4. Transgenoze prostřednictvím bakterií Agrobacterium Pouze u vyšších rostlin se fylogeneticky vyvinul vztah patogen-hostitel, z něhož vychází princip genového inženýrství. Bakterie Agrobacterium tumefaciens dodávají hostiteli, rostlinné buňce, genetickou informaci pro syntézu látek opinů, kterou může využít právě jen indukující bakterie. Aby rostlinné buňky produkovaly opinů co nejvíce, proto T-DNA, tento do rostlinného genomu přenesený a integrovaný specifický úsek bakteriální DNA, nese také informaci pro nové cesty biosyntézy auxinů a cytokininů. Zvýšená hladina těchto rostlinných hormonů působí proliferaci rostlinných buněk a vznik rostlinných nádorů. Bakterie Agrobacterium rhizogenes na obdobném principu indukuje vznik kořenů obsahujících ve svém genomu jiný typ T-DNA. 12

2.4.1. Ti-plazmid Agrobacterium tumefaciens Plazmidy Ti jsou funkční, tedy schopné indukovat rostlinné nádory pouze v buňkách Agrobacterium a Rhizobium. Chromozomální mapy Agrobacterium a Rhizobium jsou si velmi podobné. Aby docházelo k indukci nádorů u rostlin, musí být geny Ti-plazmidu v interakci s chromozomálními lokusy. Ti-plazmid má dva úseky nepostradatelné k indukci nádorů: 1. T-DNA, která do rostlinných buněk vstupuje, ale sama nemá žádné geny pro vlastní integraci. 2. Úsek virulence, který obsahuje geny nutné pro funkce podmiňující přenos T-DNA do rostlinných buněk a jejich integraci v rostlinném genomu. Další úseky jsou nutné pro funkci plazmidu v bakteriálních buňkách a pro interakci mezi bakteriemi a rostlinnými buňkami. 2.4.1.1. Úsek virulence plazmidu Ti Samotná T-DNA plazmidu Ti a Ri neobsahuje kromě hraničních sekvencí 25 párů bází žádné geny pro svou integraci do rostlinného genomu. Tyto geny jsou lokalizovány v úseku virulence, který má délku 35 kb a je téměř shodný u různých typů plazmidů Ti. Na mapě plazmidu Ti a Ri je lokalizován v různých vzdálenostech vlevo od T-DNA. Skládá se ze šesti operonů: vira, virb, virc, vird, vire a virg. Většina těchto operonů se skládá z několika genů, takže celkový počet polypeptidů, které DNA úseku vir kóduje, je přes 20. Přenos T-DNA do rostlinných buněk indukují fenolické látky typu acetosyringonu k nimž patří např. acetovanilon, hydroxyacetofenon, kyselina sinapová, kyselina lysergová, katechol, kyselina galová, kyselina 4-hydroxybenzoová, pyrogalol, kyselina β-resorcylová, vanilin, kyselina ferulová. Částečně je úsek vir indukován flavonoidy a kyselinou skořicovou. V interakci s acetosyringonem geny úseku virulence aktivují i specifické nízkomolekulární látky rostlinných nádorů indukovaných bakteriemi Agrobacterium, tzv. opiny. Všechny tyto látky jsou rozeznávány specifickými proteinovými receptory na buněčných stěnách bakterií Agrobacterium. 13

Toto rozpoznávání má za následek přiblížení bakterií k rostlinným pletivům chemotaxí, jejich nasedání na buněčné stěny rostlinných buněk a aktivaci genů úseku virulence. Fenolické látky jsou produkovány poraněnými buňkami většiny dvojděložných rostlin, ale ne buňkami většiny rostlin jednoděložných. Geny úseku virulence zprostředkovávají oddělení T-DNA z plazmidu Ti a její přenos do rostlinných buněk. Přenos T-DNA začíná od pravé hraniční sekvence 25 bp, kde vzniká zlom v dolním vlákně T-DNA (tedy komplementární tomu, jehož sekvence se běžně udává v sekvenčních studiích T- DNA). Tento zlom vzniká mezi 3. a 4. bází hraničních úseků 25 bp. Délka T-DNA je ukončena levou hraniční sekvencí. Po rozpoznání recipientních buněk se bakterie rodu Agrobacterium navážou na buňky rostlin. Tento proces je zprostředkován proteiny, které jsou kódovány geny bakteriálního chromozomu chva, chvb a psca. 2.4.1.2. Integrace T-DNA do genomu rostlinných buněk T-DNA se do genomu integruje převážně v genových sekvencích. Z hlediska pořadí bází jsou to často místa bohatá na pár bází AT. Celou posloupnost dějů při integraci T-DNA do rostlinných buněk je možné vyjádřit takto: 1. Rozpoznání citlivých rostlinných buněk bakteriemi Agrobacterium. 2. Sekrece fenolických a dalších látek poraněnými buňkami rostlin. Tyto látky působí jako signály pro aktivaci genů vir-oblasti plazmidů Ti a Ri. 3. Pozitivní chemotaxe k poraněným buňkám rostlin. 4. Připojení bakterií k rostlinným buňkám zprostředkované geny chva, chvb a psca chromozomální DNA bakterií A. tumefaciens. Vazba signálních molekul na receptorové proteiny buněčných stěn produkované genem vira. 5. Přenos signálů přes bakteriální buněčnou stěnu a aktivace transkripce genů virb, virc, vird a vire. 6. Uvolnění jednovláknových kopií T-DNA, které mohou být přenášeny do rostlinných buněk. 7. Vznik jednovláknových zlomů na specifických místech. Tyto zlomy jsou indukovány endonukleázou kódovanou geny vird1 a vird2. 8. Odkrucování jednovláknové T-DNA zprostředkované proteiny, které jsou kódovány geny vird1, vird2 a vire2. 14

9. Vytvoření přenosového komplexu T-DNA a polypeptidů kódovaných geny vird1 + vird2 + vire2 a možná některých virb. 10. Přenos tohoto komplexu přes bakteriální a buněčné stěny. 11. Vnesení T-DNA do buněčného jádra. 12. Integrace T-DNA do jaderné DNA. 2.4.2. Princip vektorů Pro využití Agrobacterium jako vektorů transgenů je třeba z T-DNA odstranit původní geny a nahradit je jinými. Z T-DNA pak zůstávají jen hraniční sekvence. Při uspořádání pokusu, obvyklém v genovém inženýrství, by bylo třeba najít vhodnou restrikční endonukleázu, která nepůsobí zlomy nikde jinde než uvnitř T-DNA a co nejblíže hraničním sekvencím. Takové restrikční enzymy však neexistují. Plazmid Ti, který má velikost 150 200 kb, obsahuje mnoho restrikčních míst pro všechny restrikční endonukleázy. Proto není možné používat obvyklých metod modifikace plazmidu. Základem strategie úprav T-DNA plazmidu Ti je využití klonovaných restrikčních štěpů T-DNA. K fyzikálnímu mapování plazmidu Ti je třeba rozštěpit celý plazmid Ti restrikční endonukleázou. Tím vznikne velké množství fragmentů. Významné jsou fragmenty T-DNA. Ty lze klonovat do malých plazmidových vektorů a pak je možno úseky T-DNA různě spojovat. Je možno získat plazmid, který má jen krátký úsek s levou hraniční sekvencí, krátký úsek s pravou hraniční sekvencí a mezi nimi úsek jiné T-DNA, nejlépe bakteriální gen pro rezistenci k některému běžnému antibiotiku. Tento malý plazmid s úseky T-DNA se nazývá intermediární plazmid, protože je prostředníkem při modifikaci T-DNA plazmidu Ti. Do úseku T-DNA intermediárního plazmidu se vsune restrikčním štěpením a ligací gen, který chceme do T-DNA plazmidu Ti vnést. Tímto způsobem je možno také vsunout transpozon nebo navodit deleci středního úseku T-DNA. Je výhodné, aby intermediární plazmid měl schopnost replikace v E. coli, ale ne v A. tumefaciens. Jestliže jsou takové intermediární plazmidy vneseny do velkého množství buněk agrobakteria, ať transformací nebo konjugací, udrží se trvale jen v těch buňkách, u kterých došlo k rekombinaci mezi homologními úseky plazmidů Ti a malého intermediárního plazmidu. 15

2.4.3. Binární vektory Schopnost indukovat nádory mají i binární vektory, což jsou takové kmeny A. tumefaciens, u nichž byl plazmid Ti rozdělen na dva plazmidy: jeden, který neobsahuje úsek T-DNA, ale obsahuje úsek virulence, a druhý, který obsahuje T-DNA nesenou jiným typem plazmidu, jenž se replikuje v agrobakteriu a má selektovatelný gen pro rezistenci k některému antibiotiku. Binární vektory se tedy skládají ze dvou plazmidů v téže buňce A. tumefaciens, z nichž jeden nese úsek virulence a druhý T-DNA. Kmen A. tumefaciens, který obsahuje oba plazmidy současně, indukuje nádory se stejnou účinností jako původní kmen A. tumefaciens Ach5. Rozdělení plazmidu Ti do dvou plazmidů, z nichž menší (vektorový plazmid) je již dostatečně malý a má vhodná restrikční místa, že je možno přímo do T-DNA vestavovat cizorodé sekvence DNA, silně zjednodušuje genovou manipulaci pro úpravu agrobakterií k včleňování klonovaných genů do rostlin Postupně bylo zkonstruováno a osvědčilo se několik základních typů plazmidů binárních vektorů, které se používají ve všech laboratořích, kde se pracuje s transgenozí. Většina těchto vektorových plazmidů je volně distribuována mezi vědeckými pracovišti s tím, že budou používány jen pro vědeckou práci, nikoli v biotechnologických firmách pro komerční nebo šlechtitelské účely. Liší se v detailech, ale základní vlastnosti mají společné. Skládají se ze dvou základních částí: části T-DNA a části, která se uplatňuje v baktériích, má počátek replikace, jenž se uplatňuje jak v E. coli, tak v A. tumefaciens. Úpravy plazmidů, manipulace in vitro, se provádějí v bakteriích E. coli. Spočívají zpravidla v tom, že do T-DNA výchozího vektorového plazmidu se včlení gen, který chceme přenést do rostlin. Plazmid má v T-DNA zpravidla tzv. polylinkerovou sekvenci. To je syntetická sekvence DNA, která se skládá z cílových míst pro mnoho restrikčních endonukleáz uspořádaných za sebou. Jsou to taková cílová místa pro konkrétní restrikční endonukleázy, která jinde na plazmidu nejsou (unikátní místa). Gen, který se má včlenit do rostlin, se vyštěpí z ostatní DNA některým z restrikčních enzymů. Stejným restrikčním enzymem se rozštěpí v polylinkerovém úseku také vektorový plazmid a gen se včlení ligací do plazmidu. Plazmid se pak transformací vpraví do buněk E. coli. Buňky s plazmidem se vyselektují a plazmid se v nich nechá namnožit. Pak se znovu izoluje, rozštěpí restrikčními endonukleázami a ověří, že má předpokládanou strukturu. Pokud ano, pak se z buněk E. coli přenese do A. tumefaciens. Tento přenos se zpravidla děje bakteriální konjugací, případně 16

transformací. V části, která se uplatňuje v bakteriích, musí být bakteriální (obsahující bakteriální regulační sekvence) gen pro rezistenci k některému antibiotiku, který se projevuje v bakteriálním genomu. Použitím tohoto antibiotika v bakteriálním médiu se selektují ty bakteriální buňky z populace buněk E. coli nebo A. tumefaciens, do kterých byl plazmid vnesen. V různých vektorech se zpravidla používá genů pro rezistenci ke kanamycinu, tetracyklinu, spektinomycinu nebo streptomycinu. Zpravidla to nejsou antibiotika odvozená od penicilinu, protože se některá z nich (např. karbenicilin) výhodně používají v mediích pro rostlinné tkáňové kultury, aby se rostlinné buňky zbavily bakterií Agrobacterium, které do nich přenesli transgen. V T-DNA mají vektorové plazmidy selektovatelný gen, restrikční (polylinkerové) místo pro vestavění genu, který se má přenést, a zpravidla i reportérový gen. Jako první se do rostlin přenáší pravá hraniční sekvence, zatím co levá se přenáší jako poslední a přenos se nemusí uskutečnit vždy celý. Proto je výhodné, aby selektovatelný gen ležel u levé hraniční sekvence. Pak je velmi pravděpodobné, že selektovatelné rostlinné buňky budou obsahovat i gen, který měl být přenesen. Optimální je, jestliže tento gen leží mezi selektovatelným a reportérovým genem. Jestliže se do rostlinného buněčného klonu přenesly oba, je téměř jisté, že byl přenesen i prostřední gen (Ondřej a Drobník, 2002). 2.4.4. Signální (reportérové) geny Signální geny jsou takové, jejichž expresi (biochemický produkt) lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat a které mohou sloužit jako měřítko stupně exprese transgenů s různými promotory, v různých genotypech, různých pletivech a za různých podmínek (Bednář, 2000). Jsou vždy chimérické obsahují regulační sekvence pro projev v rostlinném genomu, ale kódující sekvence bývá bakteriální nebo živočišná. Chimérické transgeny jsou transgeny, které se skládají z úseků DNA pocházejících z různých genomů. 2.4.4.1. Transgen pro β-glukuronidasu (GUS) Uvedený bakteriální enzym E. coli je v bakteriích kódován genem uida, ale jako signální gen v rostlinách se označuje GUS. Jeho kódující genová sekvence se využívá 17

v chimérických konstrukcích jako zatím nejúspěšnější signální gen transgenoze rostlinných buněk. Štěpí snadno dostupné substráty na modře zbarvené nebo fluoreskující látky. Detekce GUS: fluorescenční provádí se v homogenátu s přídavkem substrátu MUG (4-methyl umbelliferyl glukuronid). Při ozáření dlouhovlnným UV (365 nm) dává modrou fluorescenci 570 nm a 590 nm. histochemický používá se barvivo X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glukuronid), které po rozštěpení dává modrou, ve vodě nerozpustnou krystalickou sloučeninu, která zůstává lokalizovaná v buňkách, v nichž vznikla. Je možno používat segmenty listů, kalusy apod. 2.4.4.2. Transgen pro chloramfenikolacetyltransferasu Gen obsahuje kódující sekvenci bakteriálního genu pro chloramfenikolacetyltransferasu. Tento bakteriální enzym nepůsobí u rostlin rezistenci vůči chloramfenikolu. Enzym působí acetylaci chloramfenikolu. Po dodání chloramfenikolu, značeného 14 C, k proteinovým extraktům transgenních rostlin se značený chloramfenikol přeměňuje na acetylované produkty. Ty je možno od neacetylovaného chloramfenikolu oddělit tenkovrstvou chromatografií a získat na autoradiogramu stopy odpovídající chloramfenikolu a jeho acetylovaným produktům. 18

2.4.4.3. Transgen pro luciferasu (LUC) Využívá se cdna genu světlušky (Photinus pyralis) nebo kódující sekvence bakterie Vibrio harvei. Po dodání substrátu k rostlinnému proteinovému extraktu transgenních rostlin dochází k emisi viditelného záření, které je možno měřit luminimetrem, scintilačním počítačem, CCD kamerou nebo zachytit fotografickým materiálem. Systém nedošel velkého rozšíření, neboť luciferin špatně proniká do pletiv a substrát je značně drahý. 2.4.4.4. Transgen pro zeleně fluoreskující protein (GFP) Gen pro zeleně fluoreskující protein byl klonován z medúzy Aeqorea victoria. Tam se vyskytuje společně s proteinem, který v přítomnosti iontů vápníku vydává modré světlo, aequorinem. GFP přeměňuje modré světlo na zelené. Nemodifikovaný GFP je protein, který se skládá z 238 aminokyselin. Má schopnost emitovat zelené světlo při ozáření UV (360 400 nm). Je to jediný známý protein, který fluoreskuje bez dodávání substrátu nebo kofaktorů (Ondřej a Drobník, 2002). 2.4.5. Selekční geny Selekční geny kódují rezistenci k toxickým látkám přidaným do agarového média nebo postřiku. Na selekčních médiích nebo po aplikaci postřiku přežívají a dále se dělí jen transgenní buňky a pletiva. Využívá se několika selekčních systémů: Transgen pro rezistenci ke kanamycinu (NPT), který kóduje neomycinfosfotransferasu II (NPTII). Jeho kódující sekvence pochází z bakteriálního transpozonu Tn5. Lze jej používat jako složku média, rovněž i pro detekci rezistence proti kanamycinu u rostlin v květináčích. Rostliny se postřikují roztokem kanamycinu. Rezistentní rostliny zůstanou nepoškozené, u senzitivních vzniknou léze v místech dopadu kapiček kanamycinu. Gen pro rezistenci ke kanamycinu, projevující se v rostlinách, je důležitou součástí většiny dnes používaných vektorů. 19

Umožňuje nejen detekci transgenoze, ale také účinnou selekci transgenních pletiv (Bednář, 2000). Chimérický transgen pro rezistenci k hygromycinu. Hygromycin je antibiotikum, které blokuje proteosyntézu u prokaryont i eukaryont. Kódující sekvence genu pro hygromycinfosfotransferázu (genu aphiv E. coli) je využíván v chimérických konstrukcích s rostlinným promotorem, zaváděcí sekvencí a terminátorem. Hygromycin je vysoce toxický pro všechny rostlinné a živočišné buňky. Konstrukce pochází z r. 1985, ale selekční systém je využíván spíše jen tam, kde není možno použití rezistence ke kanamycinu, protože hygromycin B je silně toxický i pro člověka. Chimérické transgeny pro rezistenci k antibiotikům streptomycinu, gentamycinu, bleomycinu a metotrexátu. Jsou využívány poměrně vzácně. Transgen pro rezistenci k herbicidu glufozinátu. Transgen pro rezistenci k sacharidu manóze. Je to noví systém selekce, který byl zatím použit u tabáku, cukrovky a kukuřice., ale zatím není známo, do jaké míry bude fungovat obecně. U mnoha rostlinných druhů je manóza fosforylována enzymem hexokinázou na manóza-6- fosfát, který dál není metabolizován a je toxický. Buňky mají nedostatek fosforu, zvýšeně syntetizují škroby a maltózu. Dochází k inhibici dělení buněk i jejich růstu. Jestliže se však do genomu vnese transgen fosfomanózaizomerázu (PMI), jehož kódující sekvence je z genomu E. coli, tento enzym působí přeměnu manóza-6-fosfátu na fruktóza-6- fosfát, který je metabolizován. Výhodou tohoto systému je, že fruktóza- 6-fosfát se začleňuje do normálního metabolizmu. U ostatních selekčních systémů transgenní rostliny přeměňují selekční agens na detoxikovanou látku, která ale nemůže být dále metabolizována, což mívá negativní vliv na morfogenetický potenciál transformovaných buněk. 20

2.5. Přímá transgenoze Při přímé transformaci dochází k přenosu genů do rostlinných buněk bez využití A. tumefaciens. Přenášené fragmenty DNA jsou kratší než při transformaci pomocí A. tumefaciens a často se začleňují do genomu v tandemových opakováních (Přikrylová, 2004). Metody přímé transgenoze lze rozdělit podle přenosu cizorodé DNA : do protoplastů do pletiv nebo orgánů intaktních rostlin 2.5.1. Transgenoze protoplastů Pokud je možné u některých druhů regenerovat protoplasty v celistvé rostliny, jsou používány metody transformace izolovaných protoplastů. Cizorodá DNA se vnáší do protoplastů několika způsoby: elektroporací, mikroinjekcemi, lipozómy, aplikací polyetylenglykolu (PEG) nebo působením iontů vápníku. 2.5.1.1. Elektroporace Elektroporace je jednoduchá procedura dovolující transformovat velkého množství buněk najednou a je často užívaná pro transformaci rostlinných protoplastů pro studium tranzientní expresi genů (Koscianska a Wypijewski, 2001). Při této technice jsou buňky podrobeny velmi silnému elektrickému šoku, který způsobí lokální změny v membráně a tím vznik pórů, jimiž DNA prochází do buněk (Rumlová a kol., 2003). 2.5.1.2. Mroinjekce Cizorodá DNA se dopraví do jádra buňky mikroinjekcí. Tato metoda je nejúčinnější a dá se použít na protoplasty, embrya a v případě makroinjekcí i na celá pletiva. Je omezena množstvím protoplastů, které je možno v pokusu tímto způsobem ošetřit (Neuhaus a Spangenberg, 1990). 21

2.5.2. Transformace pletiv a orgánů Některé metody přímé transgenoze jsou kromě aplikace na rostlinné protoplasty použitelné i pro rostlinná pletiva nebo orgány intaktních rostlin. Tyto metody v současné době uplatňují stále častěji. Patří mezi ně mikroinjekce do buněčných jader, makroinjekce do pletiv, kokultivace mikrospor nebo pylových láček s exogenní DNA a mikroprojektily. 2.5.2.1. Mikroprojektily Transformace pomocí mikroprojektilů je rozšířená metoda přímé transformace genů do buněk, tkání a orgánů. Vyžaduje jen minimální předběžné manipulace se vzorkem. Tato technika je oproti jiným technikám přímé transgenoze snadná a rychlá (Bhatnagar a kol., 2002). Principem metody mikroprojektilového přenosu DNA je vstřelování mikroskopických částic netoxických kovů (například zlata nebo wolframu) do jader nebo organel kultivovaných buněk nebo rostlinných orgánů. DNA z roztoku je na částice povrchově přichycena pomocí adheze. V dnešní době jsou komerčně vyráběny přístroje, u kterých lze nastavit potřebné parametry nastřelování (www.vurv.cz). 2.6. Šlechtění rostlin Základem šlechtění je umělí výběr. Ten člověk prováděl od mladší doby kamenné po celou dobu pěstování rostlin. Spočívá v tom, že pro pěstování následující generace se užívají semena nejlepších rostlin. V osmnáctém a devatenáctém století se začíná využívat křížení rostlin. V průběhu druhé poloviny dvacátého století se možnosti šlechtitelských metod podstatně rozšiřovaly. Kromě křížení odrůd se stále více využívalo i vzdálené (mezidruhové) křížení, začala se využívat indukce náhlých neusměrněných dědičných změn mutací. Zvláště v souvislosti se vzdáleným křížením se používala také indukce zdvojnásobení počtu chromozomů některými chemickými látkami. V 70. letech přišlo období využívání tkáňových kultur, pěstování pletiv a orgánů rostlin v agarových kulturách a jejich pozdější přenášení zpět do půdy, což 22

dovolilo vybírat další typy dědičných změn a rozšířit možnosti vzdálené hybridizace. V 80. letech se objevila možnost transgenoze (Drobník a kol., 2002). 2.6.1. Šlechtění na rezistenci Šlechtění na rezistenci je nejúčinnější, nejpřirozenější a nejrozšířenější ochranou před patogeny při pěstování rostlin. 2.6.1.1. Obecné mechanizmy obrany rostlin proti patogenům Rostlina se brání patogenům třemi způsoby: 1. neumožní napadení 2. zabrání jeho šíření a reprodukci, i když rostlinu napadne 3. vyvíjí a reprodukuje se normálně i přes aktivitu patogena První dva principy se nazývají rezistence, třetí tolerance (Chloupek, 1995). 2.6.2. Transgeny pro rezistenci k virům Genové inženýrství umožňuje snáze, rychleji a značně přesněji docílit výsledků dosahovaného klasickým šlechtěním. Transgenoze rostlin na rezistenci k virům využívá několik základních strategií: Rezistence zprostředkovaná genem pro plášťový protein Rezistence k proteinu pro přenos z buňky do buňky Ochrana zprostředkovaná protismyslnou (antisense) RNA Rezistence založená na transgenu pro replikázu RNA interference 23

2.6.2.1. Rezistence zprostředkovaná genem pro plášťový protein Velmi často používaným postupem je exprese plášťového proteinu příslušného viru. použití takto modifikovaných rostlin je založeno na poznatku, že u rostlin infikované virem s mírnými symptomy je méně pravděpodobná možnost napadení jiným, více nebezpečným virem. Nevýhodou je, že tento mechanizmus funguje zpravidla pro úzkou skupinu příbuzných virů (www.agrokrom.cz ). 2.6.2.2. Rezistence k proteinu pro přenos z buňky do buňky Efektivita pohybu viru z buňky do buňky je důležitá pro určování patogenity, virulence a v některých případech pro rozsah hostitelů rostlinných virů. Pokud je pohyb viru v rostlině snížený, získává rostlina určitý stupeň rezistence k virové nákaze. Při pokusech s transgenním tabákem, který produkoval nefunkční protein pro přenos viru z buňky do buňky (MP movement protein), získal rezistenci k TMV (virus tabákové mozaiky) infekci. Navíc transgenní rostliny s nefunkčním TMV MP vykazoval rezistenci proti několika dalším příbuzným či nepříbuzným virům (Seppänen a kol., 1997). 2.6.2.3. RNA interference Poměrně novou metodou je použití RNA interference (RNAi). RNAi je přirozená reakce eukaryontní buňky na přítomnost dvojvláknových RNA (dsrna). Ty jsou poté rozpoznány a rozštěpeny na malé úseky RNAs (sirna), které pak zprostředkují rozštěpení homologních sekvencí nukleotidů mrna. Buňka tak pravděpodobně řídí expresi genů. Další roli může RNA interference hrát v obraně proti virům a mobilním elementům. Transgenní gen, který obsahuje homologní sekvence v sense/antisense orientaci, tvoří po transkripci hairpinrna (hprna), která vytvoří zdvojenou strukturu, ta je pak enzymy naštípána na úseky RNAs dlouhé přibližně 21 nukleotidů. RISC (RNA-Induced Silencing Comple) využívá RNAs jako tzv. průvodce pro nalezení homologních sekvencí na cílové mrna. RISC přibližně ve středu cílových sekvencí rozštípe mrna a ta je pak úplně degradována (www.pi.csiro.au ). Toho lze využít při šlechtění na 24

rezistenci k virům, kde vnesený gen tvoří komplementární hprna k úseku genu pro plášťový protein viru. Transkripce takového úsek v rostlinné buňce má za následek degradaci virové RNA. Pro lepší efektivitu RNAi byl mezi dvě homologní ramena konstruktu hprna vložen intron (ihprna) (Varsha Wesley a kol., 2001). 25

3. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 3.1. Použitý materiál 3.1.1. Rostlinný materiál Jako pokusný materiál byly použity mladé rostliny tabáku viržinského (Nicotina tabacum) kmene SR-1 pěstované in vitro. 3.1.2. Bakteriální kultura Transformace byla prováděna pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens kmen EHA 105 nesoucí plazmid pwell07a. Tato kultura byla dlouhodobě uchovávána v 10 20 % roztoku glycerolu v hlubokomrazícím boxu při teplotě -72 C. Plazmid pwell07a (Obr. 1) má v polylinkerovém místě umístěný selekční gen nos-bar pro rezistenci k fosfinotricinu (PPT), což je účinná látka herbicidu Basta. Fosfinotricin je účinným inhibitorem glutaminsyntetázy u rostlin. Tento enzym mění amoniak na glutamát a tím se významně podílí na odstranění tohoto toxického metabolitu z organismu rostliny (www.osel.cz ). Součástí plazmidu je i reportérový gen pro β-glukuronidázu 35s-GUS a fragment genu pro plášťový protein viru PSbMV v sense/antisense poloze pod 35s CAMV promotorem. Tento gen je vložen do plazmidu ve směru od LB k RB (opačný oproti ostatním genům). 26

Obr. 1 Plazmid pwell07a/b 3.1.3. Média složení 5x B 1 -inositol (na 50 ml) o 0,025 g - thiamine o 2,5 g - myo-inositol o 50 µl - 0,5 M EDTA skladovat při 20 C 27

Miller`s I (na 50 ml) o 3 g - Kh 2 PO 4 (rozpustit ve vodě) skladovat při laboratorní teplotě MS 0/0 médium (na 1 l) o 4,3 g Murashge and Skoog micro and macro elements (Duchefa) o 30 g sacharosa o 2 ml 5x B 1 -inositol o 3,0 ml Miller`s I MS 0.1/1 médium kokultivační (na 1 l) MS 0/0 obsahující: o 6 g - Phytoagar (Duchefa) o 1,0 mg - BA (1 ml zás. roztoku 1mg/ml v KOH) o 0,1 mg - NAA (100 µl zás. roztoku 1 mg/ml v 70 % ethanolu) ph upravit na 5,7 (pomocí KOH) autokláv MS 0.1/1 médiun selekční (na 1 l) MS 0.1/1 médium kokultivační (vyautoklávované) obsahující: o 300 mg augmentinu (rozpuštěn ve vodě) o 2 mg/l PPT (rozpuštěn ve vodě) LB médium (na 1 l) o 10 g trypton o 5 g kvasničný extrakt o 5 g NaCl o 1 ml 1 M NaOH sterilizace 30 minut při 120 C 28

3.1.4. Zásobní roztoky pro přípravu roztoku na histochemický GUS test 100 mm Na 2 HPO 4 /KH 2 PO 4, ph 7,0 o 6,4 % objem 1 M Na 2 HPO 4 o 3,6 % objem 1 M KH 2 PO 4 o 90 % objem voda upravit ph na 7,0, uchovávat při 20 C 50 mm K 4 [Fe II (CN) 6 ] o 0,211 g K 4 [Fe II (CN) 6 ] rozpustit v 10 ml vody přefiltrovat přes sterilní filtr, uchovávat při 20 C 50 mm K 3 [Fe III (CN) 6 ] o 0,165 g K 3 [Fe III (CN) 6 ] rozpustit v 10 ml vody přefiltrovat přes sterilní filtr, uchovávat při 20 C 10 % Triton 100 o vodný roztok 3.2. Metodika roztok na histochemický GUS test o 100 mm Na2HPO4/KH 2 PO 4, ph 7,0 o 10 mm Na 2 EDTA o 5 mm K 4 [Fe II (CN) 6 ] o 5 mm K 3 [Fe III (CN) 6 ] o 0,1 % Triton X 100 o 0,3 % X - Gluc 3.2.1. Transformace listových disků Pro transformaci listových disků tabáku jsme použili 5 ml tekuté kultury (tekuté LB médium bez antibiotik) Agrobacterium tumefaciens nesoucí plazmidový vektor pwell07a, která byla kultivována přes noc při teplotě 28 C. 29

Z rostlin tabáku viržinského kultivovaných in vitro bylo ve flowboxu odstřiženo sterilními nástroji (nůžky, skalpel a pinzeta) několik dobře vyvinutých větších listů. Do petriho misky byl vložen sterilní filtrační papír zvlhčený sterilní vodou. Na filtračním papíře byly z listů sterilním korkovrtem vyraženy disky (průměr asi 1 cm). Disky byly vyráženy mimo hrubou nervaturu listu a celkem jich bylo vyraženo přibližně 40. Vyražené listové disky byly umístěny do petriho misky se suspenzí Agrobacterium tumefaciens (OD 600 > 0,7) a mírným kroužením byly zamíchány. Po 1 minutě byly disky osušeny na sterilním filtračním papíře a přeneseny do petriho misky s MS 0.1/1 médiem. Listové disky byly na médium pokládány vrchní stranou dolů (kvůli zabránění stočení disků). Na jednu petriho misku bylo rovnoměrně umístěno asi deset listových disků. Petriho miska byla pak uzavřena, popsána a zalepena páskou. Listové disky byly kultivovány na rozptýleném světle při teplotě 28 C dva až tři dny. Po té byly petriho misky přemístěny na plné světlo (teplota 28 C). Po třech dnech kultivace byly pro ověření transformace odebrány 4 listové disky a byl proveden GUS test. Pro odstranění baktérií A. tumefaciens byly zbylé listové disky přepasážovány ve flowboxu do petriho misek s médiem MS 0.1/1 s augmentinem (300 mg/l). Asi po 7 dnech kultivace na plném světle při teplotě 23 C byly listové disky přepasážovány do větších krabiček opět na médium MS 0.1/1 s augmentinem a byly kultivovány za stejných podmínek dalších 7 dnů. 3.2.2. Selekce transformovaných disků Po 14 dnech kultivace na médiu MS 0.1/1 s augmentinem byly listové disky přepasážovány ve flowboxu na selekční medium MS 0.1/1 s augmentinem 300 mg/l a PPT 2 mg/l). Na tomto médiu přežijí jen rostliny s odolností na fosfinotricin (měly by přežít pouze transformované rostliny). Listové disky byly takto kultivovány 14 dnů na plném světle při teplotě 23 C. Po té byly listové disky několikrát přepasážovány podle potřeby po 14 dnech až 5 týdnech ve flowboxu na médium MS 0.1/1 s augmentinem (30 mg/l) při plném osvětlení a teplotě 23 C až do tvorby kořínků. Pak byly regenerované rostliny zasazeny do substrátu. Ověření transformace regenerovaných rostlin bylo provedeno GUS testem z odebrané části listu. 30

3.2.3. Histochemický GUS test transformovaných rostlin (Gelvin a Schilperppet, 1995; Potrykus a Spangenberg, 1995) Testované listové disky tabáku a po regeneraci rostlin i části listu byly inkubovány v GUS roztoku při 37 C po dobu 24 hodin. Odbarvení zeleného zbarvení vzorků bylo provedeno inkubací v 70 % ethanolu po dobu několika dní. 3.2.4. Ozdravování kontaminovaných listových disků Kontaminované rostliny tabáku byly buď propírány v roztoku sterilní vody a antibiotik (500 mg augmentin + 500 mg timentin na 1 litr) asi 1 hodinu a nebo byl roztok nalit přímo ke kontaminovaným rostlinám tabáku (asi 1 cm na dno). 31

4. VÝSLEDKY 4.1. Založení pokusu V první fázi naší práce se na listové disky tabáku nechaly působit bakterie A. tumefaciens, které obsahovaly plazmid pwell07a. Takhle bylo založeno asi 40 listových disků rozdělených do 4 petriho misek. V průběhu kultivace byla na jedné petriho misce objevena kontaminace. Kontaminované listové disky se zkoušely sterilizovat vodným roztokem s antibiotiky, kontaminace se ale objevovala stále. 4.2. Ověření transformace listových disků Po 6 dnech kultivace bylo pomocí GUS testu zkoušeno, zda jsou listové disky transformovány. Na zkoušku byly náhodně vybrány 4 listové disky a kontrola. Jako kontrola byla použita část listu ze starší rostliny tabáku do které byl vložen gen pro β-glukuronidázu. Po odbarvení zelené barvy se na listových discích objevily modré skvrny lokalizované hlavně po obvodu disků, kde bakterie A. tumefaciens díky poranění rostliny pronikala nejsnáze (Obr. 2). To dokazuje expresi vloženého genu pro β- glukuronidázu a tedy úspěšnou transformaci listových disků. 32

Obr. 2 Histochemický GUS test transformovaných listových disků tabáku. Pozice 1A, 1B, 2A a 2B - listové disky transformované plazmidem pwell07b. Pozice 3A, 3B, 4A a 4B - listové disky transformované plazmidem pwell07a. Pozice 5A a 5B - kontrola (5A negativní, 5B pozitivní). 4.3. Kultivace rostlin tabáku Po transformaci byly zbylé listové disky tabáku (asi 30 disků) umístěny po šesti až sedmi na petriho misku s médiem MS 0.1/1 s augmentinem, kde se odstranily bakterie A. tumefaciens. V průběhu kultivace na tomto médiu začaly listové disky regenerovat (Obr. 3) a na jedné petriho misce se opět objevila kontaminace. Po přepasážování na selekční medium s augmentinem a fosfinotricinem rostliny tabáku s odolností k fosfinotricinu dále regenerovaly, ale u většiny rostlin se objevila kontaminace. V průběhu další kultivace na médiu MS 0.1/1 s augmentinem se musela kvůli kontaminaci odstranit většina rostlin tabáku. Plně regenerovat se podařilo tři rostliny tabáku, z nichž jedna po přesazení do substrátu uhynula. 33

Obr. 3 Listové disky tabáku po 7 dnech kultivace na médiu MS 0.1/1 s augmentinem. 4.4. Ověření transformace regenerovaných rostlin Provedený GUS test dokázal, že jedna ze tří dopěstovaných rostlin tabáku byla transgenní (Obr. 4). Obr. 4 Histochemický GUS test části listů regenerovaných rostlin. Pozice 1A až 5A části listu transformované plazmidem pwell07b. Pozice 6A a 1B části listu transformované plazmidem pwell07a. Pozice 2B - pozitivní kontrola. 34

5. DISKUSE Cílem naší práce bylo zjistit, zda je pomocí vektorového systému A. tumefaciens kmene EHA 105 nesoucí plazmid pwell07a možné transformovat rostliny. Tento plazmid nese fragment genu pro plášťový protein viru semenem přenosné mozaiky hrachu v pozici sense/antisense, který by měl po vnesení do rostlin hrachu navozovat rezistenci k tomuto viru. Transformace a regenerace in vitro hrachu je však obtížná a tak se účinnost vektoru zkoušela na poměrně lehce transformovatelném tabáku. Pro ověření transformace listových disků byl použit GUS test. Po odbarvení testovaných vzorků se na listových discích tabáku objevili modré skvrny. Oproti kontrole byly modré skvrny intenzivnější. To může být způsobeno nižší aktivitou promotoru 35S ve starších pletivech kontrolní rostliny nebo začleněním T-DNA do méně intenzivně transkribovaného místa v genomu kontrolní rostliny. I přesto, že v průběhu selekce transformovaných rostlin tabáku došlo u většiny kultivovaných vzorků ke kontaminaci, rostliny tabáku na selekčním médiu dále rostly. To svědčí o odolnosti tabáku k fosfinotricinu, kterou rostliny získali transformací genem pro rezistenci k fosfinotricinu (součást T-DNA plazmidu pwell07a). Díky kontaminaci se nám podařilo dopěstovat jen tři rostliny tabáku, z nichž jedna uhynula po přesazení do substrátu. V závěru práce se testovaly úplně regenerované rostliny tabáku. GUS test dokázal úspěšnou transformaci u jedné ze dvou rostlin tabáku. Netransformovaná rostlina zřejmě díky přirozené odolnosti k fosfinotricinu přežila i na selekčním médiu. 5.1. Závěr Podařilo se nám transformovat listové disky tabáku viržinského (Nicotina tabacum) a z nich dopěstovat celé rostliny. Pomocí GUS testu jsme prokázali transformaci jedné rostliny tabáku. To znamená, že je možné pomocí vektorového systému A. tumefaciens kmene EHA 105 nesoucí plazmid pwell07a transformovat dvouděložné rostliny a také je možno použít tento vektorový systém při pokusech vytvořit transgenní rostliny hrachu, které by mohly být odolné k PSbMV. 35

6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Bednář, J. Základy genového inženýrství rostlin. 1. vyd. Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2000. 104 s. ISBN 80-7157-470-8. Bhatnagar, S., Kapur, A., Khurana, P. Evaluation of parameters for high efficiency gene transfer via particle bombardment in Indian mulberry. Indian J Exp Biol 2002. 40(12): 1387-92. Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, hairpinrnai a powerful technology to accelerate breeding in crop and horticultural plants. [online], 2005, [citace 23.4.2007], Dostupné na Internetu <http://www.pi.csiro.au/rnai/> Drobník, J., Ondřej, M., Petr, J. Geneticky modifikované organismy v zemědělství. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 2002. 71 s. ISBN 80-7271-107-5 Gelvin, S.B., Schilperoort, R.A. Plant molecular biology manual. Kluwer academic publishers, Dordrecht 1995. Hess, D. Versuche von Transformation an höheren Pflanzen (Wiederholung der Anthocyanin Induction bei Petunia undn Charakterisierung der transformierenden Prinzips). Z. Pflanzenphysiol 1969. 61: 286-298. Hess, D., Schneider, G., Lörtz, H., Blaich, G. Investigation on the tumor induction in Nicotiana glauca by pollen transfer of DNA isolated from Nicotiana langdsdorfii. Z. Pflanzenphysiol 1976. 77: 247-254. Chilton, M.-D., Drummond, M. H., Merlo, D. J., Sciaky, D., Montoya, A. L., Gordon, M. P., Nester, E. W. Stable incorporation of plazmid DNA into higher cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis Cell 1977. 11: 263-271. Chloupek, O. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. 1. vyd. Akademie věd České republiky, 1995. 186 s. ISBN 80-200-0207-3. 36

Koscianska, E., Wipijewski, K. Electroporated intact BY-2 tobacco culture cells as a model of transient expression study. Acta Biochim Pol 2001. 48 (3): 657-61. Ledux, L., Huart, R. Integration and replication of DNA of Micrococcus lysodeikticus in DNA of germinating barley. Nature 1968. 218: 1256-1259. Ledoux, L., Huart, R., Jacobs, M. DNA-mediated genetic correction in thiaminelsess Arabidopsis thaliana. Nature 1974. 249: 17-21. Neuhaus, G., Spangenberg, G. Plant transformation by microinjection techniques. Physiol 1990. 79: 213-217. Ondřej, M., Drobník, J. Transgenoze rostlin. 1. vyd. Akademie věd České republiky, 2002. 316 s. ISBN 80-200-0958-2. Pavlas, J., Polzerová, H. Možnosti transgenoze k rozšíření genetické variability bramboru. [online], [citace 21.4.2007], Dostupné na Internetu <http://www.agrokrom.cz/texty/metodiky/brambory/clanky_brambory/transgenoze_k_rozsireni_geneticke_vari ability_bramboru.pdf> Pazdera, J., Transgenní plodiny se mohou křížit s plevelem. [online], 2005, [citace 28.4.2007], Dostupné na Internetu <http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&akce =showall&clanek=1390&id_c=3886> Pniewski, T., Kapusta, J. Efficiency of transformation of Polish cultivars of pea (Pisum sativum L.) with variious regeneration capacity by using hypervirulent Agrobacterium (tumefaciens strains. J Appl Genet 2005. 46 (2): 139-147. Potrykus, I., Spangenberg, G. Gene transfer to plants. Springer-Verlag, Berlin. 1995. Procházka, S., Macháčková, I., Krekule, J., Šebánek, J. Fyziologie rostlin. 1. vyd. Akademie věd České republiky, 1998. 484 s. ISBN 80-200-0586-2. 37