MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2007 OMELKOVÁ VLADIMÍRA 1
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Název bakalářské práce Mikrobiální aspekty nitkovitosti mouky Vedoucí práce: Prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc. Vypracovala: Omelková Vladimíra Brno 2007 2
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Agronomická fakulta 2006/2007 ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Řešitelka: Studijní program: Obor: Vladimíra Omelková Chemie a technologie potravin Technologie potravin Název tématu: Mikrobiální aspekty nitkovitosti mouky Zásady pro vypracování: 1. Zpracovat literární rešerši zaměřenou na charakteristiku mikroorganismů vyvolávajících nitkovitost mouky a pekárenských výrobků. 2. Specifikovat způsoby ochrany pekárenských výrobků před nitkovitostí. 3. Prověřit výskyt bakterií rodu Bacillus ve vybraných mlýnských a pekárenských surovinách a výrobcích. 4. Porovnat dosažené výsledky s literárními údaji a požadavky na mikrobiologickou kvalitu mlýnských a pekárenských surovin a výrobků Rozsah práce: 30-40 str., tabulky, grafy Seznam odborné literatury: 1. Doyle,M.P. et al. (2001) Food Microbiology ASM Press, Herndon 2. 3. Görner F., Valík,L. (2004) Aplikovaná mikrobiologia poživatín. Malé centrum, Bratislava, 528 str. Jičínská,E.,Havlová,J. (1998) Mikrobiologická kontrola potravin a potravinářských surovin v legislativě EU, Praha 4. Madigan,M.T. et al. (2000): Biology of Microorganisms. Prentice Hall 3
5. Pichhardt,K. (1998) Lebensmittelmikrobiologie, Berlin 6. 7. Tichá,J. (1988): Mikroorganismy a jiní škůdci v mlýnskopekárenském průmyslu a ochrana proti nim. SNTL Praha, 151 str. Šilhánková,L. (2002) Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology 3. upravené vydání Academia, Praha Datum zadání bakalářské práce: prosinec 2005 Termín odevzdání bakalářské práce: duben 2007 Vladimíra Omelková řešitelka bakalářské práce prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc. vedoucí bakalářské práce prof. Ing. Jaroslav Hlušek, CSc. vedoucí ústavu prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. děkan AF MZLU v Brně 4
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: mikrobiální aspekty nitkovitosti mouky vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. diplomanta. podpis 5
Děkuji tímto vedoucí této bakalářské práce Prof. RNDr. Martě Tesařové, CSc. za odborné vedení a připomínky, které věnovala mé práci. Zároveň děkuji celému kolektivu ústavu agronomie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin.dále děkuji všem, kteří napomohli při vytvoření této bakalářské práce, zvláště pak Ing. Václavu Brachtlovi a RNDr. Anně Ivanové. 6
SOUHRN Cílem této bakalářské práce je zjistit mikrobiální aspekty nitkovitosti mouky. Nitkovitost mouky je mikrobiální vada, která je způsobená bakteriemi rodu Bacillus. Bakterie Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus se mohou do chleba a pečiva dostávat primární kontaminací ze surovin a nebo sekundární kontaminací během skladování mouky, přípravy náplní, chlazení a skladování. Optimální teplota pro vznik nitkovitosti je teplota 30-35 C a vlhké prostředí. Nitkovitost se projevuje mazlavou, tmavou a zapáchající střídkou a později se ve střídce vytváří dlouhé nitě. U vybraných vzorků byl stanoven celkový počet mikroorganismů, počet plísní a především počet sporulující bakterií Bacillus subtilis. Jednotlivé výsledky jsou uvedeny v tabulkách a grafech. Nejvíce byly kontaminovány vzorky pšeničné mouky polohrubé a pšeničné mouky hrubé. Výsledky stanovení nepřesáhly hodnoty 10 2 KTJ v 1 g mouky. Vzorky odpovídají mikrobiálním požadavkům uvedených ve vyhlášce MZd. č. 91/1999 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny. Klíčová slova: nitkovitost mouky, mouka, výroba pečiva, charakteristika mikroorganismů ABSTRACT The objective of the bachelor thesis was to characterize the ropiness of meal. The ropiness of meal is microbial defect, which is curred by bacteria of the genus bacilley above all by Bacillus subtilis and Bacillus mesentericus. The species come from different primary and secondary soarces the most important for their development is storage temperature and humidity of meal. The ropiness is repressed by greasy dark and fetid bread-rumb and later with in bread- rumb long sewings. In the laboratory experiments, five samples of meals were analysed for total counts of microorganisms, counts of sporuluting bacteria and moulds. Presence of Bacillus subtilis was estiemaled, too counts of microorganisms reached 10 2 KTJ per 1 g of meal. The words: ropiness meal, meal, production Bread, characteristic microorganism 7
OBSAH 1. ÚVOD...10 2. CÍL PRÁCE...11 3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY...12 3.1 Výroba pečiva...12 3.1.1 Charakteristika pečiva... 12 3.1.2 Suroviny používané na výrobu pečiva... 12 3.1.3 Technologie výroby pečiva... 15 3.1.4 Ukazatele jakosti pečiva... 18 3.1.5 Mikrobiologická charakteristika pečiva... 20 3.2 Bakterie způsobující nitkovitost chleba...20 3.2.1 Charakteristika bakterií rodu Bacillus... 21 3.2.1.1 Reakce rodu Bacillus na fyzikálně chemické podmínky... 22 3.2.1.2 Metabolismus bakterií rodu Bacillus... 22 3.2.1.3 Tvorba spor... 23 3.2.2 Výskyt bakterií rodu Bacillus v mlýnských a pekárenských surovinách a výrobcích... 24 3.3 Nitkovitost chleba...24 3.3.1 Druhy výrobků, u kterých byl zjištěn výskyt B. subtilis, B. mesentericus, B. licheniformis... 26 3.3.2 Ochrana pekárenských výrobků před pomnožováním bakterií B.subtilis, B. mesentericus a B. licheniformis... 27 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST...30 4.1 Analyzované mouky popis vzorků...30 4.1.1 Příprava vzorků a živných půd... 30 4.1.2 Příprava mikrobiologické analýzy a složení živných půd... 30 4.2 Stanovované skupiny mikroorganismů...31 4.2.1 Stanovení celkového počtu mikroorganismů... 31 4.2.2 Stanovení plísní... 32 4.2.3 Stanovení sporulujících bakterií... 32 4.2.4 Zjištění průkaznosti bakterií způsobující nitkovitost... 32 8
4.3 Výsledky a diskuse...32 5. ZÁVĚR...39 6. LITERATURA...40 9
1. ÚVOD Obiloviny jsou strategickou a historicky nejvýznamnější plodinou. Člověk nejprve sbíral semena z planě rostoucích rostlin a jimi doplňoval především masitou stravu. Archeologické výzkumy dokládají, že již v dobách neolitu, kdy člověk poznal jejich nenahraditelnost, je začal pěstovat. Obiloviny patří botanicky mezi trávy. Téměř všechny známé obiloviny patří do čeledi lipnicovité (Kučerová, 2004). Vlastní historie pekařství byla zahájena poznáním kvasných pochodů a následnou výrobou kvašeného chleba. Staří Egypťané využívali technologii kvašení již ve 13 stol. př. n. l. Výrobu chleba rovněž znali Židé a Řekové již před 3 500 lety a pro rozkvašování používali kousek starého zralého těsta, nebo rozkvašené sladké víno (Steibel, 1996). Cereální výrobky mají ve výživě člověka nezastoupitelné místo. Jsou především zdrojem energie, sacharidů a rostlinných bílkovin. Vzhledem k výši spotřeby jsou také významné obsahem vitamínů skupiny B a fosforu (Nováková, 2000). Dále zrno obsahuje biologicky významné látky jako cholin, který má velký význam pro nervomotorickou činnost. Kyselina para-aminobenzoová je významný růstový faktor. Cereálie mají zvýšený obsah tzv. fytochemikálií (flavanoidy, glukanáty, fytáty, ligniny), které mají ochranný účinek vůči některým onemocněním (Kučerová, 2004). Pekařské výrobky bezesporu patří mezi potraviny denní spotřeby, ze statistických údajů lze vyčíst, že spotřeba běžného pečiva se dnes pohybuje okolo 40 kg na osobu a rok, u chleba je to 55 kg na osobu a rok a u trvanlivého pečiva 7 kg na osobu a rok (Nováková, 2000). Dnešní spotřebitelé již nehodnotí nabízené produkty pouze podle jejich ceny, ale kladou důraz i na kvalitu výrobku, zejména na jeho senzorickou jakost a zdravotní nezávadnost. Výroba a distribuce pekařských výrobků vyžadují v zájmu uspokojení požadavků spotřebitele a ochrany jeho zdraví vysoký stupeň čistoty. Je tedy velice důležité, aby mlýnsko-pekárenský a cukrárenský průmysl zajišťoval hygienicky bezvadný stav svých provozoven, skladovacích prostor, manipulačních pomůcek i přepravních prostředků (Tichá, 1988). Tato práce si klade za cíl posoudit, zda a do jaké míry jsou pekařské výrobky kontaminovány mikroorganismy vyvolávající nitkovitost během jejich výroby. 10
2. CÍL PRÁCE Hlavním záměrem této bakalářské práce bylo posouzení mikrobiální kontaminace mouky Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus, které způsobují nitkovitost. Byly vytyčeny následující cíle: zpracovat literární přehled o technologii výroby pečiva a druzích Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus provést mikrobiální analýzy vybraných mouk vyhodnotit dosažené výsledky a vytvořit fotodokumentaci zjištěných mikroorganismů 11
3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3.1 Výroba pečiva Bakterie, které způsobují mikrobiální nitkovitost chleba a pečiva se mohou do produktu dostávat buďto primární kontaminací a to ze surovin, především z mouky a nebo sekundární kontaminací a to je během skladování mouky, přípravy náplní, plnění, chlazení, balení a skladování. 3.1.1 Charakteristika pečiva Pekařským výrobkem rozumíme výrobek získaný tepelnou úpravou těst nebo hmot jejichž sušina je tvořena hlavně mlýnskými obilními výrobky (vyhláška MZe č. 333/1997 Sb.). Základní druhy pekařských výrobků: Chléb je pekařský výrobek kypřený kvasem popřípadě droždím, o hmotnosti minimálně 400 g s vyjímkou krájeného, ve tvaru veky, bochníku nebo formovaného. Běžné pečivo je tvarovaný pekařský výrobek, vyrobený z pšeničné nebo žitné mouky, přísad a přídatných látek, který obsahuje méně než 8,2 % bezvodého tuku a méně než 5% cukru, vztaženo na celkovou hmotnost mlýnských obilných výrobků. Jemné pečivo je pekařský výrobek získaný tepelnou úpravou těst nebo hmot s recepturním přídavkem minimálně 8,2 % bezvodého tuku či 5 % cukru na celkovou hmotnost použitých mlýnských výrobků. Trvanlivé pečivo je pekařský výrobek z mouky, přísad a přídatných látek s obsahem vody max. 6 % s vyjímkou piškotů (8 %), perníků, preclíků a trvanlivých tyčinek s obsahem vody max. 16 %. 3.1.2 Suroviny používané na výrobu pečiva Mouka je univerzální surovina pro výrobu celého pekařského sortimentu, ve většině těst tvoří 60 % i více z jejich hmotnosti. Rozhodující význam pro výrobu pečiva má pšeničná mouka. Žitná mouka se používá téměř výhradně k výrobě chleba, v pečivu ji najdeme vyjímečně (např. dalamánky). Předehřátá a prosátá mouka ve výrobě musí odpovídat veškerým jakostním a hygienickým požadavkům. Dle vyhlášky MZe č. 333/1997 Sb. se 12
moukou rozumí mlýnský obilný výrobek získaný mletím obilí a tříděný podle velikosti částic, obsahu minerálních látek a druhu použitého obilí. Senzorické, fyzikální a chemické požadavky na jakost mouky. Na jakost mouky jsou kladeny následující požadavky (Tab. 1 a 2) dle vyhlášky č. 333/1997 Sb. Vlhkost mouk ze všech druhů obilovin, pohanky a rýže smí být nejvýše 15 %. Kukuřičná mouka smí obsahovat nejvýše 3 % tuku v sušině. Mouky nesmějí být běleny chlorem. Celozrnné mouky smí obsahovat nejvýše 1,9 % minerálních látek. Tab. 1 Fyzikální a chemické požadavky na mouky (příloha 2 vyhlášky č. 333/1997 Sb.). Podskupina Granulace*1(µm%) velikost ok/propad nejméně /nejvýše Minerální látky (popel)*2 (% hmotnosti v sušině) nejvýše Mouka hladká z toho 257/96 162/75 - Pšeničná světlá - 0,6 Pšeničná polosvětlá - 0,75 Pšeničná chlebová - 1,15 Žitná světlá (výražková) - 0,65 Žitná tmavá (chlebová) - 1,1 Mouky polohrubé 366/96 162/75 0,5 Mouky hrubé 485/96 162/15 0,5 *1 granulace = velikost podílu částic, které propadají sítem stanovené velikosti ok *2 minerální látky (popel) = nespalitelné látky, které zůstanou po spálení Tab. 2 Senzorické požadavky na jakost mouky (příloha 2 vyhlášky 333/1997 Sb.) Název mouky Barva Mouka pšeničná Bílá s nažloutlým odstínem Mouka chlebová Bílá se žlutozeleným nebo našedlým odstínem Mouka celozrná Hnědavý načervenalý nebo tmavočervený odstín Mouka žitná světlá výhražková Bílá Mouka žitná tmavá (chlebová) Šedobílá se zelenomodrým odstínem 13
Tab. 3 Fyzikální a chemické požadavky na směsi na výrobu vybraných druhů pekárenských výrobků Druh výrobku Chlebové výrobky Pšeničné pečivo běžné Pšeničné pečivo jemné Voda Vlhkost v Obsah Popel v % Titr. Min. % nejvýše NaCl v % nejvýše Kyseliny mmol.kg -1 nečistoty v % nejvýše 14 4,0 4,0 140 0,15 14 3,0 3,0 100 0,15 14 3,0 2,5-0,15 v pekárenství se smí používat pouze pitná voda (dle zákona č. 254/2001 Sb.), která je čirá, bez vůně nebo pachu, s přirozenou chutí, prostá organického zákalu a bezbarvá. Samozřejmostí je mikrobiální čistota a nepřítomnost choroboplodných zárodků i většího množství zdravotně nezávadných mikroorganismů, které by mohly nepříznivě projevovat při kvasných procesech. Sůl je základní surovinou, která nechybí v žádné receptuře pro kynuté výrobky a to i sladké. Její množství se pohybuje mezi 0,5 až 2,5 % na hmotnost mouky. Funguje nejen jako chuťová přísada, ale především jako regulátor technologických procesů. Droždí je nejběžnější kypřící prostředek do všech kynutých těst z pšeničné mouky. Funkce droždí vyplývá z jeho biologické podstaty, jedná se o aktivní buňky kvasinky Saccharomyces cerevisiae metabolizující cukerné substráty na ethanol a oxid uhličitý, který je při kynutí těsta zachytáván lepkem,čímž dochází ke zvětšení objemu a po propečení k charakteristické pórovitosti. Kvasinky dodávají těstu charakteristickou vůni (Skoupil, 1994). 14
Enzymové přípravky jejich hlavní složkou jsou enzymy, které jsou přirozeně obsaženy v mouce a obsahují je i kvasinky. Kvasinky dovedou zkvašovat pouze některé mono- a disacharidy, proto musí nejprve dojít k odbourání škrobu pomocí enzymů na zkvasitelné cukry. 3.1.3 Technologie výroby pečiva Výroba pečiva je vícestupňový proces (viz. schéma 1) 15
Schéma 1 hlavních technologických kroků pekárenského výrobního postupu (Čepička a kol, 1995) Skladování mouky Skladování surovin Příprava fermentačních předstupňů (omládku, kvasů) Příprava těst Příprava náplní Zrání těst Dělení těsta Předkynutí Tvarování Plnění Dokynutí Pečení Chladnutí, příprava, potahování, balení, expedice 16
Příprava těsta Při výrobě těsta pro pšeničné pečivo lze postupovat dvojím způsobem: První způsob je přímé vedení, které je z hlediska času a pracnosti výhodnější. Těsto se připraví smícháním veškerých surovin podle receptury a následná doba zrání závisí na způsobu hnětení a použitých zlepšujících přípravcích. Druhý způsob je nepřímé vedení, jehož podstatou je příprava kvasného stupně před přidáním ostatních surovin a smícháním v těsto. Tento způsob vedení nevyžaduje drahé zlepšující přípravky ani vysoké dávky droždí, ale je náročnější na kvalitu surovin, kvalifikovanost pracovníků a čas a prostor v pekárně (Fance, Inst 1978). Na přípravu těsta je možno použít univerzální šlehací a mísící stroj nebo kontinuální výrobních pšeničných těst (KVPT) oba dva typy strojů umožňují dokonalé mísení, hnětení a zrání těsta. Dělení a tvarování Zralé, vyhnětené těsto se dělí na řezy předepsané velikosti, které se nechají 3 až 8 minut mírně předkynout a pak se ručně nebo strojově tvarují. Nejběžnějším mechanizačním prvkem pro tvarování běžného pečiva je rohlíkový stroj, ve kterém se výrobek rozválí na placku a ta se protisměrným pohybem svine mezi pásy a výsledný rohlík se protáhne do délky (Ingr, 1993). Kynutí a vlažení Kynutí tvarovaných syrových výrobků probíhá v teplém a vlhkém prostředí, aby těsto neokoralo. Za optimální se považuje teplota ovzduší 30 35 C s relativní vlhkostí 75 85 %. Proces kynutí probíhá v boxových nebo průběžných kynárnách. Dobu kynutí výrazně ovlivňuje tvarování, přičemž ražené tvary kynou rychleji (25 30 min). Před sázením do pece se povrch dokynutého syrového výrobků upravuje, což spočívá ve vlažení, případně sypání solí, kmínem, sezamem. Správným zavlažením pečiva se dosahuje hladkého povrchu, stejnoměrného tvaru a velkého objemu pečiva (Pelikán, 1999). Sázení do pece Sázení do pece lze provádět různými způsoby podle typu pece a stupně mechanizace. Nejdokonalejší je sázení do průběžných pecí, kde se syrové výrobky pečou bez plechů, přímo na ocelovém pletivovém dopravníku, který tvoří pečnou plochu. U malých periodických pecí bývá sázení obtížnější. U sázecích pecí s pevnou pečnou plochou se provádí ručně sázecí lopatou, u výtažných pecí se vysune celá plocha a připravené plechy se na ni rozmístní (Ingr, 1993). 17
Pečení Pečením se v první fázi zvětšuje objem pečiva, pak se fixuje tvar, vytváří se aromatická tmavší kůrka a dociluje se stravitelnosti výrobku. Pečný prostor se vytápí na 250 až 270 C, doba pečení je poměrně krátká, u pečiva s hmotností 45 g je to 12 až 13 min. (Pelikán, 1999). Kvalitu běžného pečiva příznivě ovlivňuje pára v pečícím prostoru, která se sráží na chladnějším povrchu pečiva a udržuje jej vláčný a umožňuje tak zvětšení pečiva. Tato pára vzniká částečně odpařením vody z těsta a částečně je přiváděna zapařovacím systémem. Pečivo se většinou peče v průběžných pásových pecích (Ingr, 1999). Vyjímání z pece - vypékání Hotový výrobek se vypéká tzn. vyjímá se z pece tak, aby nedošlo k jeho deformaci. Vypékání závisí na typu použité pece, kdy u průběžných pásových pecí probíhá mechanicky pomocí dopravníku a u malých periodických pecí je ruční. Po vyjmutí z pece se pečivo odpočítá a umístní do čistých přepravních beden, ve kterých ve skladových prostorách zchladne. 3.1.4 Ukazatele jakosti pečiva Požadavky, které jsou kladeny na jednotlivé druhy pekařských výrobků jsou uvedeny v 14 vyhlášky 333/1997 Sb. příloha č. 9 (viz. tab. 4) Tab. 4 Požadavky na jakost jednotlivých druhů pekařských výrobků Vzhled a tvar Kůrka, povrch střídka Vůně a chuť Chléb Pravidelně formovaný, Čistá, zlatohnědé Dobře propečená, Chlebová, příjemná klenutý barvu, bez zřetelně obnažené střídky pórovitá, pružná, stejnorodá Běžné pečivo Pravidelně formované, klenuté Zlatohnědé barvy, čistá, křupavá, bez zřetelně obnažené střídky Dobře propečená, pórovitá, pružná, stejnorodá Pečivová příjemná 18
Jemné pečivo z kynutého těsta Pravidelně formované, klenuté nebo plněné Charakteristické barvy, bez zřetelně obnažené střídky Dobře propečená, pórovitá, vláčná, pružná Jemná pečivová, příjemná,s příchutí přidaných složek Trvanlivé pečivo Typická barva Křehká, u laminovaných Příjemná, dle přísady výrobků vrstevnatý lom Sušenky Pravidelné Světle hnědý Křehká Jemná podle formy Oplatky Dle formy Křehký, otisk Křehká Jemná formy Perník Dle formy Celistvý, čistý Vláčná Dle přísad Jakost pečiva vyrobeného z žitné mouky je závislá od průběhu a stupni vykynutého těsta. Hlavními znaky jeho kynutí jsou hodnota ph a titrační kyselost. Hodnota ph ovlivňuje nejvíce fyzikální vlastnosti střídky (elasticitu, nakypření, pórovitost aj.). Titrační kyselost a s ní související poměr kyseliny mléčné a kyseliny octové určuje senzorické vlastnosti střídky. Kynutí těsta z žitné mouky zabezpečuje žitným produktům tyto pozitivní vlastnosti: tvorbu kyseliny mléčné a octové, bakteriemi rodu Lactobacillus a tímto způsobené snížení hodnoty ph těsta úpravu pečivosti mouky zvýšením její schopnosti bobtnat a snížení odbourávání škrobu ochranu těsta proti nežádoucí fermentaci (Enterobacteriaceae) zabránění nebo zpomalení růstu a rozmnožování bakterií rodu Bacillus (Bacillus subtilis) a plísní podpora růstu acidotolerantních kvasinek tvorbu oxidu uhličitého způsobující pórovitost a příslušný objem chleba tvorba aromatických a chuťových látek metabolismem bakterií mléčného kvašení a kvasinek (Görner, Valík 2004) 19
3.1.5 Mikrobiologická charakteristika pečiva Čerstvé pečivo neobsahuje na povrchu ani uvnitř žádné vegetativní formy mikroorganismů vzhledem k používaným vysokým teplotám během technologie výroby. Při pečení pšeničného pečiva se dosahuje teploty až 280 C což znamená, že v okamžiku vypékání (vyjímání pečiva z pece) ho lze považovat za sterilní produkt. V průběhu expedice, dopravy a manipulace se na zchladlý povrch pečiva dostávají různé skupiny mikroorganismů, kteří se mohou stát původci jeho kažení (Šroubková 1996). Kontaminace povrchu pekařských výrobků se děje dvěma způsoby: přímo dotykem nebo znečištěnými plochami (nádobí, nářadí, obalový materiál) nepřímo vzdušnou infekcí Množství mikroorganismů v pekařských výrobcích je různé, je závislé nejen na technologickém procesu, ale zejména na způsobu nakládání s výrobky od vyjmutí z pece, až po konzumaci spotřebitelem. Celkové množství mikroorganismů však může dosáhnout až 10 5 na g výrobku. Při překročení hodnoty 10 7 na g výrobku se projeví viditelná vada. Dnes jsou mikrobiologické požadavky na různé druhy pekárenských výrobků v ČR upraveny vyhláškou MZd č. 91/1999 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny. 3.2 Bakterie způsobující nitkovitost chleba Nitkovitost chleba způsobují bakterie rodu Bacillus, které jsou řazeny do třídy Bacilli, řádu Bacillus. Třída Bacilli jsou grampozitivní koky i tyčinky, aerobní i fakultativně anaerobní. Patří do velké skupiny grampozitivních bakterií s nízkým procentuálním obsahem G+C v DNA. Fylogeneticky se jedná o jednotnou třídu se dvěma řády. S produkcí endospor a nebo jejich absencí, zástupci jednotlivých rodů jsou navzájem fenotypově velmi rozdílní. Řád Bacillales, charakteristika odpovídá popisu třídy Bacilli. Silná pevná mureinová stěna obsahující teichoové kyseliny a lipoteichoovou kyselinu, buňky mohou být pohyblivé. Barví se grampozitivní, často tvoří endospóry. Anaerobní nebo aerobní organoheterotrofové (Sedláček, 2006) Rod Bacillus druhy Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus. Bakterie jsou skupina mikroorganismů morfologicky i biochemicky rozmanitých. Jsou to jednobuněčné organismy, množící se příčným dělením. Nemají buněčné jádro - 20
genetický materiál je soustředěn v jedné molekule DNA. Bakterie mají pevnou buněčnou stěnu, která jim dává tvar a chrání je před vnějším prostředím. Na vnitřní straně buněčné stěny je semipermeabilní membrána, která má pro buňku význam a to, že působí jako osmotická bariéra, umožňuje aktivní transport živin do buňky, a to proti koncentračnímu spádu. Na membráně jsou vázány četné enzymy, které katalyzují jednotlivé enzymové reakce. Semipermeabilní membrána se zúčastňuje mechanismu dělení buňky. Výskyt, bakterie jsou všudypřítomné, vyskytující se v půdě, ve vodě, ve vzduchu (Tichá, 1988). 3.2.1 Charakteristika bakterií rodu Bacillus Rod Bacillus v sobě zahrnuje celou řadu druhů s podobnými biochemickými vlastnostmi. Jsou to tyčinkovité bakterie, označující se jako bacily. Velikost buněk je 2 až 3 um x 0,7 až 0,8 um. Jsou převážně pohyblivé, způsob výživy je chemoorganotrofní a optimální kultivační teplota je 30 C. U většiny druhů mají peritrichní umístnění bičíků (http://www.vscht.cz). Jsou schopné vytvářet vysoce rezistentní intracelulární spory. Jsou přítomny v povrchových vrstvách půdy, kde se zúčastňují přeměny složitých organických látek. Odtud se dostávají do vzduchu, do vody, na rostliny a jejich plody. Proto jsou hojně přítomny na cereáliích, z nichž se při mlecím procesu dostávají do mouky (Tichá, 1988). Vzhledem k velkému množství druhů je druhová diferenciace obtížná. Tvar endospóry i mateřské buňky jsou charakteristickými znaky jednotlivých druhů bacilů využitelných v taxonomii. Podle těchto charakteristik je možno dělit více než 60 zástupců rodu Bacillus do tzv. tří morfologických skupin: I. morfologická skupina endospóry oválného tvaru, endospóra neztlušťuje mateřskou buňku. Do této skupiny patří zmiňované druhy B. subtilis, B. licheniformis, B. pulmis, B. mesentericus. II. morfologická skupina endospóry oválného tvaru, endospóra vždy ztlušťuje mateřskou buňku. III. morfologická skupina endospóry kulatého tvaru, endospóra vždy ztlušťuje mateřskou buňku (Sedláček, 2006). 21
Obr. 1 Sporulující Bacillus subtilis Obr. 2 Gramovo barvení Na obr. 1 je znázorněn sporulující Bacillus subtilis a na obr. 2 je zobrazeno gramovo barvení z něhož vyplývá že Bacillus subtilis je grampozitivní (http://en.wikipedia.org). 3.2.1.1 Reakce rodu Bacillus na fyzikálně chemické podmínky Reakce rodu Bacillus na fyzikálně chemické podmínky popisuje Tichá (1988): Tolerance k teplotě: optimální teplota pro většinu druhů se pohybuje v rozmezí 20 až 40 C. Výjimku tvoří Bacillus stearothermophillus, jehož optimální teplota je 60 až 70 C a který při 28 C neroste. Maximální teploty se u většiny druhů pohybují v rozmezí 50 až 60 C. Tolerance k ph: optimální ph pro růst a množení aerobních sporulujících bakterií z rodu Bacillus je v rozmezí 6,0 až 7,0. Při ph 5,0 se jejich růst většinou zpomaluje a při ph 4,5 se zastavuje. Tolerance ke kyslíku: zmíněné bakterie jsou aerobní, tj. že ke svému růstu a množení potřebují kyslík. Některé druhy či kmeny jsou fakultativně anaerobní, tj. že jsou schopné růst i za anaerobních podmínek. Tolerance k solím: některé druhy aerobních bakterií jsou osmotolerantní. To znamená, že tolerují vyšší koncentrace solí v médiu. Rod Bacillus subtilis snášejí 10 až 12 % NaCl. 3.2.1.2 Metabolismus bakterií rodu Bacillus Tyto bakterie mají bohaté enzymové vybavení, které jim umožňuje rozkládat nejrůznější organické substráty v půdě a všude tam, kde se pomnožují. Bacillus vytváří katalázu, což je znak, který kromě aerobní produkce endospor, rozlišuje bacily od Clostridium. Některé druhy Bacillus, např. Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus jsou schopné produkovat vysoce aktivní baktericidní látky, včetně tyrocidin, gramicidin a 22
polymyxin. Většina druhů aerobních sporulujících bakterií jsou silnými proteolyty, tzn. že mají schopnost odbourávat bílkoviny, a to do různého stupně a na různé konečné metabolity. Bílkoviny jsou hydrolyzovány na peptony, peptidy až na aminokyseliny. Dále dochází k dekarboxylaci a deaminaci aminokyselin, k denaturační deaminaci. Tak vznikají aminy, močovina, alkoholy, fenoly, organické kyseliny. Proteolytická aktivita významně snižuje biologickou hodnotu potravin a zhoršuje jejich organoleptické vlastnosti, ale může mít za následek i vznik jedovatých metabolitů (Tichá, 1988). V médiích obsahujících sacharidy většina členů vytváří pouze kyselinu, ale některé, jako B. macerans a B. polymyxa, produkují plyn. Běžně bývá zkvašována glukóza, maltóza a sacharóza, manitol a salicin méně. Vzácně je zkvašována laktóza. Konečné produkty zkvašování glukózy se velmi liší. Některé druhy produkují kyselinu mléčnou; jiné, jako B. subtilis, B. licheniformis a B. cereus, tvoří 2,3-butandiol a glycerol; B. polymyxa tvoří 2,3-butandiol, ethanol a vodík; a B. macerans vytváří především ethanol, aceton a octovou a mravenčí kyselinu. Většina druhů vylučuje proteolytické enzymy a hydrolyzuje kasein a želatinu (http://sweb.cz/kolar-jiri). Možností je redukce dusičnanů, což je běžná především u B.cereus, B.thuringiensis, B. licheniformis, B. subtilis. Na kaseinovém agaru tvoří Bacillus subtilis růžové, žluté nebo oranžové pigmenty. Řada druhů zmíněných baktérií produkuje želatinázu a např. Bacillus cereus tvoří lecithinasu (Tichá, 1988). 3.2.1.3 Tvorba spor Charakteristickou vlastností baktérií z rodu Bacillus je schopnost vytvářet vysoce rezistentní spory. Jde o spory endogenní vznikající uvnitř buňky, a to centrálně, paracentrálně či terminálně. Jsou kulovité nebo eliptické. Ke sporulaci dochází tehdy, když se kultura nachází v podmínkách nepříznivých pro růst a množení, např. při vyčerpání živin apod. Sporulace je proces řízený geneticky. Sporulace vyžaduje přítomnost určitých látek - sporogenních aminokyselin, sporogenních iontů (Mn 2+, Ca 2+, Mg 2+ Co 2+, Ni 2+, PO 3-4, SO 2-4). Antibiotikum nisin je významným inhibitorem klíčení spor bacilů. Tato inhibice je zrušena přídavkem iontů Mg 2+ a Ca 2+. Spory se od vegetativních buněk odlišují nejen morfologicky, ale i chemickým složením. Obsahují více lipidů a minimální množství vody asi na úrovni dehydrovaných proteinů. Spory jsou odolné vůči extrémním podmínkám. Odolávají vyschnutí, slabým kyselinám a hydroxidům, oxidačním 23
činidlům a záření. Jsou rovněž termostabilní. Vydrží několik hodin varu, suché teplo 160 C je devitalizuje až na několik hodin. Tlakové páře o teplotě 115 C odolávají i více hodin. Termostabilita spor je ovlivňována ph prostředím. Je známo, že termostabilita spor je podmíněna nejen minimálním obsahem vody, ale také přítomností kyseliny dipikolinové a iontů Ca 2+ (Tichá, 1988). 3.2.2 Výskyt bakterií rodu Bacillus v mlýnských a pekárenských surovinách a výrobcích Bakterie z rodu Bacillus jsou přítomné ve značných koncentracích v půdě a dostávají se odtud na obiloviny, do mouk a pekárenských výrobků. Během bělícího procesu, při němž nepřestoupí teplota uvnitř výrobku 95 C, nedochází k usmrcení spor zmíněných bakterií. Tyto spory za vhodných podmínek vyklíčí ve vegetativní buňky, vodní aktivitě a ph výrobku, dále pak na podmínkách skladování (teplota, vlhkost, doba). Byly prováděny pokusy izolace z chlazeného pšeničného těsta a byly zjištěny tyto následující druhy: B. subtilis, B. pumilus, B. cereus, B. mesentericus, B.licheniformis, B. clausii. Z pšeničné mouky byly izolovány ještě kromě uvedených druhů ještě B. brevis, B. coagulans, B. megatherium. Kultivací na žloutkovém agaru prokázala (Tichá, 1988) přítomnost Bacillus cereus v různých pekárenských výrobcích např. makovníku, makových koláčů (v náplni). Nejběžněji je v pekárenských výrobcích přítomen Bacillus subtilis a jeho varieta Bacillus subtilis varietas panis, B. licheniformis (Tichá, 1988). 3.3 Nitkovitost chleba Zrna a obilné produkty normálně obsahují několik druhů bakterií, kvasinek a plísní, které jsou druhově specifické a závislé na podmínkách se kterými se setkali během produkce, sklízení, uskladnění a zpracování. Zrna určená pro lidskou spotřebu jsou vypraná, vytříděná, ošetřená před tím, než se podrobují procesu mletí. Během mletí a prosévání, oddělíme slupku (otruby), zárodek a endosperm. Endosperm je pak rozdrcený na mouku. Každý krok v předběžné úpravě a mlecí operace snižuje množství mikroorganismů. Bez ohledu na mikroorganismy obsažené v mouce, profil mikroflóry v mletých zrnech je podobný jako v celých zrnech (Brackett, 2004). Pšeničná a žitná zrna a výrobky vyrobené z těchto obilnin mohou být kontaminovány mikroflórou z půdy, životního nebo během jejich dalších zpracování. Tyto produkty mají nízké hodnoty vodní aktivity, vyšší obsah bílkovin, sacharidů, lipidů, jsou-li dobře 24
skladovány, je zamezeno růstu všech mikroorganismů. Mikroflóra mouky je relativně málo početná, v důsledku působení bělících prostředků, které se používají na bělení mouky na požadovanou barvu. Pokud je hodnota vodní aktivity příznivá pro růst bakterií rodu Bacillus obvykle dochází k jejich rozvoji. Mnoho jejich anaerobních spor po vyklíčení produkují amylázu, která jim umožní v mouce a v jejich produktech zdroj energie, za předpokladu zvýšené vlhkosti a tím umožní jejich růst (Golden, 2003). Nitkovitost je vada chleba eventuálně i pečiva, která se sice nevyskytuje příliš často, ovšem v teplých letních měsících se s ní můžeme setkat, protože bakterie, které tuto chorobu způsobují Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus a B. licheniformis, jsou termofilní. Spory těchto bakterií přečkávají teplotu pečení, která nepřekročí 100 C uvnitř chleba, a mohou za příznivých podmínek vyklíčit. Napadány bývají zejména výrobky vyšší hmotnosti a z pšeničné mouky. Nitkovitost je výsledkem tvorby slizovitých pouzder těchto bakterií společně s enzymovou hydrolýzou lepku a škrobu, který po zcukření podporuje tvorbu pouzder. Střída chleba začne druhý až třetí den po upečení vlhnout, maže se, je lepivá, zbarvuje se dožluta a odporně hnilobně páchne. Při doteku se vytahuje do dlouhých nití, což je patrné zejména při rozlomení bochníku (obr. 3, 4). Vznik nitkovitosti podporují následující podmínky: kontaminace surovin, především mouky, ale i droždí, sušeného mléka či sladových přípravků sporami uvedených bakterií, nedostatečně vyčištěné výrobní zařízení, pomalé chlazení chleba po upečení (nejkritičtější teplota je mezi 30 a 45 C), nízká kyselost chleba (B. subtilis a B. mesentericus se množí nejlépe při neutrální reakci, růst je potlačován při kyselosti kolem ph 5,0), skladování chleba v teplé a vlhké atmosféře (optimální teplota pro vznik nitkovitosti je při teplotě 30 35 C). Nitkovitost chleba tudíž může být způsobena mimo jiné právě nedostatečným propečením pekařských výrobků. Nitkovitost chleba sice nemůže v zásadě nijak ohrozit zdraví spotřebitele, je však závažným jakostním nedostatkem (http://www.agronavigator.cz). Koláče všech typů zřídka kdy postihne nitkovitost v důsledku vysoké koncentrace cukru, který omezí dostupnost vody. Avšak některé přísady jako cukr, ořechy, koření, polevy a náplně jsou zdrojem kontaminace. I když pečící proces je všeobecně dostačující k tomu, aby zničil tyto mikroorganismy, mnohé 25
z nich se dostávají na hotový výrobek z polev, náplní, z chladícího a okolního vzduchu (Golden, 2003). Mikroflóra také může způsobovat nepříznivé změny ve vůni a chuti obilných produktů kvůli produkci vonných těkavých kyselin. Příklady některých vůní separovaných, které byly produkovány jsou 3-methyl butanol, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octanol a 2-octen-1-ol. Další faktor pro růst mikroflóry je zvýšení čísla kyselosti tuků. Toto zvýšení čísla kyselosti tuků je způsobeno odolností lipáz proti vysokým teplotám (Brackett, 2004). 3.3.1 Druhy výrobků, u kterých byl zjištěn výskyt B. subtilis, B. mesentericus, B. licheniformis různé druhy pšeničného chleba (celozrnný, z vysokovymleté mouky, grahamové mouky), připravené bez užití kvasu výrobky obsahující mák (makovníky, makové koláče, záviny) výrobky s jablkovou náplní nebo jinou ovocnou náplní, zvyšující vodní aktivitu výrobků výrobky s aplikací kaseinátu (diabetický chléb, dia pečivo, dia sušenky aj.) (Tichá, 1988) Nejběžnějším zdrojem kontaminace jsou některé dortové a koláčové přísady, zvláště pak cukr, koření, ořechy, mák. I když je pečící proces dostačující k tomu, aby zničil tyto mikroorganismy, mnohé z nich se dostávají na hotové výrobky na polevách, z chladícího vzduchu. Růst těchto forem na povrchu koláče je podporován vysokou vlhkostí z náplní. Na biskupských chlebíčkách začne růst mikroorganismů pod ořechy a plody, jestliže jsou umístněny na povrchu těchto výrobků (Golden, 2003). Tyto druhy výrobků jednak vždy obsahují baktérie z rodu Bacillus, dále představují vhodný živný substrát a mají vysokou vodní aktivitu. Jsou-li skladovány déle než 48 hodin při teplotách 22 C a vyšších, lze v nich očekávat vysoké množství bakterií Bacillus subtilis. Pokud koncentrace těchto bakterií nepřesahuje v 1 g 10 6, nejsou výrobky ještě viditelně narušeny a neprojevuje se u nich nitkovitost. Jsou však již hygienicky závadné. Pomnoží-li se tyto baktérie do koncentrací 10 7 na 1 g a výše, dochází k viditelným senzorickým změnám výrobku. Výrobek páchne, střídka je mazlavá, tmavá, hnilobně páchne a vykazuje nitkovitost (Tichá, 1988). 26
Obr. 3 Chléb napadený nitkovitostí (http://www.agronavigator.cz) Obr. 4 Detail nitkovitosti trastového chleba (Needham, 2004) Na obr. 4 jsou viditelné dlouhé táhnoucí se provazce, které produkují Bacillus subtilis, díky kterým dostala tato mikrobiální vada svůj název nitkovitost chleba. 3.3.2 Ochrana pekárenských výrobků před pomnožováním bakterií B.subtilis, B. mesentericus a B. licheniformis Byla vyzkoušena celá řada postupů a metod k ochraně pekárenských výrobků. Byla vyzkoušena celá řada bakteriostatik s cílem inhibovat množení baktérií z rodu Bacillus a tvorbu nitkovitosti v našich pekárnách. Výsledky zkoušek (Tichá, 1988) 27
prokázaly, že k úplné inhibici množení zmíněných baktérií v ohrožených výrobcích dochází při aplikaci různých konzervačních prostředků. Používané konzervační prostředky proti působení Bacillus subtilis a B. mesentericus jsou: 0,2% kyselina mléčná 0,1% kyselina octová 0,4% laktátu vápenatého 0,2% acetátu vápenatého 0,3 až 0,2% sorbátu draselného antibiotikum Nisin Antibiotikum Nisin je látka polypeptidové povahy mající výrazný bakteriostatický účinek proti grampozitivním baktériím. Jde o jediné antibiotikum použitelné v potravinářském průmyslu. Je produkován některými kmeny Streptococcus lactis. Je to látka naprosto neškodná a ve střevech je rozkládána proteasami. Neovlivňuje organoleptické ani reologické vlastnosti výrobků. Množství uvedených konzervačních prostředků je vztaženo na hmotnost výrobku. Sorbát draselný má široké spektrum účinku a chrání výrobek nejen před množením sporulujících bakterií ale i proti kvasinkám a plísním. Všechna uvedená bakteriostatika jsou hygienicky nezávadná. Problémy s nitkovitostí u pekárenských výrobků mají především země, kde jsou teplejší klimatické podmínky. Optimální teplota pro vyklíčení spor je kolem 30 C. Je známa a užívána celá řada způsobů, jak množení Bacillus subtilis a B. mesentericus zabránit a nebo alespoň omezit. Většina je založena na poznatku, že tyto bakterie jsou citlivé k ph v kyselé oblasti. Jak jsem již uvedla, optimální ph pro tvorbu bakterií je ph 6 až 7. Naopak při ph 5 se množení těchto bakterií výrazně zpomaluje, při ph 4,5 množení bakterií ustává. Proto většina užívaných bakteriostatik ve svých důsledcích snižuje ph výrobků. Nejčastěji se jako bakteriostatikum užívají organické kyseliny a jejich soli, v takové koncentraci a množství, které je účinné, ale zároveň nemění organoleptické a reologické vlastnosti výrobků a nejsou zdravotně závadné. Dále se využívají proti nitkovitosti mléčné kultury a propiónové bakterie, resp. propiónový zákvas. Těsto se připraví přímým vedením a přidá se 5 až 10 % zákvasu obsahujího v zápaře namnožené propiónové bakterie. Tímto způsobem se zabrání nejen nitkovitosti, ale zlepší se i organoleptické vlastnosti výrobku. Také se na ochranu pšeničného chleba před množením bakterií z rodu Bacillus používá zákvas mezofilních 28
a termofilních bakterií mléčného kvašení. Tento mléčný zákvas, připravovaný v pekárně, se přidá v množství 8 až 10 % do omládku. Dále se užívá kultura Streptococcus lactis diastaticus, který se liší od známých bakterií schopností syntetizovat velké množství enzymů včetně amylas. Tato kultura je schopna přeměnit škrob přes meziprodukty na kyselinu mléčnou. Schéma přeměny: Škrob dextrin maltosa glukosa kyselina mléčná. Kyselina mléčná okyseluje těsto, dále se v těstě hromadí produkty hydrolýzy škrobu (zkvasitelné cukry), které zrychlí jeho zrání. Takový chléb má lepší pórovitost, aroma i strukturu střídky. Lactobakteriální zákvas tohoto kmene působí tak, že spory původce nitkovitosti nevyklíčí, zůstávají v neaktivním stavu. Způsoby využití antagonismu mikroorganismů, kdy jeden druh je inhibován působením metabolitů jiného druhu mikroorganismů má řadu výhod. Jedná se o zlepšení organoleptických vlastností, objemu střídky atd. Má ale i řadu nevýhod, jedná se především o složitou a dlouhodobou přípravu zápar a kvasných kultur (Tichá, 1988). 29
4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Analyzované mouky popis vzorků V jednotlivých obchodních řetězcích byly zakoupeny vzorky mouk, které byly použity pro jednotlivá stanovení. Do mouky přechází přirozená mikroflóra ze zrna obilí během technologického zpracování zrna. V mouce se vyskytuje několik druhů bakterií a kvasinek. V mouce se mohou vyskytovat například tyto druhy plísní: Alternaria, Fusarium, Helminthosporium a Cladosporium. 4.1.1 Příprava vzorků a živných půd Byly odebrány vzorky jednotlivých mouk a byly označeny čísly: Vzorek č. 1 - pšeničná celozrná hladká mouka firmy Pro-bio Vzorek č. 2 - pšeničná hrubá mouka výběrová Spar Vzorek č. 3 - pšeničná hrubá mouka Zlatý klas Vzorek č. 4 - pšeničná polohrubá mouka Spar Vzorek č. 5 - pšeničná světlá hladká mouka Lidl Pro stanovení se volilo ředění 10-2 tzn., že byl navážen 1 g vzorku a byl smíchán s 90 ml sterilní destilované vody. Po důkladném protřepání a promíchání se suspenze očkovala. 4.1.2 Příprava mikrobiologické analýzy a složení živných půd Veškeré použité laboratorní sklo (50 petriho misek) bylo sterilováno v horkovzdušném sterilátoru typu HS 62 A. Zavatičkované pipety byly sterilovány zabalené do hliníkové fólie či umístěné do nerezového válce. Sterilace probíhala po dobu 60 minut při teplotě 140-160 C. Sterilace mikrobiologických zkumavek s 9 ml masopeptonového bujónu byly uzavřeny víčky a umístěny pro sterilaci do kádinek a přikryty hliníkových fólií. Veškeré použité živné půdy byly sterilovány v erlenmeyerových baňkách zavíčkovaných hliníkových fólií. Dále bylo sterilováno 5 erlenmeyerových baněk s 90 ml destilované vody použité k ředění vzorků. K vlastní sterilaci byl použit autokláv typu RS 20 A a vše bylo prováděno po dobu 20 min. při teplotě 121 C. K rozboru byly používány hotové živné půdy (výrobce Imuna). Masopeptonový agar (MPA) složení: Hovězí odvar 10,0 g Pepton pro bakteriologii 10,0 g NaCl 5,0 g 30
Agar 15,0 g Bylo naváženo 40 g sušené sterilované živné půdy MPA a byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody. Po té bylo zkontrolováno ph. ph živné půdy by mělo odpovídat hodnotě 7 ± 0,2. Pomocí indikátorového papírku bylo zjištěno, že ph neodpovídá stanovené hodnotě a proto byla živná půda okyselena pomocí kyseliny octové na příslušné ph. Půda byla rozlita do 400 ml erlenmeyerových baněk. Nakonec proběhla sterilace. Masopeptonový bujón složení: Hovězí vývar koncentrovaný (sušina) 5 g Pepton pro bakteriologii 5 g Živný základ č. 1 (6,25 g), živný základ č. 2 (6,25 g) NaCl 2,5 g Bylo naváženo 6,25 g sterilní živné půdy a byla rozpuštěna v 250 ml destilované půdy. Po dokonalém promíchání se změřilo pomocí indikátorových papírků ph. ph živné půdy je 7 ± 0,2. Poté byla půda sterilována po dobu 60 minut při teplotě 140 160 C. Chloramphenikolová půda složení: Agar 15 g Glukóza 20 g Chloramphenikol 0,1 g/l Extrakt 5 g Bylo naváženo 40 g sterilní živné půdy a byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody. Po dokonalém rozpuštění byla rozlita do erlenmeyerových baněk a nakonec proběhla sterilace. 4.2 Stanovované skupiny mikroorganismů 4.2.1 Stanovení celkového počtu mikroorganismů Pro stanovení celkového počtu mikroorganismů se používá živná půda masopeptonový agar. Na připravené a předem označené sterilní petriho misky se pomocí sterilních pipet napipetuje vždy 1 ml suspenze jednotlivých vzorků. Od každého vzorku se volí tři misky. Po napipetování vzorku se suspenze zalívá rozehřátou živnou půdou o teplotě asi 45 C tak, aby vrstva živné půdy byla asi 4 mm vysoká. Po zalití živnou půdou se vzorek promíchá krouživým pohybem. Po ztuhnutí půdy se petriho 31
misky dají do inkubátoru a pro stanovení celkového počtu mikroorganismů se volí teplota 37 C. Misky se kontrolují po 48 hodinách a po 72 hodinách. 4.2.2 Stanovení plísní Pro stanovení plísní se používá živná půda chloramphenikol. Na připravené sterilní petriho misky se pomocí sterilních pipet napipetuje 1 ml suspenze vzorku. Volí se tři misky od každého vzorku. Po napipetování se petriho misky přelijí živnou půdou, krouživým pohybem se zamíchají a nechají se zatuhnout. Po zatuhnutí se obrátí dnem vzhůru a dají se inkubovat do inkubátoru o teplotě 28 C. Kontrola misek se provádí po 48 hodinách a po 72 hodinách. 4.2.3 Stanovení sporulujících bakterií Pro stanovení sporulujících bakterií se musí nejprve zničit živé formy mikroorganismů, tak aby přežily pouze sporulující mikroorganismy. Jednotlivé vzorky se dají do vodní lázně, ta se zahřívá na teplotu 80 C po dobu 15 minut. Po vychladnutí se opět pipetuje 1 ml suspenze vzorku do jednotlivých sterilních petriho misek. Poté se misky zalijí sterilní rozehřátou živnou půdou masopeptonový agar. Po ztuhnutí živné půdy se petriho misky uloží do inkubátoru o teplotě 37 C. 4.2.4 Zjištění průkaznosti bakterií způsobující nitkovitost Pro stanovení sporulujících bakterií, které se stanovují ve zkumavkách s masopeptonovým bujónem se postupuje tak, že se do vysterilovaných zkumavek s masopeptonovým bujónem napipetuje 1 ml suspenze vzorku. Od každého vzorku se volí tři zkumavky. Do jedné zkumavky od každého vzorku byl přidán 1 ml suspenze bakterií mléčného kvašení, které podle dostupných studií potlačují růst sporulujících bakterií. Suspenze bakterií mléčného kvašení byla připravena z probiotického preparátu od firmy Biopron 9. Suspenze obsahuje miliardy bakterií mléčného kvašení. Následně se zkumavky vloží do inkubátoru o teplotě 37 C. Kontrola zkumavek se provádí po 48 hodinách a 72 hodinách a sledujeme zda se na povrchu zkumavek nevytváří mázdra. Vytvoření mázdry je průkazem bakterií způsobujících nitkovitost mouky. 4.3 Výsledky a diskuse Po uplynutí inkubační doby 48 hodin byly vyhodnoceny zkumavky s masopeptonovým bujónem a zkumavky s masopeptonovým bujónem s 1 ml suspenze bakterií mléčného kvašení na přítomnost sporulující bakterií Bacillus subtilis. 32
Přítomnost bakterií se měla potvrdit tvorbou pevné vrásčité mázdry. U žádného vzorku se po inkubační době 48 hodin nevytvořila mázdra. Zkumavky se opět vložily do inkubátoru o teplotě 37 C a kultivační doba se prodloužila o 24 hodin. Po uplynutí inkubační doby 72 hodin se opět zkumavky vyhodnotily na tvorbu mázdry. Výsledky jsou uvedeny v tab. 5. Z tabulky vyplívá, že zkumavky, které obsahovaly 1 ml suspenze bakterií mléčného kvašení byl mírný pokles růstu Bacillus subtilis, což potvrzují studie zabývající se inhibičním účinkem bakterií mléčného kvašení (Needham, 2004). Pozitivní výsledky na růst sporulující bakterií byl zaznamenán u vzorků č. 1 pšeničná hladká celozrná mouka firmy Pro-bio, č. 4 pšeničná hrubá mouka Spar, č.5 pšeničná světlá hladká mouka Lidl. Tab. 5 Vyhodnocení tvorby mázdry po inkubaci 72 hodin Tvorba mázdry bez přítomnosti bakterií mléčného kvašení Tvorba mázdry s přítomností bakterií mléčného kvašení Vzorek č. 1 pozitivní menší nárůst Vzorek č. 2 negativní negativní Vzorek č. 3 negativní negativní Vzorek č. 4 pozitivní pozitivní Vzorek č. 5 pozitivní menší nárůst Po uplynutí inkubační doby 48 hodin bylo provedeno vyšetření petriho misek. Výsledky u jednotlivých stanovení jsou uvedeny v tabulce 6a. Po uplynutí inkubační doby 72 hodin bylo provedeno vyšetření petriho misek. Výsledky jednotlivých stanovení jsou uvedeny v tabulce 6b. Tab. 6 Počty mikroorganismů ve vzorcích mouky po inkubaci 48 hodin (6a) a 72 hodin (6b) Hodnoty v KTJ 10 2 v 1 g mouky Vzorek č. 1 Vzorek č. 2 Vzorek č. 3 Vzorek č. 4 Vzorek č. 5 a b a b a b a b a b Celkový počet mikroorganismů 2,667 3,33 25,33 25,33 0 0,33 49 53,33 20,66 24,66 Sporulující bakterie 0 0 10 10,33 1,33 1,33 0 0,33 0 0,33 Plísně 1 3,33 1 2 1 1,33 0,667 7,667 0 0,667 33
Graf 1 Vliv prodloužení inkubace vzorků ze 48 hodin na 72 hodin u celkového počtu mikroorganismů Počet mikroorganismů *10 2 60 50 40 30 20 10 0 vz. č. 1 vz. č. 2 vz. č. 3 vz. č. 4 vz č. 5 48 hod 72 hod Prodloužení inkubační doby ze 48 hodin na 72 hodin se projevilo nárůstem celkového počtu mikroorganismů 24,85 % u vzorku č. 1 pšeničná celozrná mouka od firmy Pro-bio.U vzorku č. 2 pšeničná hrubá mouka Zlatý klas se neprojevilo prodloužení inkubační doby na nárůstu mikroorganismů. U vzorku č. 3 pšeničná hrubá mouka Spar nebyl nárůst mikroorganismů po inkubační době 48 hodin. Prodloužením inkubační doby na 72 hodin došlo k nárůstu mikroorganismů v počtu 33 kolonií v 1 g mouky. Nárůst o 8,84 % byl zjištěn u vzorku č. 4 pšeničná polohrubá mouka Spar. Prodloužením inkubační doby ze 48 hodin na 72 hodin se projevilo nárůstem mikroorganismů o 19,35 % u vzorku č. 5 pšeničná hladká světlá mouka Lidl. 34
Graf 2 Vliv prodloužení inkubace vzorků ze 48 hodin na 72 hodin u stanovení sporulujících bakterií Počet mikroorganismů *10 2 12 10 8 6 4 2 0 vz. č. 1 vz. č. 2 vz. č. 3 vz. č. 4 vz č. 5 48 hod 72 hod U vzorků č. 1 pšeničná celozrná hladká mouka firmy Pro-bio a vzorku č. 4 pšeničná polohrubá mouka Spar se neprojevil vliv prodloužení inkubační doby na nárůst sporulujících bakterií. Prodloužení inkubační doby se projevilo nárůstem sporulujících bakterií o 3,3 % u vzorku č. 2 pšeničná hrubá mouka Zlatý klas. U vzorku č. 5 pšeničná hladká světlá mouka Lidl nebyl zaznamenán růst sporulujících bakterií během inkubační doby 48 hodin. Po prodloužení inkubační doby ze 48 hodin na 72 hodin se projevilo nárůstem sporulující bakterií v počtu 33 kolonií v 1 g mouky uvedeného vzorku. 35
Graf 3 Vliv prodloužení inkubace vzorků ze 48 hodin na 72 hodin Počet mikroorganismů *10 2 8 7 6 5 4 3 2 1 0 vz. č. 1 vz. č. 2 vz. č. 3 vz. č. 4 vz č. 5 48 hod 72 hod U vzorku č. 1 pšeničná celozrná hladká mouka byl nárůst plísní 233 % po prodloužení inkubační doby ze 48 hodin na 72 hodin. U vzorku č. 2 pšeničná polohrubá mouka Zlatý Klas byl nárůst plísní o 100 %. U vzorku č. 3 pšeničná hrubá mouka Spar byl nárůst bakterií o 33 %. Největší rozdíl v prodloužení inkubační doby ze 48 hodin na 72 hodin se projevilo u vzorku č. 4 pšeničná polohrubá mouka Spar. Nárůst byl o 1049 %. U vzorku č. 5 hladká světlá mouka Lidl nebyl nalezen nárůst plísní za kultivační dobu 48 hodin. Po kultivační době 72 hodin byl nárůst kolonií v počtu 667 plísní v 1 g mouky. Z grafu č. 3 vyplívá, že byl extrémní nárůst plísní téměř u všech vzorků. Tak vysoký nárůst je způsoben tím, že plísně mají nižší kultivační teploty a delší inkubační dobu než sporulující bakterie a než je u celkového počtu mikroorganismů. 36
Jedním z cílů této práce bylo vytvořit fotodokumentaci stanovovaných skupin mikroorganismů. Obr. 5 Celkový počet mikroorganismů po inkubační době 72 hodin Obr. 6 Nárůst kolonií plísní po inkubační době 48 hodin 37
Obr. 7 Vyrostlé kolonie plísní na chloramphenikolové půdě po inkubační době 72 hodin Z obrázků je patrný vliv prodloužení inkubační doby ze 48 hodin na 72 hodin u stanovení plísní. Obr. 8 Kolonie sporulující bakterie Bacillus subtilis po inkubační době 72 hodin 38
5. ZÁVĚR V práci jsou shrnuty základní poznatky o výrobě pečiva a jeho mikrobiálních charakteristikách. Je vyhodnocen výskyt bakterií rodu Bacillus v pekárenských surovinách a výrobcích, a podrobně charakterizovány druhy Bacillus subtilis a Bacillus mesentericus způsobující nitkovitost chleba. Experimentálně byla posouzena mikrobiální kvalita pěti druhů mouk (pšeničná celozrná hladká mouka Pro-bio, pšeničná hrubá mouka Zlatý klas, pšeničná hrubá mouka Spar, pšeničná hladká mouka Lidl). Celkové počty mikroorganismů se pohybovaly v rozmezí hodnot od 0 do 53,33. 10 2 KTJ v 1 g mouky. Počty sporulujících bakterií se pohybovaly v rozmezí hodnot od 0 do 10,33. 10 2 KTJ v 1 g mouky. Počet plísní byl v rozmezí hodnot od 0 do 7,66. 10 2 KTJ v 1 g mouky. U zjištění průkaznosti bakterií způsobující nitkovitost, byl zaznamenán pozitivní výsledek u mouky pšeničné celozrnné hladké Pro-bio, pšeničné hrubé Spar, pšeničné hladké mouky Lidl. Podle výsledků uvedených v tabulkách byly nejméně kontaminovány mouky pšeničná celozrnná hladká mouka Pro-bio a pšeničná hrubá mouka Spar. Ve srovnání vzorků hrubých mouk se jevila jako kvalitnější mouka hrubá Spar než pšeničná hrubá mouka Zlatý klas. Rozdílný výsledek může být způsoben skladováním a dobou minimální trvanlivosti. Celkové množství mikroorganismů může dosáhnout až 10 5 KTJ na 1 g výrobku. Při překročení hodnoty 10 7 KTJ na 1 g výrobku se projeví viditelná vada. Mikrobiologické požadavky na různé druhy pekárenských výrobků jsou uvedeny ve vyhlášce MZd. č. 91/1999 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny. Výsledky u sledovaných druhů mouk dosahovaly hodnot 10 2 KTJ v 1 g mouky, což odpovídá normě. 39