Pezicula alba Guthrie (anamorfní stadium Phlyctaena vagabunda Desm, syn. Gloeosporium album Osterw.) popis patogena, metody kultivace a umělé infekce plodů jablek Kloutvorová Jana, Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy,s.r.o. Kruhová hnědá hniloba, dříve označovaná jako gloeosporiová (hořká) hniloba je všeobecně rozšířené onemocnění skladovaného ovoce vyskytující se na plodech jablek prakticky ve všech zemích, kde je toto ovoce pěstováno.chorobu způsobují zástupci rodu Pezicula, nejčastěji Pezicula alba (příp. Pezicula malicortitis). Posklizňové ztráty na ovoci mohou v závislosti na citlivosti kultivaru, délce skladování a průběhu počasí během vegetace dosáhnout i 20% (Tonini 1996). Lattanzio et al. (2001) a Puia C.E. et al. (2003) uvádějí dokonce více neţ 30% ztráty na skladovaném ovoci. Onemocnění se projevuje na plodech většinou aţ v druhé polovině skladovacího období. Vyvolává ostře ohraničené okrouhlé hnědé skvrny o průměru 0,5 3 i více cm, jejichţ povrch se miskovitě prohýbá. Duţnina v místě napadení rovněţ hnědne, kašovatí a je poměrně výrazně ohraničena od zdravé části. Na povrchu skvrn se postupně tvoří acervuli, v nichţ se vytvářejí konidie. (Lánský 2002, Hluchý et al. 1997, Benada a Špaček 1962). Patogen Pezicula alba Guthrie (anamorfní stadium Phlyctaena vagabunda Desm, syn. Gloeosporium album Osterw.) patří do rodu Pezicula, čeleďi Dermateacea, řádu Helotiales a třídy Ascomycetes. (Kůdela a Kocourek 2002). Ţivotní cyklus patogena popisuje řada autorů. Houba přezimovává jako mycelium a konidie v rakovinných útvarech větví, na mumifikovaných zbytcích plodů zůstávajících přes zimu viset na stromech, ale také na opadaném ovoci na zemi, či na jizvách po opadlém listí. (Pfeifferová 2001, Lattanzio et al. 2001, Archer 2002, Fliege 1974, Corke 1956). Výzkumy v Baden Würtembergu dokázaly, ţe prakticky celé nadzemní koruny jabloní jsou osídleny houbami rodu Pezicula (Kennel 1970). V průběhu vegetace se pak konidie, tvořící se v malých infekčních lézích na dřevě, šíří s deštěm a rosou na plody. Infekce můţe nastávat během celé pěstitelské sezóny (Lattanzio et al. 2001) Sledování odhalilo, ţe vývoj a šíření spor patogena začíná jiţ brzy po opadu květních plátků, ovoce tak můţe být infikováno jiţ od počátku června. Významně zvýšená četnost infekcí pak byla pozorována od poloviny července, tedy v čase vývoje lenticel, které jsou vstupní branou pro patogena, a pokračuje dále aţ do období sklizně. Patogen zůstává v plodech v latenci a aţ v pozdním období skladování, kdy ovoce dosáhne určitého stadia zralosti, způsobí viditelné symptomy napadení ovoce. (Katschinski a Ramson 1975, Archer 2002, Pfeifferová 2002). Fyziologické a morfologické vlastnosti houby v čisté kultuře a na přírodním substrátu důkladně studovala Senulová (1984) v rámci výzkumu diagnostiky, patogeneze a epidemiologie gloeosporiové hniloby. Izoláty Pezicula alba získala z nemocné kůry dřevin, houbu dále kultivovala na bramborovo dextrózovém agaru (PDA) a pak sledovala tvorbu fruktifikačních orgánů a měřila velikost konidií. Pezicula alba vytvářela na PDA vzdušné bílé mycelium, keré se postupně měnilo do ţlutohněda. Kolonie vytvářely silně zvlněný okraj. Pozorovala tvorbu konidií, jejichţ velikost se pohybovala v rozmezí 14 25µm x 2,5 5,5 µm. Konidie jsou jednobuněčné, rohlíčkovitě zahnuté a na koncích zakulacené, hyalinní. Senulová dále zkoušela vliv sloţení a acidity ţivné půdy a teploty na rychlost růstu kultury, její morfologii a na fruktifikaci. Rychlost růstu patogena na různých ţivných půdách byla sloţením půdy jen málo ovlivněna na rozdíl od morfologie kolonie. Autorka ve své práci uvádí asi 10 typů medií vhodných ke kultivaci houby, mimo jiné např. PDA, sladový agar, droţďový agar a Czapek-Doxův agar. Aciditu je pro kultivaci Pezicula alba nutno upravit na hodnotu kolem 6 ph. Teplota naopak rychlost růstu kolonií a jejich fruktifikaci ovlivňovala velmi výrazně. Při nízkých teplotách (5 10 C ) byl růst mycelia velmi zbrţděn, ale naopak
byla příznivě ovlivněna tvorba fruktifikačních orgánů. Ke fruktifikaci nejlépe docházelo při teplotách 10 15 C, proto pro tvorbu fruktifikačních orgánů doporučuje kultivaci spíše za niţších teplot. Intenzitu růstu Pezicula alba na různých médiích, barvu kultur na agaru a patogenitu různých kmenů houby sledovaly Borecká a Bryková (1982). Houbu kultivovaly na Czapek- Doxově agaru, na PDA a na jablečném a sladinkovém agaru. Pozorovaly, ţe v rámci druhu Pezicula alba existuje široká variabilita mezi kmeny, co se týče barvy kultur na agaru, intenzity pigmentace agaru, ale i rychlosti růstu a schopnosti sporulace. Velké rozdíly mezi kmeny pozorovaly také v testech patogenity. Zjistily, ţe některé sledované kmeny jsou schopné napadat pouze plody a ne větve, jiné naopak pouze větve, jenom jeden z testovaných kmenů byl patogenní jak pro plody, tak i pro větve. Některé kmeny naopak nevykázaly vůbec ţádnou patogenitu. Rychlost růstu kultur, schopnost sporulace a velikost konidií nebyly v korelaci s patogenitou. Někteří autoři studující vlastnosti houby Pezicula alba, její patogenitu, ţivotní cyklus, citlivost k fungicidům apod. vyuţívali ve svých pracích metody umělé infekce. Borecká a Bryková (1997, 1982) zkoumající patogenitu různých kmenů pouţily při umělých infekcích mycelium houby napěstované na Czapek-Doxově agaru. Jablka odrůdy Golden Delicious a McIntosh nejprve opláchly pitnou vodou a desinfikovaly etanolem. Pak je infikovaly kouskem mycelia o velikosti asi 5 mm, které vypíchly z dvoutýdenní kultury a tento kousek mycelia vloţily do stejně velkého otvoru vypíchnutého v duţnině plodu. Jablka dále uchovávaly při teplotě asi 15 C a při vysoké vlhkosti vzduchu. Viditelné symptomy onemocnění se objevily po 2 měsících skladování. Celkem provedly 80 infekcí od kaţdého zkoumaného kmene. Mnoţství úspěšných infekcí však nebylo příliš vysoké, pohybovalo se od 9 úspěšných infekcí do 0, v závislosti na kmeni patogena a infikované odrůdě. Alston (1967), zkoumající citlivost 235 kultivarů jablek k patogenu, namáčel vzorky plodů (5 plodů od kultivaru) do suspenze konídí obsahující 50 tis.spor/ml. Patogena kultivoval na 2% sladinkovém agaru. Plody pak skladoval v papírových sáčcích při 5 C po dobu 5 měsíců, neţ vyhodnotil viditelné symptomy onemocnění. Metodami umělé infekce se velmi podrobně zabýval Edney (1964, 1976). Nejprve sledoval klíčení spór na povrchu jablek. Zjistil, ţe inokulace jednotlivých lenticel suspenzí konidií v jablečné šťávě byla účinnější neţ inokulace vodní suspenzí. Inokulace však byla úspěšná jen málo nad 50%. Snadnější infekce nebylo dosaţeno ani s postupujícím dozráváním plodů. V dalších pracích sledoval vývoj kruhové hnědé hniloby v závislosti na obashu minerálních prvků v duţnině. Vzorky jablek kultivaru Cox s Orange Pippin uměle infikoval suspenzí spor (20 tis. spor/ml), kterou nanesl na povrch plodů pomocí bavlněné vaty. Plody pak skladoval při 4,4 C v částečně uzavřených kontejnerech a výskyt hniloby hodnotil ve 14 denních intervalech. Úspěšnost infekcí se pohybovala od 12 do 84 %. Edney a kol. ve své práci z r. 1977 uvádí, ţe navzdory běţně se vyskytující přirozené infekci jablek houbou Pezicula alba, pokusy infikovat plody uţitím metody aplikace konidií na povrch plodů nebývají vţdy zcela úspěšné. Vnímavost jablek k infekci se pokoušel zvýšit vystavením plodů simulovaným dešťovým sráţkám. Vycházel při tom z pokusů prováděných Periesem (1967), který prokázal, ţe omývání listů kaučukovníku brazilského zvyšuje citlivost k infekci Gloeosporium albo-rubrum. To podnítilo představu, ţe omytí plodů jablek by rovněţ mohlo zvýšit jejich citlivost vůči infekci Pezicula alba. Vzorky jablek kultivaru Cox s Orange Pippin proto omýval různým mnoţstvím destilované vody odpovidajícím 10 50 mm sráţek. Vyuţil při tom k tomuto účelu sestrojený simulátor dešťvých sráţek. Jablka nechal různou dobu osychat, pak na povrch plodů aplikoval konidie patogena a ovoce uchovával v 10 C. Infekce prováděl v únoru, po 10 týdnech hodnotil výskyt hnilob, ale pouze jeden plod vykázal viditelné symptomy onemocnění. Experiment proto zopakoval stejným způsobem v říjnu po sklizni plodů. Získané výsledky ukázaly markantní rozdíly v počtu infekcí mezi omývanými a
neomývanými plody, např. varianta omytá mnoţstvím vody odpvídajícím 12 mm sráţek vykázala 40 % napadeného ovoce, zatímco neomytá varianta pouze 8%. Procento hnilob se zvyšovalo úměrně se zvýšením doby ovlhčování, naopak se sniţovalo s prodluţováním doby osychání před aplikací konidií. Ţivné substráty vyuţívané pro kultivaci Pezicula alba: označení Bramborovo-dextrózový agar 1 Sladový agar 1 Sladový agar 2% 3 Czapek-Doxův agar 1 sladový agar 1 V-8 Juice agar 2 glukoso-nitrátový agar 1 syntetický agar 1 1 syntetický agar 2 1 sloţení / 1000 ml dest. vody 400 g brambor, 30 g dextrózy, 25 g agaru 30 g sladového extraktu, 25 g agaru 20 g sladového extraktu, agar neuveden 30 g sacharózy, 2 g NaNO 3, 1 g KH 2 PO 4, 0,5 g MgSO 4 x 7 H 2 O, 0,5 g KCL, 0,01 g FeSO 4 x 7 H 2 O, 15 g agaru 40 g sladového extraktu, 5 g kaseinové bílkoviny, 1 g (NH 4 ) 2 HPO 4, 18 g agaru 200 ml V-8 Juice, 3 g CaCO 3, 15 g agaru 25 g glukózy, 5 g KNO 3, 2,5 g KH 2 PO 4 ; 1,25 g MgSO 4 ; 15 g agaru 20 g glukosy, 5 g kvasničného extraktu Difco, 1 g Ca(NO 3 ) 2 ; 0,25 g KCl, 0,01 g FeCl 3 ; 18 g agaru 5 g glukosy; 1,36 g KH 2 PO 4 ; 0,5 g MgSO 4 x 7 H 2 O; 1 g asparaginu, 18 g agaru 1) Senulová 1985, 2)Archer 2002, 3)Borecká, Bryková 1982
LITERATURA: ALSTON, F. H.: Varietal response to Gloeosporium perennans in the apple., 1967, Rep. E. Malling Res. Sta. 1966, 132-134. ARCHER, CH.: The Use of Honeybees as a Transfer Vector for Core Rot in Apples., RIRDC Publication, No 02/ 046, 2002, 1-40. BENADA, J., ŠPAČEK, J., a kol.: Zemědělská fytopatologie, díl IV, Československá akademie zemědělských věd a Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 1962, 685-686. BORECKA, H., BRYK, H.: Porównanie patogeniczności, wzrostu, zarodnikowania i cech morfologicznych róznzch iyolatów gryzba Pezicula alba Guthrie < Gloeosporium album Osterw.>, Acta Agrobotanica, vol. 35, z. 2, 1982, 225-234. BRYK, H.: Appearance and stability of Pezicula alba Guth. resistant to benzimidazole fungicides. J. Fruit Ornam. Plant Res., vol. 5, 2, 1997, 77-87. CORKE, A. T. K.: Bitter rot of apples variations in the development and sporulation of cankers of Gloeosporium spp. inoculated into apple branches., J. Hort. Sci., 1956, sv. 31, č. 4, 272-283. EDNEY, K. L.: An investigation of persistent infection of stored apples by Gloeosporium spp., Ann.appl. Biol., 1976, 82, 355-360. EDNEY, K. l.: Some factors affecting the ratting of stored apples by Gloeosporium spp., 1964, Ann. appl. Biol., 53, č.1, 119-127. EDNEY, K.L., TAN, A. M., BURCHILL, R. T.: Susceptibility of apples to infection by Gloeosporium album, Ann. appl. Biol., 1977, 86, 129-132. FLIEGE, H. F.: Gloeosporium Erreger Verbreitung Ausbreitung Bekämpfung., Der Erwerbsobstbau, 16, 1974, 85-88. HLUCHÝ, M., ACKERMANN, P., ZACHARDA, M., BAGAR, M., JETMAROVÁ, E., VANEK, G.: Obrazový atlas chorob a škůdců ovocných dřevin a révy vinné., Biocont Laboratory s.r.o., Brno, 1997, 36. KATSCHINSKI, K.-H., RAMSON, A.: Beitrag zur Biologie und Bekämpfung von Gloeosporium-Fäulen an Äpfeln, Nachrichtenblatt für den Pflanzenschutz in der DDR, 1975, 29, č. 8, 168-172. KENNEL, W.: Die Infektionsquellen der Gloeosporium Fruchtfäule beim Apfel., Erwerbsobstbau, 12, 1970, č. 1, 6-10. KŮDELA, V., KOCOUREK, F.: Seznam škodlivých organizmů rostlin., Agrospoj s.r.o., Praha, 2002, 18-21. LÁNSKÝ, M.: Choroby a poruchy při skladování jablek., Agro, roč. VII, 1, 16-18. LATTANZIO, V., Di VENERE, D., LINSALATA, V., BERTOLINI, P., IPPOLITO, A., SALERNO, M.: Low Temperature Metabolism of Apple Phenolics Quiesence of Phlyctaena vagabunda., J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 5817-5821. PERIES, O. S.: Review of the Plant Pathology Department. Quarterly Journal of the Rubber Research Institute, Ceylon, 1967, 43, 12. PUIA, C. E., POPOVICI, E. J., VIOREL, F.: The evolution of the fitosanitary status of the stored apples in natural conditions. Journal of Central European Agriculture (online), Vol. 4, 2003, No.4, 319-325. SENULA, A.: Untersuchungen zur Morphologie und Physiologie von Cryptosporiopsis malicorticis (Cordl.). Nannf. und Phlyctaena vagabunda Desm., Arch. Phytopathol. Pflanzenschutz, Berlin 21, 1985,4,273-286. TONINI, G.: Atlante delle alterazioni microrganiche post raccolta., Bayer S.p.A., 1996, Milano- Divisione Agraria, Italy.