METODIKA UŽITÍ JEDNORÁZOVÉHO SETU PRO

METODIKA UŽITÍ JEDNORÁZOVÉHO SETU PRO DETEKCI MĚĎNATÝCH (CU 2+ ) IONTŮ V PITNÝCH A PRŮMYSLOVÝCH ODPADNÍCH VODÁCH KOLEKTIV AUTORŮ LentiKatˊs, a.s. 2014

AUTOŘI METODIKY: Ing. Radek Stloukal, Ph.D. 1 Mgr. Irena Vopálenská 2 Ing. Jarmila Watzková, Ph.D. 1 Ing. Barbora Gregušová 1 prof. RNDr. Zdena Palková, CSc. 2 RNDr. Libuše Váchová, CSc. 3 Ing. Iva Pichová, CSc. 4 1 LentiKatˊs a.s. Pod Vinicí 83, 471 27 Stráž pod Ralskem Tel.: +420 255 710 680, Fax: +420 255 710 699 E-mail: info@lentikats.eu, Web: www.lentikats.eu 2 Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Albertov 6, 128 43 Praha 2 Tel.: +420 221 951 111, Fax: +420 221 951 123 E-mail: dekan@natur.cuni.cz, Web: www.natur.cuni.cz 3 Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4 Krč Tel.: +420 296 442 341, Fax: +420 296 442 201 E-mail: mbu@biomed.cas.cz, Web: www.biomed.cas.cz/mbu 4 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i. Flemingovo nám. 542/2, 166 10 Praha 6 Tel.: +420 220 183 333, Fax: +420 220 183 578 E-mail: uochb@uochb.cas.cz, Web: www.uochb.cz DEDIKACE: Tento výsledek vznikl za finanční podpory projektu Využití imobilizovaných kvasinek v biotechnologiích: vývoj nových aplikací pro výrobní procesy (č. projektu TA01011461) z prostředků státního rozpočtu prostřednictvím Technologické agentury České republiky (TA ČR). VLASTNICKÉ VZTAHY: Touto metodikou nejsou dotčeny vlastnické vztahy k duševnímu vlastnictví a ani jejím prostřednictvím nejsou poskytovány licence k duševnímu vlastnictví. Případné poskytnutí licence k duševnímu vlastnictví bude předmětem samostatného smluvního ujednání. 2

VYDAVATEL: VYDÁNO V ROCE: 2014 ZVEŘEJNĚNO: ČÍSLO VÝSLEDKU: GARANT VÝSLEDKU: JAZYK VÝSLEDKU: HLAVNÍ OBOR: LentiKatˊs, a.s. (Praha) www.lentikats.eu LENTIKVAS-2014-01 Ing. Radek Stloukal, Ph.D. CZE čeština EI Biovědy / Biotechnologie a bionika VLASTNÍK VÝSLEDKU: IČ VLASTNÍKA VÝSLEDKU: 27447618 DIČ VLASTNÍKA VÝSLEDKU: STÁT: LentiKatˊs a.s. Pod Vinicí 83, 471 27 Stráž pod Ralskem Tel.: +420 255 710 680, Fax: +420 255 710 699 E-mail: info@lentikats.eu, Web: www.lentikats.eu CZ27447618 CZ Česká republika VLASTNÍK VÝSLEDKU: IČ VLASTNÍKA VÝSLEDKU: 00216208 DIČ VLASTNÍKA VÝSLEDKU: STÁT: Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Albertov 6, 128 43 Praha 2 Tel.: +420 221 951 111, Fax: +420 221 951 123 E-mail: dekan@natur.cuni.cz, Web: www.natur.cuni.cz CZ00216208 CZ Česká republika VLASTNÍK VÝSLEDKU: IČ VLASTNÍKA VÝSLEDKU: 61388971 DIČ VLASTNÍKA VÝSLEDKU: STÁT: Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4 Krč Tel.: +420 296 442 341, Fax: +420 296 442 201 E-mail: mbu@biomed.cas.cz, Web: www.biomed.cas.cz/mbu CZ61388971 CZ Česká republika 3

OPONENT ODBORNÍK Z OBORU: Ing. Petr Vontor, Vedoucí technického úseku Tel.: +420 556 492 806, E-mail: petr.vontor@galvanko.cz GalvanKo s.r.o., Areál Tatry 1451, 742 21 Kopřivnice IČ: 28172221, DIČ: CZ28172221 Tel.: +420 556 492 806, Fax: +420 556 492 880 E-mail: info@galvanko.cz, Web: www.galvanko.cz OPONENT ODBORNÍK ZE STÁTNÍ SPRÁVY: Ing. Taťjana Kolesnikova, Referentka Tel.: +420 267 122 452, E-mail: tatjana.kolesnikova@mzp.cz Ministerstvo životního prostředí, Odbor environmentálních rizik a ekologických škod Vršovická 1442/65, 100 00 Praha 10 IČ: 00164801 Tel.: +420 267 121 111, Fax: +420 267 310 308 E-mail: info@mzp.cz, Web: www.mzp.cz OSVĚDČENÍ O UZNÁNÍ UPLATNĚNÉ CERTIFIKOVANÉ METODIKY: Tato metodika byla schválena Ministerstvem životního prostředí Odborem environmentálních rizik a ekologických škod, pod č.j.: 74858/ENVI/14. Ministerstvo životního prostředí doporučuje tuto metodiku k využití v průmyslové praxi. TECHNICKÉ PARAMETRY: Metodika užití jednorázového detekčního setu LentiKats uživateli poskytuje možnost detekovat nad/pod limitní koncentrace měďnatých iontů v analyzované pitné vodě nebo průmyslové odpadní vodě. Uživatel tak získá informaci, zda obsah měďnatých iontů ve sledovaném vzorku nepřekračuje legislativně uváděné limity, které se pro tento typ vod pohybují v rozmezí 0,5-1 mg/l. Významným přínosem uvedeného detekčního setu je především možnost nastavit si koncentrační bod detekce měďnatých iontů, dle požadavků zákazníka a současně také možnost použití detekčního setu v odlehlých lokalitách či v lokalitách, kde není přístup k nákladným instrumentálním zařízením. EKONOMICKÉ PARAMETRY: Ekonomický přínos použití jednorázového detekčního setu LentiKats je přímo závislý na aktuálních potřebách a požadavcích daného provozu či lokality. Finanční úspora pro koncového uživatele využívajícího detekční set bude tedy zcela individuální a lze ji jen velmi hrubě odhadnout na jednotky až desítky tisíc korun. 4

NÁZEV VÝSLEDKU V ČESKÉM JAZYCE: Metodika užití jednorázového setu pro detekci měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách POPIS VÝSLEDKU V ČESKÉM JAZYCE: Metodika shrnuje aktuální legislativní požadavky a normy související s obsahem měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách. V metodice je dále podrobně popsán nově vyvinutý jednorázový detekční set LentiKats, který je založen na detekci měďnatých iontů pomocí Biokatalyzátoru lentikats s imobilizovanými rekombinantními kvasinkami. KLÍČIVÁ SLOVA V ČESKÉM JAZYCE: Biokatalyzátor lentikats, měďnaté ionty, detekce, pitné vody, průmyslové odpadní vody NÁZEV VÝSLEDKU V ANGLICKÉM JAZYCE: Methodology of using the disposable kit for detection of the content of cupric (Cu 2+ ) ions in drinking waters and industrial wastewaters POPIS VÝSLEDKU V ANGLICKÉM JAZYCE: The methodology summarizes the current legislative requirements and standards related to the content of cupric (Cu 2+ ) ions in drinking waters and industrial wastewaters. In this methodology, a newly developed single detection LentiKats set, is described in detail. The test is based on the detection of cupric ions using Lentikats Biocatalyst with immobilized recombinant yeasts. KLÍČIVÁ SLOVA V ANGLICKÉM JAZYCE: Lentikats Biocatalyst, cupric ions, detection, drinking waters, industrial wastewaters 5

Obsah 1 Cíl metodiky... 7 2 Vlastní popis metodiky... 7 2.1 Úvod... 7 2.2 Legislativní požadavky a normy... 8 2.2.1 Evropský legislativní rámec... 9 2.2.2 Národní legislativní rámec... 9 2.3 Množství, charakter a složení vod... 9 2.3.1 Průmyslové odpadní vody... 10 2.3.2 Pitné vody... 10 2.3.3 Povrchové vody... 11 2.4 Měď... 11 2.4.1 Zdravotní účinky... 12 2.4.2 Metody detekce... 12 2.4.3 Použití v průmyslu... 13 2.4.4 Zdroje znečištění... 14 2.5 Jednorázový detekční set LentiKats... 15 2.5.1 Složení setu... 16 2.5.2 Skladovací podmínky... 17 2.5.3 Limity detekce... 17 2.5.4 Interference... 18 2.5.5 Příprava reálného média... 18 2.5.6 Návod na použití... 18 2.5.7 Vyhodnocení... 19 2.5.8 Příklady vyhodnocení... 19 2.5.9 Likvidace... 21 3 Srovnání novosti postupů... 21 4 Popis uplatnění... 22 5 Ekonomické aspekty... 22 6 Seznam použité a související literatury... 23 7 Seznam publikací, které předcházely metodice... 24 6

1 Cíl metodiky Cílem certifikované metodiky je poskytnout jejímu uživateli souhrnnou informaci o postupu detekce měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách pomocí jednorázového detekčního setu LentiKats. Metodika je určena zejména pro uživatele a lokality, kde není možné provádět speciální laboratorní stanovení s využitím instrumentální techniky či pravidelné kvantitativní rozbory (např. galvanické provozovny, vody v odlehlých lokalitách či vody v lokalitách, kde není přístup k nákladným instrumentálním zařízením, apod.). 2 Vlastní popis metodiky Metodika poskytuje ucelenou informaci o principu a postupu detekce měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách vč. následného vyhodnocení, za použití jednorázového detekčního setu LentiKats. V metodice jsou shrnuty aktuální legislativní požadavky, informace, poznatky a praktická doporučení, která souvisí s obsahem měďnatých iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách. 2.1 Úvod Ochrana vod je jedním z nejdůležitějších úkolů v oblasti životního prostředí a zároveň i nejnáročnějších oblastí z hlediska vstupu České republiky do Evropské unie. Cílem je v souladu s požadavky legislativy Evropské unie zlepšování stavu vodních toků, vodních ekosystémů a podpora trvale udržitelného užívání vod. Jakost povrchových vod ovlivňují především bodové zdroje znečištění (města a obce, průmyslové závody a objekty soustředěné zemědělské výroby). Použitá voda z těchto bodových zdrojů se nazývá vodou odpadní. Tato odpadní voda vypouštěná do povrchových vod (recipientů) způsobuje nejen estetické problémy, ale především vnáší do recipientů organické látky, toxiny, patogenní mikroorganizmy, toxické i netoxické anorganické látky a další látky působící negativně na vodní ekosystém. Mikrobiálním rozkladem organických látek a amoniakálního dusíku nebo využíváním anorganických živin (např. fosfátů) v recipientu dochází k výraznému úbytku rozpuštěného kyslíku, což má velmi negativní vliv na možnosti existence vyšších živočichů 7

v toku. Vnášení nutrientů způsobuje eutrofizaci toku, která se projevuje mimo jiné nárůstem řas a sinic, které způsobují další závažné problémy. Je také třeba upozornit, že ovlivnění povrchových vod vodami odpadními není jen záležitost lokální a krátkodobá. Eutrofizace se projevuje i na vzdálenost desítek kilometrů a chronická toxicita představovaná především látkami usazenými v nánosech a splaveninách na dně toku působí negativně i desítky let. Ochrana životního prostředí a především vodních ekosystémů vyžaduje tedy čištění odpadních vod v bodových zdrojích znečištění na míru přijatelnou pro ekosystém daného toku. Úroveň ochrany vod před znečištěním se nejčastěji hodnotí podle vývoje produkovaného a vypouštěného znečištění. 2.2 Legislativní požadavky a normy Základním právním nástrojem v Evropské unii řešícím problematiku čištění odpadních vod je Směrnice Rady 91/271/EHS ze dne 21. května 1991 o čištění městských odpadních vod. Směrnice má za cíl zajistit ochranu povrchových vod před znečišťováním způsobeným vypouštěním komunálních odpadních vod a biologicky odbouratelných průmyslových odpadních vod. Pro vypouštěné vody z čistíren odpadních vod požaduje stanovit emisní limity a systém vzorkování, rozborů a kontroly. Základním právním nástrojem pro ochranu vod v České republice je Zákon č. 254/2001 Sb. ze dne 28. června 2001, o vodách (vodní zákon) a souvisejících předpisech, ve kterém pojem odpadní vody je definován v ustanovení 38, odstavec 1: Odpadní vody jsou vody použité v obytných, průmyslových, zemědělských, zdravotnických a jiných stavbách, zařízeních, nebo dopravních prostředcích, pokud mají po použití změněnou jakost (složení, nebo teplotu), jakož i jiné vody z nich odtékající, pokud mohou ohrozit jakost povrchových, nebo podzemních vod. Odpadní vody jsou i průsakové vody z odkališť, nebo ze skládek odpadu. V ustanovení 38, odstavci 3 je dále uvedeno, že ten, kdo vypouští odpadní vody do vod povrchových nebo podzemních, je povinen zajišťovat jejich zneškodňování v souladu s podmínkami stanovenými v povolení k jejich vypouštění. Při stanovování těchto podmínek je vodoprávní úřad povinen přihlížet k dostupným technologiím v oblasti zneškodňování odpadních vod. Ten, kdo vypouští odpadní vody do vod povrchových nebo podzemních, je povinen v souladu s rozhodnutím vodoprávního úřadu měřit objem vypouštěných vod a míru jejich znečištění a výsledky těchto měření předávat vodoprávnímu úřadu, který rozhodnutí vydal, a příslušnému správci povodí a pověřenému odbornému subjektu. Vodoprávní úřad tímto rozhodnutím stanoví místo a způsob měření objemu a znečištění vypouštěných 8

odpadních vod a četnost předkládání výsledků těchto měření. Podle ustanovení 38, odstavce 5 stanoví vodoprávní úřad při povolování vypouštění odpadních vod do vod povrchových nejvýše přípustné hodnoty jejich množství a znečištění. Přitom je vázán ukazateli vyjadřujícími stav vody ve vodním toku, ukazateli a hodnotami přípustného znečištění povrchových vod, ukazateli a přípustnými hodnotami znečištění odpadních vod a náležitostmi a podmínkami povolení k vypouštění odpadních vod, které stanoví vláda nařízením (Zákon č. 254/2001 Sb.). 2.2.1 EVROPSKÝ LEGISLATIVNÍ RÁMEC Hlavním legislativním nástrojem Evropských směrnic upravujícím vypouštění mědi a jejích sloučenin do vodního prostředí je Směrnice Rady 76/464/EHS ze dne 4. května 1976 o znečištění způsobeném určitými nebezpečnými látkami, vypouštěnými do vodního prostředí. Podle této směrnice náleží měď a její sloučeniny do Seznamu II, který obsahuje látky, které mají zhoubný účinek na vodní prostředí a pro něž podle článku 6 této směrnice nebyly určeny mezní hodnoty (pro odpadní a povrchové vody). Podle článku 2 přijmou členské státy opatření ke snížení znečištění vod nebezpečnými látkami v třídách a skupinách látek Seznamu II (stanoví emisní standardy, povolování vypuštění) a založí programy opatření vedoucí k tomuto cíli podle článku 7. 2.2.2 NÁRODNÍ LEGISLATIVNÍ RÁMEC Hlavním legislativním nástrojem v ČR upravujícím zastoupení mědi ve vodním prostředí je Nařízení vlády č. 61/2003 Sb. ze dne 29. ledna 2003, o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod, náležitostech povolení k vypouštění odpadních vod do vod povrchových a do kanalizací a o citlivých oblastech, které stanovuje emisní standardy pro obsah mědi v odpadních vodách vypouštěných z vybraných průmyslových a zemědělských odvětví, imisní standardy pro obsah mědi v povrchových vodách a požaduje nezvyšování jeho obsahu v sedimentech, plaveninách a živých organismech. 2.3 Množství, charakter a složení vod V rámci této metodiky je předmětem zájmu sledování a detekce měďnatých iontů v průmyslové odpadní vodě, ve vodě pitné a případně také vodě povrchové. 9

2.3.1 PRŮMYSLOVÉ ODPADNÍ VODY Jedná se o odpadní vody vypuštěné do veřejné kanalizace z průmyslových závodů. Tyto vody musí být před vypuštěním ze závodu do veřejné kanalizace upraveny tak, aby vyhovovaly provoznímu řádu kanalizace, respektive byly čistitelné technologií komunální čistírny odpadních vod (ČOV). Obecně však platí, že by průmyslové odpadní vody měly být odděleny a čištěny na samostatných průmyslových ČOV. Bohužel v minulosti byly takové vody, často s obsahem toxických látek (např. těžké kovy, pesticidy apod.), běžně vypouštěny do kanalizace, a to často bez ohledu na možnosti koncové ČOV. V současnosti je vyvíjen odborný, ale i ekonomický tlak na oddělení takovýchto vod od veřejné kanalizace. Množství, charakter a složení průmyslových odpadních je individuální a liší se dle typu a technologie výroby. Přípustný emisní limit pro průmyslové odpadní vody podle přílohy č. 1 k Nařízení vlády č. 61/2003 Sb. ze dne 29. ledna 2003, o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod (dále jen NV č. 61/2003 Sb.) je: pro těžbu a zpracování ostatních rud: 1 mg/l, pro textilní průmysl, pro barevnou metalurgii a pro spalování odpadů: 0,5 mg/l. Přípustné hodnoty znečištění pro odpadní vody vypouštěné ze strojírenské a elektrotechnické výroby (nejedná se o roční průměry a míru překročení stanovuje blíže Nařízení vlády č. 61/2003 Sb.) jsou: pro povrchovou úpravu kovů a plastů, smaltování, lakování a elektrotechnickou výrobu: 0,5 mg/l. 2.3.2 PITNÉ VODY Pitná voda patří k základním životním potřebám a její odpovídající příjem (spolu s příjmem dalších tekutin) je nejen podmínkou pro správné fungování všech procesů v lidském těle, ale přispívá i k duševní pohodě člověka. Pokud její kvalita neodpovídá hygienickým požadavkům, může způsobit různé zdravotní problémy akutního či chronického rázu. Riziko spojené s nevhodnou kvalitou nelze vyloučit u žádné vody, bez ohledu na to, zda se jedná o vodu z vodovodu nebo studny, o vodu upravenou nějakým zařízením nebo vodu balenou. Dle Zákona č. 258/2000 Sb. ze dne 14. července 2000, o ochraně veřejného zdraví a o změně některých souvisejících zákonů: "pitnou vodou je veškerá voda v původním stavu nebo po úpravě, která je určena k pití, vaření, přípravě jídel a nápojů, voda používaná v potravinářství, voda, která je určena k péči o tělo, k čištění předmětů, které svým určením přicházejí do styku s potravinami nebo lidským tělem, a k dalším účelům lidské spotřeby, a to bez ohledu na její 10

původ, skupenství a způsob jejího dodávání." Vyhláška č. 252/2004 Sb., kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody, pak doplňuje, že "pitná voda musí mít takové fyzikálně-chemické vlastnosti, které nepředstavují ohrožení veřejného zdraví" a udává nejvyšší mezní hodnotu (NMH) pro měď, která činí 1 mg/l. 2.3.3 POVRCHOVÉ VODY Pro hodnocení kvality povrchových vod, z hlediska možného znečištění, existuje řada předpisů. Např. v ČSN 75 7221 ze dne 1. července 1990 Jakost vod. Klasifikace jakosti povrchových vod, jsou povrchové vody podle soustavy mezních hodnot charakteristických ukazatelů rozřazeny do 5 tříd podle svého znečištění (Tab. 1). Tab. 1 Třídy povrchových vod charakter vody, mezní hodnoty pro měď (dle ČSN 75 72221) Třída Charakter vody Mezní hodnoty mědi mg/l I. Neznečištěná 0,05 II. Mírně znečištěná 0,02 III. Znečištěná 0,05 IV. Silně znečištěná 0,1 V. Velmi silně znečištěná 0,1 Nejdůležitější předpis v současné době však představuje Nařízení vlády č. 61/2003 Sb. ze dne 29. ledna 2003, o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod, ve kterém je v příloze č. 3, kategorie nebezpečné a zvlášť nebezpečné látky, stanovena limitní hodnota pro měď v povrchové vodě na 14 g/l. 2.4 Měď Měď (chemické označení Cu z lat. Cuprum) se vyskytuje v zemské kůře poměrně vzácně. Její obsah se odhaduje zhruba na 55-70 ppm (z angl. parts per milion, částic na jeden milion), přičemž ve vodě se její koncentrace pohybuje pouze na úrovni 0,003 mg/l. Ryzí měď je 11

poměrně vzácná, proto se s mědí setkáváme zejména ve sloučeninách, přičemž nejčastější jsou sulfidy (např. chalkosin Cu 2 S, chalkopyrit CuFeS 2 ). Mezi další minerály obsahující měď patří např. kuprit, malachit, nebo azurit. Ve sloučeninách se měď vyskytuje v mocenství Cu 1+, Cu 2+ a vzácně také Cu 3+, přičemž nejstálejší jsou sloučeniny měďnatých iontů (Cu 2+ ), které zpravidla mívají modrou nebo zelenou barvu. 2.4.1 ZDRAVOTNÍ ÚČINKY Měď patří mezi esenciální prvky pro lidský organismus, je přijímána potravou a akutní ani chronická onemocnění způsobená požíváním nejsou známa. Není tak jedovatá, jak se původně předpokládalo, ovlivňuje však negativně organoleptické vlastnosti vody (chuť) a jsou podezření na embryotoxické účinky. Silně toxická je naopak pro vodní organismy včetně ryb (Tab. 2), proto je ve vodárenských tocích přípustná koncentrace nižší než mezní hodnota pro pitnou vodu (nejvyšší mezní hodnota pro měď, dle Vyhlášky č. 252/2004 Sb. ze dne 22. dubna 2004, kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody, je stanovena na 1 mg/l). Tab. 2 Výsledky testů akutní toxicity na měďnaté ionty u vodních živočichů LC 50 mg/l Čas hod Živočich 2,1 24 Kapr obecný (lat. Cyprinus Cardo) 1,0 48 Kapr obecný (lat. Cyprinus Cardo) 0,81 96 Kapr obecný (lat. Cyprinus Cardo) 0,0098 48 Perloočka (lat. Daphnia) 0,4-0,5 48 Pstruh duhový (lat. Salmo gairdneri) 1,25 96 Slunečnice velkoploutvá (lat. Lepomis macrochirus) 2.4.2 METODY DETEKCE V normách ČSN, EN a ISO nejsou popsány metody, které by byly výhradně určeny jen pro stanovení mědi. Pouze v TNV 75 7426 (75 7426) z července 1998 Jakost vod Stanovení mědi bezplamenovou technikou je popsán postup pro stanovení technikou atomové absorpční spektrometrie. Pro stanovení mědi jsou popsány různé metody, které jsou použitelné pro stanovení mědi vedle ostatních kovů volbou provozních podmínek. Zde je uveden jejich přehled: 12

ČSN EN ISO 15586 (75 7381) ze srpna 2004 Jakost vod Stanovení stopových prvků atomovou absorpční spektrometrií s grafitovou kyvetou ČSN ISO 8288 (75 7382) z února 1995 Jakost vod. Stanovení kobaltu, niklu, mědi, zinku, kadmia a olova. Metody plamenové atomové absorpční spektrometrie ČSN EN ISO 11885 (75 7387) z 1. září 2009 Jakost vod Stanovení vybraných prvků optickou emisní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OS) ČSN EN ISO 17294 2 (75 7388) z července 2005 Jakost vod Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) TNV 75 7389 (75 7389) z dubna 2002 Jakost vod Stanovení rozpuštěné mědi, olova, kadmia, selenu, thalia, kobaltu, niklu, chromu a rtuti rozpouštěcí (stripping) voltametrií Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21. vydání, American Water Works Association/American Public Works Association/Water Environment Federation, Washington, 1. září 2005, autor: Greenberg Arnold a kol. V amerických standardních metodách jsou dále popsány i následující metody: Plamenová atomová absorpční spektrometrie (mez detekce 10 µg/l) Elektrotermická atomová absorpční spektrometrie (lze stanovit koncentrace mědi v desítkách µg/l) Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (mez detekce 6 µg/l) Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (mez detekce 0,003 µg/l) Jako alternativní metodu nevyžadující náročnou instrumentální techniku uvádějí americké standardní metody spektrofotometrickou metodou s neokuproinem (2,9- dimethyl-4,7-difenyl-1,10-fenylfenantrolindisulfonan sodný), která je založena na redukci Cu 2+ na Cu 1+ hydroxylaminem s následující reakcí s činidlem za vzniku barevného komplexu, který je extrahován směsí trichlormethanu a metanolu (mez detekce se pohybuje v jednotkách µg/l) 2.4.3 POUŽITÍ V PRŮMYSLU Použití mědi je značně široké a zasahuje do mnoha průmyslových odvětví (Tab. 3). 13

Průmysl Strojírenský Tab. 3 Použití mědi v jednotlivých průmyslových odvětvích Použití moření, mědění, galvanizace, svařovací technologie Chemický výroba akrylátových barev, barvítek, glazur, ftalocyaninu mědi, hydroponních roztoků, kapalných hnojiv katalyzátor při výrobě anilínu, aminů, vodíku, organických polotovarů a látek na bázi mědi neutralizace, laboratorní použití Slévárenský legovací přísada do šedé litiny pro samotné odlévání a pro odlitky výroba slitin mědi s ostatními kovy (patří zde tedy mosazi a bronzi) Elektrochemický pro výrobu elektrických a elektrotechnických zařízení při navíjení cívek, vinutí transformátorů opravy v elektrohalách Sklářský součást skla ve formě iontů Cu +, Cu 2+ a jako koloidní až makroskopické částice mědi, případně Cu 2 S Textilní reaktivní a kovokomplexní textilní barviva Ostatní potisk plechových tabulí, praní kovových dílů, třídění a mechanická úprava 2.4.4 ZDROJE ZNEČIŠTĚNÍ Zdrojem mědi v povrchových vodách mohou být odpadní vody z povrchové úpravy kovů (kde je měď přítomná převážně ve formě různých komplexů) a aplikace některých algicidních preparátů, které se dávkují proti nadměrnému rozvoji řas a sinic. V pitné a užitkové vodě může být zdrojem mědi rozpouštění měděného vodovodního potrubí v důsledku agresivního působení vody. Dalším zdrojem mědi mohou být i atmosférické depozice. Např.: podle státní evidence, vycházející z ustanovení 22 Zákona č. 157/1998 Sb. ze dne 11. června 1998, o chemických látkách a přípravcích a o změně některých dalších zákonů, bylo v předchozích letech evidováno v České republice sedm podniků dovážejících měď nebo její sloučeniny (měď, oxid měďnatý, síran měďnatý) a jeden podnik zabývající se výrobou. Podle evidence Registru průmyslových zdrojů znečištění část nebezpečné látky (Výzkumný ústav vodohospodářský T. G. Masaryka, v.v.i.) nakládání s mědí a jejími sloučeninami v roce 2001 uvedlo 105 subjektů, v množství 10 770 tun. Přehled výrob nebo nakládání s mědí a jejími sloučeninami ve vybraných odvětvích průmyslu České republiky je uveden na Obr. 1. 14

Obr. 1 Přehled výrob nebo nakládání s mědí a jejími sloučeninami ve vybraných odvětvích v České republice z roku 2001 2.5 Jednorázový detekční set LentiKats Jednorázový detekční set LentiKats (Obr. 2) je určen pro detekci měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách. Detekce pomocí setu je založena na barevné změně Biokatalyzátoru lentikats s imobilizovanými nativními rekombinantními kvasinkami v přítomnosti měďnatých iontů ve vzorku pitné a průmyslové odpadní vody. Intenzita vzniklého zabarvení Biokatalyzátoru lentikats je porovnávána se sérií kontrolních vzorků a lze tak následně stanovit, zda koncentrace měďnatých iontů ve vzorku sledované vody splňuje legislativně stanovený limit pro obsah mědi či nikoliv. Obr. 2 Jednorázový detekční set LentiKats 15

Na základě aktuálních legislativních požadavků vztahujících se k problematice geneticky modifikovaných organismů a faktu, že tento set využívá k detekci měďnatých iontů nativní rekombinantní kvasinky, je tento set v současné době určen výhradně pro ta pracoviště, kterým bylo vydáno povolení k uzavřenému nakládání s geneticky modifikovanými organismy pro I. kategorii rizika. Jelikož se však při nakládání s tímto setem jedná o I. kategorii rizika, výhledově lze očekávat možnost rozšíření i mimo specializovaná pracoviště. Pozn.: Dle Zákona č. 78/2004 Sb. ze dne 22. ledna 2014, o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty (příloha 3) I. kategorie představuje činnosti bez rizika nebo se zanedbatelným rizikem škodlivého působení na zdraví a životní prostředí; tj. činnosti, při nichž k tomu, aby bylo ochráněno zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologická rozmanitost, postačí úroveň uzavření a ochranná opatření stanovená tímto zákonem pro první kategorii rizika. 2.5.1 SLOŽENÍ SETU Jednorázový detekční set LentiKats tvoří: 4 vialky s obsahem testovacího média (vialka a-d), se známým přídavkem měďnatých iontů (výsledná koncentrace 1 mg/l; vialka b-c) Vialka Vzorek Testovací médium a Kontrolní Testovací médium (5 ml) b Kontrolní Testovací médium (5 ml) se známým přídavkem měďnatých iontů (výsledná koncentrace 1 mg/l u setu pro pitné nebo 0,5 mg/l u setu pro průmyslové odpadní vody) c Kontrolní Testovací médium (2 ml) se známým přídavkem měďnatých iontů (výsledná koncentrace 1 mg/l u setu pro pitné nebo 0,5 mg/l u setu pro průmyslové odpadní vody) + následný přídavek reálného média (3 ml) uživatelem setu d Testovaný Testovací médium (2 ml) + následný přídavek reálného média (3 ml) uživatelem setu 16

4 vialky obsahující vždy 3 kusy Biokatalyzátoru lentikats v 0,5 ml sterilní vody (vialka A-D) Vialka Vzorek Biokatalyzátor lentikats A Kontrolní 3 ks Biokatalyzátoru lentikats v 0,5 ml sterilní vody B Kontrolní 3 ks Biokatalyzátoru lentikats v 0,5 ml sterilní vody C Kontrolní 3 ks Biokatalyzátoru lentikats v 0,5 ml sterilní vody D Testovaný 3 ks Biokatalyzátoru lentikats v 0,5 ml sterilní vody 4 kusy injekčních stříkaček (5 ml) a 1 kus injekční stříkačky (20 ml) s ostrou jehlou Polystyrenový stojan 2.5.2 SKLADOVACÍ PODMÍNKY Jednorázový detekční set LentiKats je nutné skladovat v dodaném polystyrenovém stojanu tak, aby nedošlo k případnému poškození setu. Set uložený v polystyrenovém stojanu je možné přepravovat za dodržení podmínek souvisejících s povolením k uzavřenému nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy I. kategorie rizika. Doporučené teplotní rozmezí pro manipulaci se setem je 15-25 C. Teplotní optimum pro dlouhodobé skladování se však pohybuje v rozmezí 4-8 C. Stabilita tohoto setu je max. 3 měsíce. 2.5.3 LIMITY DETEKCE Pro detekci měďnatých iontů ve sledovaných vzorcích pitných a průmyslových odpadních vod byl stanoven koncentrační bod detekce měďnatých iontů na základě legislativně udávaných hodnot 1 mg/l pro pitné vody nebo 0,5 mg/l pro průmyslové odpadní vody. Jednorázový detekční set LentiKats lze tedy uživatelům standardně dodávat pro oba výše uvedené koncentrační body detekce. V případě potřeby je však možné tento koncentrační bod detekce přizpůsobit požadavkům uživatele, dle jeho aktuálních potřeb (např. pro specializované provozovny) a nastavit na jím požadovanou koncentraci pro stanovení pod/nad limitního obsahu mědi. 17

2.5.4 INTERFERENCE Potenciálními interferenty jednorázového detekčního setu LentiKats byly stanoveny: Stříbro a jeho sloučeniny Zinek a jeho sloučeniny 2.5.5 PŘÍPRAVA REÁLNÉHO MÉDIA Reálné médium (sledovaná pitná či průmyslová odpadní voda) je nutné před vlastním použitím k detekci měďnatých iontů pomocí jednorázového detekčního setu LentiKats upravit: 1. Vzorek reálného média musí být zbaven hrubých nečistot 2. U vzorku reálného média musí být upraveno ph na hodnotu 4,5-6,0 2.5.6 NÁVOD NA POUŽITÍ Před započetím vlastní detekce měďnatých iontů ve vzorku pitné či průmyslové odpadní vody je nutné pomocí injekčních stříkaček (5 ml) s ostrou jehlou: 1. Přenést obsah testovacího média z vialky a k Biokatalyzátoru lentikats do vialky A (a A) 2. Přenést obsah testovacího média s obsahem měďnatých iontů z vialky b k Biokatalyzátoru lentikats do vialky B (b B) 3. Přidat 3 ml reálného média k testovacímu médiu s obsahem měďnatých iontů do vialky c a následně přenést celý objem k Biokatalyzátoru lentikats do vialky C (reálné médium c C) 4. Přidat 3 ml reálného média k testovacímu médiu do vialky d a následně přenést celý objem k Biokatalyzátoru lentikats do vialky D (reálné médium d D) Pozn.: Pro každý výše uvedený bod je nutné použít čistou injekční stříkačku s čistou ostrou jehlou. Na základě výše uvedené přípravy setu před vlastním použitím je dále nutný níže uvedený postup ke stanovení obsahu měďnatých iontů v kontrolních vzorcích a testovaném vzorku: 1. Kultivace vialek A-D v termostatu při 28-30 C po dobu 12-24 hodin 18

Zbarvení Biokatalyzátoru lentikats UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA 2. Následná inkubace v třepačce (120 ot./min.) při 28-30 C po dobu 10 min. 3. Vyhodnocení zbarvení Biokatalyzátoru lentikats (vialka A-D) 2.5.7 VYHODNOCENÍ Vialka A B C D Vzorek Kontrolní Kontrolní Kontrolní Testovaný Vyhodnocení bílá červená červená bílá bílá červená červená červená bílá červená bílá červená bílá červená bílá bílá Vzorek neobsahuje měďnaté ionty ( 0,06 mg/l) Vzorek obsahuje měďnaté ionty: 1 mg/l *, pokud je zbarvení kontrolního vzorku (vialka D) světlejší než zbarvení kontrolního vzorku (vialka B) nebo 1 mg/l *, pokud je zbarvení kontrolního vzorku (vialka D) výraznější než zbarvení kontrolního vzorku (vialka B) Vzorek obsahuje příliš vysokou koncentraci měďnatých iontů (>7 mg/l) Vzorek obsahuje měďnaté ionty ( 7 mg/l) nebo další toxické látky; inhibice metabolismu imobilizovaných rekombinantních kvasinek V případě červeného zbarvení u kontrolního vzorku (vialka A) či bílého zbarvení u kontrolního vzorku (vialka B) pravděpodobně došlo k pochybení při použití testu a je nutné test zopakovat s použitím nového setu; *0,5 mg/l u testu pro průmyslové odpadní vody 2.5.8 PŘÍKLADY VYHODNOCENÍ Příklady vyhodnocení intenzity zbarvení Biokatalyzátoru lentikats při detekci měďnatých iontů jsou uvedeny níže, na příkladu 1-4 (vzorku pitné vody). Intenzita zbarvení Biokatalyzátoru lentikats je přímo úměrné obsahu měďnatých iontů v reálném vzorku sledované pitné vody. V případě příliš vysokých koncentrací ( 7 mg/l) měďnatých iontů ve vzorku dochází k inhibici metabolismu imobilizovaných rekombinantních kvasinek a Biokatalyzátor lentikats zůstává nezbarven (viz. Příklad 3 vialka C, Příklad 4 vialka C, D). 19

Příklad 1 Vzorek neobsahuje měďnaté ionty ( 0,06 mg/l) Vialka A B C D Vzorek Kontrolní Kontrolní Kontrolní Testovaný Zbarvení Biokatalyzátoru lentikats Příklad 2 Vzorek obsahuje měďnaté ionty (>1 mg/l) Vialka A B C D Vzorek Kontrolní Kontrolní Kontrolní Testovaný Zbarvení Biokatalyzátoru lentikats Příklad 3 Vzorek obsahuje příliš vysokou koncentraci měďnatých iontů ( 7 mg/l) Vialka A B C D Vzorek Kontrolní Kontrolní Kontrolní Testovaný Zbarvení Biokatalyzátoru lentikats Příklad 4 Vzorek obsahuje inhibiční koncentraci měďnatých iontů ( 7 mg/l) nebo dalších toxických látek Vialka A B C D Vzorek Kontrolní Kontrolní Kontrolní Testovaný Zbarvení Biokatalyzátoru lentikats 20

2.5.9 LIKVIDACE Po vyhodnocení intenzity zbarvení Biokatalyzátoru lentikats a stanovení nad/pod limitní koncentrace měďnatých iontů ve sledovaném vzorku pitné nebo průmyslové odpadní vody je nutné pomocí čisté injekční stříkačky s ostrou jehlou (20 ml) přidat do všech použitých vialek (vialka A-D) po 5 ml koncentrovaného desinfekčního roztoku (např.: SAVO Originál, Ajatin PLUS roztok 10%, Persteril 36%) a intenzivně protřepat. Na základě takto provedené deaktivace nativních rekombinantních kvasinek imobilizovaných v použitém Biokatalyzátoru lentikats lze set následně zlikvidovat, jako odpad typu 18 01 03 Odpady, na jejichž sběr a odstraňování, jsou kladeny zvláštní požadavky s ohledem na prevenci infekce (kategorie odpadu N). 3 Srovnání novosti postupů Zpracovaná metodika nabízí novou možnost detekce měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách pro uživatele a lokality, kde není možné provádět speciální laboratorní stanovení s využitím instrumentální techniky či pravidelné kvantitativní rozbory (např. galvanické provozovny, vody v odlehlých lokalitách či vody v lokalitách, kde není přístup k nákladným instrumentálním zařízením, apod.). Tato metodika, prostřednictvím jednorázového detekčního setu LentiKats, uživateli poskytuje možnost detekovat nad/pod limitní koncentrace měďnatých iontů v jím analyzované pitné či průmyslové odpadní vodě. Uživatel tak získá informaci, zda obsah měďnatých iontů nepřekračuje legislativně uváděné limity, které se pohybují v rozmezí 0,5-1 mg/l. Metodika shrnující princip a postup detekce měďnatých iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách vč. následného vyhodnocení, za použití jednorázového detekčního setu LentiKats využívajícího Biokatalyzátoru lentikats s imobilizovanými rekombinantními kvasinkami, nebyla dosud publikována. 21

4 Popis uplatnění Metodika shrnuje současné poznatky v oblasti detekce měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách a současně také aktuální legislativní požadavky související s obsahem měďnatých iontů v těchto typech vod. Stěžejní součástí metodiky je popis jednorázového detekčního setu LentiKats, který zahrnuje především postup na jeho použití vč. návodu k vyhodnocení s ukázkou názorných příkladů. Metodiku lze uplatnit v případě využití jednorázového detekčního setu LentiKats na detekci měďnatých iontů dle legislativně udávaných limitů pro pitné vody (detekční set pro koncentraci měďnatých iontů 1 mg/l) nebo průmyslové odpadní vody (detekční set pro koncentraci měďnatých iontů 0,5 mg/l). 5 Ekonomické aspekty Zavedení postupů uvedených v metodice spojených s využitím jednorázového detekčního setu LentiKats do praxe, představuje pro uživatele možnost detekce měďnatých iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách v lokalitách, kde není možné provádět speciální laboratorní stanovení s využitím instrumentální techniky či v případech, kde není nutné provádět pravidelné kvantitativní rozbory (např. galvanické provozovny). Ekonomický přínos pro uživatele metodiky, spojený s využitím jednorázového detekčního setu LentiKats, je přímo závislý na aktuálních potřebách a požadavcích daného provozu či lokality. Použití setu k detekci měďnatých (Cu 2+ ) iontů v pitných a průmyslových odpadních vodách, v porovnání s klasickými instrumentálními technikami, nabízí relativně levné řešení a rozlišení, zda analyzovaný vzorek splňuje či nesplňuje legislativní požadavky bez nutnosti provádět analýzy pomocí ekonomicky nákladných speciálních instrumentálních technik. Finanční úspora pro koncového uživatele využívajícího jednorázový detekční set LentiKats bude zcela individuální a lze ji jen velmi hrubě odhadnout na jednotky až desítky tisíc korun. Významným přínosem jednorázového detekčního setu LentiKats je především možnost nastavit koncentrační bod detekce měďnatých iontů, dle požadavků zákazníka. Zřejmým přínosem je současně i možnost využití detekčního setu v odlehlých lokalitách či v lokalitách, kde není přístup k nákladným instrumentálním zařízením. 22

6 Seznam použité a související literatury ČSN 75 7111 (75 7111) z 1. listopadu 1990 Jakost vod. Pitná voda. ČSN 75 7221 ze dne 1. července 1990 Jakost vod. Klasifikace jakosti povrchových vod. ČSN EN ISO 11885 (75 7387) z 1. září 2009 Jakost vod Stanovení vybraných prvků optickou emisní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OS). ČSN EN ISO 15586 (75 7381) ze srpna 2004 Jakost vod Stanovení stopových prvků atomovou absorpční spektrometrií s grafitovou kyvetou. ČSN EN ISO 17294 2 (75 7388) z července 2005 Jakost vod Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). ČSN ISO 8288 (75 7382) z února 1995 Jakost vod. Stanovení kobaltu, niklu, mědi, zinku, kadmia a olova. Metody plamenové atomové absorpční spektrometrie. Greenberg A. a kol.: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21. vydání, American Water Works Association/American Public Works Association/Water Environment Federation, Washington, 1. září 2005. Groda B., Vítěz T., Machala M., Foller J., Surýnek D., Musil J.: Čištění odpadních vod jako nástroj k ochraně životního prostředí v zemědělské praxi a na venkově. MZLU Brno, 2007, s. 57 [online] [cit. 2014-07-17]: http://eagri.cz/public/web/file/26962/cisteni_odpadnich_vod.pdf Integrovaný registr ukazuje na největší zdroje znečištění vodních toků [online, 2011-01-05] [cit. 2014-07-17]: http://arnika.org/integrovany-registr-ukazuje-na-nejvetsi-zdroje-znecisteni-vodnich-toku Kleger L.: Měď [online] [cit. 2014-07-17]: http://arnika.org/med Krištof O.: Úprava laboratorních odpadních vod obsahujících těžké kovy, Bakalářská práce, FCH, VUT Brno 2009, s. 46 [online, 2014-01-29] [cit. 2014-07-17]: https://dspace.vutbr.cz/xmlui/bitstream/handle/11012/13715/ond%c5%99ej_kri%c5%a1tof_bp.pdf?s equence=1&isallowed=y Kriteria znečištění zemin a podzemní vody dle Metodického pokynu Ministerstva životního prostředí ze dne 31. července 1996, s. 7 [online] [cit. 2014-07-17]: http://www.eliodservis.cz/czech/abclimity.pdf Měď a její sloučeniny, s. 11. [online] [cit. 2014-07-17]: http://www.registrpovinnosti.com/df23h54/voda/registrlegislativy/med.pdf Měď a její sloučeniny. Číslo CAS 7440 02 0 [online] [cit. 2014-07-17]: http://www.irz.cz/node/163#voda Nařízení vlády č. 61/2003 Sb. ze dne 29. ledna 2003, o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod. Pitná voda. Státní zdravotní ústav [online] [cit. 2014-07-17]: http://www.szu.cz/tema/zivotni-prostredi/pitna-voda 23

Směrnice Rady 76/464/EHS ze dne 4. května 1976, o znečištění způsobeném určitými nebezpečnými látkami, vypouštěnými do vodního prostředí. Směrnice Rady 91/271/EHS ze dne 21. května 1991, o čištění městských odpadních vod. TNV 75 7426 (75 7426) z července 1998 Jakost vod Stanovení mědi bezplamenovou technikou. TNV 75 7389 (75 7389) z dubna 2002 Jakost vod Stanovení rozpuštěné mědi, olova, kadmia, selenu, thalia, kobaltu, niklu, chromu a rtuti rozpouštěcí (stripping) voltametrií. Vyhláška č. 252/2004 Sb. ze dne 22. dubna 2004, kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody. Zákon č. 157/1998 Sb. ze dne 11. června 1998, o chemických látkách a přípravcích a o změně některých dalších zákonů. Zákon č. 254/2001Sb. ze dne 28. června 2001, o vodách (vodní zákon) a souvisejících předpisech. Zákon č. 258/2000 Sb. ze dne 14. července 2000, o ochraně veřejného zdraví stanoví a o změně některých souvisejících zákonů. Zákon č. 78/2004 Sb. ze dne 22. ledna 2014, o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty. 7 Seznam publikací, které předcházely metodice Prezentace/abstrakt Vopálenská I., Janderová B., Váchová L., Palková Z.: A new sensor system for detection of heavy metal ions, 41 st Annual Conference on Yeasts, May 20-23, 2014, Smolenice, Slovakia, ISSN 1336-4839. Přihláška patentu Vopálenská I., Palková Z., Váchová L.: Způsob modifikace detekčního kvasinkového kmene. Přihláška patentu PV 2014-269, ze dne 18.4.2014, přihlašovatel Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta a Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. 24