GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik

Transkript

1 GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních analytických problémů včetně rychlých a multidimenzionálních technik

2 GC 2

3 Kapilární kolony Sympozium v Amsterodamu M.J.E. Golay 2 chromatogramy dělení všech uhlovodíků C 6 do 9 min., 45,7 m, ID. 0,25 µm, teor. pater, 0,5 ml/min McWilliam FID detektor D.H.Desty (BP) první chromatograf pro kapilární kolony a FID dříve skleněné nebo z nerezové oceli dnes výhradně křemenné s polyimidem kapilára (5-150m) vnější stěna je pokryta polyimidovým filmem na vnitřní stěnu je navázána stacionární fáze kolona je charakterizována následujícími parametry typem fáze délkou kolony (5-150m) ID (vnitřní průměr) ( mm) tloušťka fáze d f ( µm) 3

4 Kapacita kapilárních kolon Kategorie Vnitřní průměr Kapacita Megabore 0,53 mm ng Wide bore 0,32 mm ng Narrow bore 0,25 mm ng Microbore 0,18 0,20 mm ng Pro šířku filmu 0,25 µ Zdroj: D. Rood: A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting of Capillary Gas Chromatography Systems, 3 rd Edition, Wiley,

5 Rychlost GC separace Typ GC analýzy Doba separace w 1/2 píku Konvenční >10 min >1 s Rychlá 1 10 min ms Velmi rychlá 0,1 1 min ms Ultra-rychlá <0,1 min 5 30 ms Zdroj: K. Maštovká, S.J. Lehotay (2003) J. Chromatogr. A 1000,

6 Srovnávací tabulka Column ID Sample Capacity (ng) He H 2 flow@40cm/sec. Theoretical Plates/m Effective Plates/m 0.10mm mm mm mm m mm m cc/ 0.3cc/ 0.7cc/ 1.0cc/ 2.6cc/m min. min. min. min. in. 0.2cc/ 0.6cc/ 1.4cc/ 2.0cc/ 5.2cc/m min. min. min. min. in

7 uv 90e3 80e3 70e3 60e3 50e3 40e3 30e3 20e3 72 min C O N V. 10e3 uv e min 90e3 80e3 70e3 60e3 50e3 40e3 30e3 16 min F A S T 20e3 10e3 uv e min 2.3 min min U L T R A F A S 7 T

8 Aplikace v plynové chromatografii 1. Petrochemie plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta 2. Biochemie, farmacie, soudní chemie FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště 3. Potraviny a nápoje FAME, barviva a vůně, pesticidy,. 4. Životní prostředí pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy 5. Sledování ovzduší sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí 6. Chemie kontrola jednotlivých kroků syntéz 8

9 SUPELCO 9

10 Typy fází nevázané SP-... (Supelco Phase), SE-30, SE-54, DEX) vázané SPB - Supelco Phase Bonded Equity 1, 5, 1710 SLB- 5ms- Supelco Low Bleed SUPELCOWAX 10 Polyethyleneglykol tepelně stabilní do 280 C SLB-IL 10

11 Stacionární fáze Nepolární 100 % dimethylpolysiloxan (5 %-fenyl)methylpolysiloxan Chirální Cyklodextrinové deriváty Polární (50 %-fenyl)methylpolysiloxan Polyethylenglykol (70 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan (100 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan 11

12 Supelco chirální kapilární GC 12 Oxygen containing analytes in the form of alcohols, ketones, acids, aldehydes, and lactones; halogenated compounds Aliphatic and aromatic amines; aliphatic and some aromatic esters; polar racemates Lactones and aromatic amines; epoxides; styrene oxide Amino acids; amines; furans Aliphatic, olefenic, and aromatic enantiomers Terpenes and tertiary amines Heterocyclic amines Xylenes, menthols, cresols, substituted phenols, substituted benzenes, epoxide enantiomers Acids, alcohols, amines, diols, esters, ethers, halohydrocarbons, hydrocarbons, ketones, positional isomers, silanes, terpenes, terpineols methamphetamine By Chemistry CHIRALDEX TA X CHIRALDEX DP X CHIRALDEX PN X CHIRALDEX BP X CHIRALDEX DM X Supelco DEX 325 X Supelco DEX 225 X CHIRALDEX Bonded B-PM X CHIRALDEX PM X Supelco DEX 120 X Supelco DEX 110 X CHIRALDEX DA X CHIRALDEX PH X By Cyclodextrin alpha-cyclodextrin X beta-cyclodextrin X gamma-cyclodextrin X

13 13

14 SUPELCO kolony pro analýzy životního prostředí, ovzduší SPB-608 nízké koncentrace pesticidů a herbicidů, ECD (US EPA 508, 608, 8080, 8081) SP-2331 polární kyanosilikonová fáze - dioxiny 1986 VOCOL těkavé organické látky (US EPA 502.2, 524.2, 624, 8240, 8260, 8021) Sup-Herb herbicidy dle US EPA metody SPB-624 těkavé halogenované, nehalogenované a aromatické kontaminanty z vody vyhovuje řadě US EPA metod SPB-HAP nebezpečné látky znečišťující ovzduší Equity 1, 5,

15 SLB- 5ms SLB- 5ms je určena pro stopové analýzy Vývoj byl zaměřen na nový způsob deaktivace povrchu křemenné kapiláry nový typ polymeru Stabilní, nedochází k úniku stacionární fáze čistá MS spektra lepší poměr signál/šum nižší kontaminace MS detektoru 15

16 Únik stacionární fáze Tradiční kolona - 5% fenyl O Si O Si 5 % Eliminace cyklotrisiloxanu (D3) za vysokých teplot nebo v katalytickém prostředí. Další je eliminace oktametylcyklotetrasiloxan (D4). Me Me 95 % n Si O Si O Si Si O Si O Si + O Si Si O O Si D3 O Si 16

17 MS Spectrum - únik stacionární fáze Abundance 6500 Scan 4970 ( min): D D D m/z-->

18 Únik stacionární fáze Silphenylene-Siloxane Copolymer Me Me Me O Si Si O Si Me Me Me x n poly{poly[oxy(dimethylsilandiyl]oxy(dimethylsilandiyl) (1,4-fenylen)(dimethylsilandiyl)} 18

19 SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách 19

20 SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech a povrchových vodách 20

21 SUPELCO kolony pro petrochemické aplikace Analýzy uhlovodíků Analýzy permanentních plynů, lehkých uhlovodíků atd. SIMDIS Analýzy aromátů Misc. Petrocol DH 50.2 Carboxen-1006 PLOT Petrocol 2887 TCEP SCOT Petrocol DH Carboxen 1010 PLOT Petrocol EX2887 Petrocol DH150 Mol Sieve 5A PLOT SGE HT-5 Petrocol DH Octyl Supel-Q PLOT SPB-1 Sulfur 21

22 PLOT kolony - charakteristika Carboxen 1006 Carbon Mole Sieve Carboxen 1010 (7A) Carbon Mole Sieve Mol Sieve 5A Zeolite Supel-Q Porus Polymer Alumina sulfate deaktivated Na 2 SO 4 Alumina Chloride deaktivated KCl 715 m 2 /g Sférické Permanentní plyny 675 m 2 /g Sférické Permanentní plyny 325 m 2 /g Nepravidelné Permanentní plyny 705 m 2 /g Sférické Těkavé a středně těkavé látky m 2 /g Nepravidelné C1-C12 Uhlovodíky m 2 /g Nepravidelné C1-C12 Uhlovodíky, Freony 22

23 PLOT Alumina Sulfate a Chloride Separace uhlovodíků C1 a C4. Kombinace upraveného povrchu a porózity umožňuje separaci methanu od C2 uhlovodíků, acetylen po n-butanu, separuje se n-penten a 1,3 butadien. PLOT Alumina Chloride je méně polární. separují se na ní např. i freony Time (min) Time (min) analytů / 35 C (2.5 min.)-> 5 C/min.->150 C Sulfate Peak List (top) 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. n-butane 9. propadiene 10. acetylene 11. trans-2-butene butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. 1,3-butadiene 18. propyne Chloride Peak List 1. methane 2. ethane 3. ethylene 4. propane 5. cyclopropane 6. propylene 7. isobutane 8. acetylene 9. n-butane 10. propadiene 11. trans-2-butene butene 13. isobutylene 14. cis-2-butene 15. isopentane 16. n-pentane 17. propyne 18. 1,3-butadiene 23

24 Analýzy FAME Biochemie Analýza potravin Bionafta 24

25 SUPELCO kolony pro FAME kapilání SP SP Omegawax Omegawax SPB-PUFA Omegawax

26 GC Analysis of Plasma FAMEs on the SUPELCOWAX m 0.10 mm I.D., 0.10 µm 26

27 Omega 3 a 6 mastné kyseliny Analýzy obsahu trans a Omega 3 a 6 mastných kyselin v potravinách se staly velice populární od té doby, kdy se obsah tzv. zdravých tuků musí uvádět na obalech potravin. Rostoucí spotřeba Omega 3 mastných kyselin je spojována se snižováním nebezpečí nemoci věnčitých tepen a zároveň se vyzdvihuje jejich význam při vývoji dětského mozku. Analýzy jsou dlány podle AOAC Metody nebo AOCS Metody Ce 1i-07 na 30 metrové koloně Supelcowax 10 nebo Omegawax za 30 až 40 minut. Nová kolona Omegawax 100 µm ID kapilární kolona tento čas významně zkracuje. 27

28 FAMEs Mastné kyseliny se dělí GC, a to jako methylestery (FAME) Je třeba je derivatizovat. Volba vhodné kolony bude záviset na předpokládaných analytech. Nepolární kolony se používají pro separace nasycených a nenasycených mastných kyselin. Kolony na bázi polyethyleneglycolů zase dělí podle délky uhlíkovéhořetězceči podle stupně nenasycenosti kyselin. Pokud dělíme cis/trans izomery mastných kyselin včetně jejich polohových izomerů, tak většinou používáme vysoce polární kyanosilikonovou fázi. 28

29 Omezení klasických metod 16:0 18:0 18:1 18:2 18: Time (min) Tuk extrahovaný z margarinu 6t 9t 10t 11t 12t 13t 6c 7c 9c Překryv píků 18:1 trans a cis isomerů 10c 11c 12c 13c Time (min) 29

30 SPE Discovery Ag-Ion Supelco Stabilní stříbrná SPE fáze Při použití běžných organických rozpouštědel nedochází k uniku stacionární fáze Stabilní barva Světlo nemá vliv na Ag-ION sorbent Dlouháživotnost Kapacita 750mg SPE tube až 1 mg celkových FAMEs Předseparace je vysoce reprodukovatelná 30

31 Mechanismus interakce Mastná kyselina electron donor Stříbro - electron akceptor Cis-mastné kyseliny tvoří pevnější komplex než trans Čím větší počet dvojných vazeb, tím silnější interakce SPE Support - SO 3 Ag + O OCH 3 C 4 H 8 C 11 H 23 Charge-transfer complex between Ag + and unsaturated bond 31

32 Discovery Ag-Ion postup 32

33 Cis/Trans FAME - předseparace 33

34 Ag-ION SPE metoda pro cis/trans FAME separace 1. Kondicionace 4 ml aceton 2. Equilibrace 4 ml hexan 3. Vzorek1 ml (1mg/ml) FAMEs v hexanu, průtok 5mL/min 4. Eluce - frakce 1 6 ml hexan:aceton (96:4 v/v) 5. Eluce - frakce 2 4 ml hexan:aceton (90:10 v/v) 6. Eluce - frakce 3 4 ml aceton 7. Eluce - frakce 4 4 ml aceton:acetonitril (97:3) 8. Odpaření a rozpuštění v hexanu, GC 34

35 GC separace na SP m x 0.18 mm ID Použití kratší GC kolony (SP2560, 75 m) a nosný plyn vodík výrazné zkráceníčasu analýzy. Pec: Inj.: Det.: Nosný plyn: Nástřik: Liner: 180 o C, izotermální 220 o C FID, 220 o C vodík, 40 cm/sec při 180 o C 0.5 µl, 100:1 split 4 mm ID, split 35

36 Standardní směs FAMEs Celkový obsah FAMEs je 1 mg/ml Standard Mixture 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 18: Time (min) SPE fraction1 18:1 t Hexan: Aceton 96: Time (min) SPE fraction 2 18:1 c Hexan: Aceton 90: Time (min) SPE fraction 3 Aceton Time (min) SPE fraction 4 Acetonitril Time (min) 36

37 Výsledky analýzy FAMEs (% recovery) Elution 18:0 18:1t 18:1c 18:2tt 18:2 c/t 18:2cc 18:3ttt 18:3 1 6 ml Hexan:aceton (96:4) ml Hexan:aceton (90:10) ml Aceton ml Aceton:acetonitril (97:3) TOTAL Izomer 18:3ccc lze eluovat 100% ACN 37

38 Analýza bramborových chipsů Rozemlít a extrahovat 4 x 4ml petroletheru Podpařit a rozpustit v toluenu Esterifikace 7% BF3/MeOH Po esterifikaci se re-extrahoje do hexanu a vysuší sena 2 SO 4 Předseparace Ag-ION SPE 750mg/6 ml 38

39 Analýza bramborových chipsů counts Untreated extract 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 18: Time (min) counts SPE Fraction 1 18:1 t counts SPE Fraction 2 18:1 c Time (min) counts SPE Fraction Time (min) 39

40 Řepkový olej analýza FAME Řepkový olej je typickým reprezentantem rostlinných olejů. Obsahuje nenasycené, mono a více nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Následující chromatogram ukazuje 6 minutovou analýzu nenasycených cis FAME na koloně Omegawax 100 column. 40

41 Řepkový olej - FAME, Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D. x 0.10 µm Myristic (C14:0) 2. Palmitic (C16:0) 3. Stearic (C18:0) 5. Linoleic (C18:2n6c) 6. Linolenic (C18:3n3) 7. Arachidic (C20:0) 8. cis-11-eicosenoic (C20:1) 9. Behenic (C22:0) 10. Erucic (C22:1n9) 11. Lignoceric (C24:0) Time (min) column: Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D., 0.10 µm oven: 140 C, 40 C/min. to 260 C (2 min.) inj: 250 C det.: FID, 260 C carrier gas: H 2, 55 cm/sec., constant injection: 0.2 µl, 200:1 split liner: 4 mm I.D., cup split sample: Rapeseed Oil FAME Mix 41

42 42

43 EN FAMEs v bionaftě, Omegawax 43

44 EN FAMEs v bionaftě, Omegawax 44

45 45

46 GC kolony s fází na bázi iontových kapalin aniont CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 cation linkage cation N + N N + N anion CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát) anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota málo těkavé, stabilní až do 380 C určené pro analyty s širokým rozsahem polarit 46

47 Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita -Octyl 280 C C C C C C C C PAG 220 C PEG 280 C C C C TCEP 145 C Non- Polar Intermediate Polar Polar Highly Polar Extremely Polar SLB-IL C SLB-IL C SLB-IL C SLB-IL C SLB-IL C 47 sigma-aldrich.com/il-gc

48 Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants. P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100). Prof. Luigi Mondello (University of Messina, Italy) 48 sigma-aldrich.com/il-gc

49 První publikace v

50 SP metrů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs 50

51 SLB-IL meterů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs 51

52 Omezení konvenční 1D-GC Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků Složky aroma (např. aroma kávy: sloučenin) Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy) Chybná / nemožná identifikace analytů Nadhodnocení / podhodnocení výsledků Řešení Nové detekční techniky Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC) 52

53 Kompletní dvourozměrná GC (GC GC) Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem Injektor Modulátor Detektor Primární kolona Obvykle narrow bore (nepolární) kolona (30 m 0,25 mm 0,25 µm) Sekundární kolona Obvykle microbore (polární) kolona (1 m 0,10 mm 0,10 µm) 53

54 KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony Kryogenicky zaostřenéčásti jsou přeneseny na 2. kolonu Rychlá separace na 2. koloně Modulace (kryogenní zaostření) Efluent z 1. kolony Efluent z 2. kolony 54

55 TVORBA GC GC CHROMATOGRAMU 1D chromatogram (výstup z první kolony) MODULACE Základní 2D chromatogram (výstup z druhé kolony) TRANSFORMACE 2D chromatogramy naskládané vedle sebe Vrstevnicový půdorys 2D chromatogramu VIZUALIZACE 55

56 VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků Zlepšení detekce Tvorba strukturovaných chromatogramů 56

57 VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků (n c ) Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou do separačního prostoru (chromatogramu) zvýšení separační účinnosti 1. Dimenze 2. Dimenze Konvenční kapilární kolona n = n c (celk) = n c (kolona 1) n c (kolona 2) GC GC (kolona druhé dimenze: n = 25) n = =

58 Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu 1D-GC Dichlorvos 0,01 mg/kg v přečištěném extraktu jablek Interference: m/z 109 (kvantifikace) m/z 79 (identifikace) BEZ SHODY S KNIHOVNOU SPEKTER 58 Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003)

59 Zvýšení kapacity píků: Separace cílového analytu od koextraktu GC GC Dichlorvos spolehlivě identifikován a kvantifikován Výsledek zvýšené kapacity píků 5-hydroxymethyl- 2-furan-karbaldehyd H it N a m e R e v e rs e C A S P h o s p h o ric a c id, 2,2-1 d ic h lo ro vin yl d im e th yl e s te r P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 2 d im e th yl e ste r P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 3 d im e th yl e ste r P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 4 d im e th yl e ste r P h o s p h o ric a c id, 2,2 -d ic h lo ro v in yl 5 d im e th yl e ste r Separovaný koextrakt 59 Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003)

60 Strukturované chromatogramy Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických skupin) Specifické interakce Separace podle polarity Systém: nepolární polární kolony Separace podle bodu varu Tlak par (Těkavost) 60

61 Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME Systém: nepolární polární kolony polyethylenglycol 5 % fenylmethylpolysiloxan Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010)

62 Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME Systém: polární nepolární kolony 50 % fenylmethylpolysiloxan polyethylenglycol 62 Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010)

63 GC doplňky a nářadí 63

64 HPLC 64

65 Trendy v současné HPLC Rychlá chromatografie (UHPLC) Vysoké rozlišení Zvýšení separační účinnosti Snížení meze detekce Krátký čas separace Ekonomický provoz Ekologický provoz 65

66 Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors ChromatographyOnline.com 66

68 Ascentis HPLC kolony Ascentis HPLC kolony jsou 4 generací SUPELCO HPLC kolon Zahrnují následující typy kolon: C18, C8, ES-CN, Si, Phenyl, RP-Amide, Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí. Discovery HPLC kolony jsou 3 generací SUPELCO HPLC kolon Zahrnují následující typy kolon: C18, HS C18, C8, Cyano, PEG, HS F5 Discovery BIO Wide Pore Discovery Zr Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí. 68

69 Klasifikace podle možné chemické interakce a Bonded Phase Hydrophobic H-Bonding Dipolar π-π Steric b Ionic b C18 Very Strong Weak No No No Moderate C8 Strong Weak No No No Weak RP- Amide Strong Strong Acceptor Moderate No Weak Very weak Phenyl Strong Weak Acceptor Weak Strong Donor Strong (Rigid) Weak F5 or PFP Moderate Moderate Acceptor Strong Strong Acceptor Strong (Rigid) Moderate Cyano Light to Moderate Weak Acceptor Strong Weak No Moderate a. Using Euerby 2 variation of Snyder-Dolan-Carr Hydrophobic Subtraction Model 3. b. Steric and Ionic probe data are not very helpful in predicting or interpreting steroid selectivity results; however, they are always underlying factors with silica bonded phases. 69

70 Discovery BIO Wide Pore dokonale sférické, porézníčástice velikost částic 3, 5, 10 µm velikost pórů 300Å specifický povrch 100 m 2 /g velikost porů je vhodná pro HPLC analýzy proteinů, polypeptidů a oligonucleotidů Vynikající pro analýzy hydrofobních molekul (MH > 500 Dalton) pro oblast proteomiky jsou v nabídce kolony křemenné kapiláry mikrobore kolony 70

71 Discovery BIO Wide Pore Discovery BIO C18 fáze je vhodná pro analýzu peptidů RP fáze s největší hydrofobicitou Discovery BIO C8 středně hydrofobní fáze není používaná tak běžně jako C18 a C4 Discovery BIO C5 doporučovaná pro analýzu proteinů a peptidů separační vlastnosti podobné jako u C4 ve srovnání s C4 má vyšší stabilitu vynikající pro LC/MS analýzy - nekrvácí 71

72 Discovery BIO PolyMA ionexy na bázi polymethakrylátových pryskyřic.hydrofilní povrch eliminuje adsorpci proteinů Discovery BIO Poly-SCX je silný katex s chemicky vázanou sulfopropylovou skupinou Discovery BIO Poly-WAX je slabý anex s chemicky vázanou diethylaminoethyl skupinou Polymethakrylát, 5µm, 1000Å Iontově výměnná kapacita (oba): 0,3meq/g 72

73 Discovery Zr výhodou nosiče na bázi ZrO 2 je chemická a tepelná stabilita kolony jsou stabilní v celém rozsahu ph 1-14 a při teplotách do 200 C retenční mechanismus je odlišný od silikagelových kolon (Lewisova teorie kyselin a zásad) kolony jsou mechanicky stabilní a vysoce účinné dodávají se čtyři typy fází 73

74 C C C C C C C C C C Fáze Discovery Zr Zr-PBD Zr-PS Zr-Carbon Zr-CarbonC18 C C C C C C C C C C C C 74

75 Fyzikálně chemické vlastnosti oxidu zirkoničitého Atomy Zr ve strukturní mřížce mají charkter Lewisových kyselin. #1 Zr atomy se chovají vlivem přítomnosti prázdných elektonových orbitalů jako Lewisovy kyseliny (akceptor elektronového páru). -O O P O- #2 Lewisovy báze (např. fosforečnany) z mobilní fáze interagují s povrchem stacionární fáze. NH 2 +. O-. R O O Zr O O Zr O O #3 Kladně nabité skupiny, přítomné v molekulách analytů jsou zachycovány na povrchu sorbentu na základě iontově výměnných interakcí. 75

76 Přehled chirálních stacionárních fází pro HPLC 76

77 Hamilton 77

78 HPLC kolony vhodné pro separaci cukrů SUPELCOGEL Ca SUPELCOGEL C-610H SUPELCOGEL C-611 SUPELCOGEL Ag2 SUPELCOSIL LC-NH2 aphera NH2 column: aphera NH2, 15 cm 4.6 mm I.D., 5 µm mobile phase: 20:80, water:acetonitrile flow rate: 1.0 ml/min temp.: 25 C detector: ELSD, 45 C, 3.5 psi nitrogen injection: 10 µl sample: 500 µg/ml in 30:70, water: acetonitrile 78

79 Tosoh Corp. 79

80 Co je HILIC? Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC. Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr. 499 (1990) 177) Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a mobilní fáze relativně nepolární. Mobilní fáze je složena z 60-95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru. Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla Typické složení 70-90% acetonitrilu v 10 mm octanu amonném Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC. Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH), které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem. Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá. Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až po čistě organickou. (.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): ). 80

81 Ascentis Si NP separace v tucích rozpustných vitamínů alpha tocopherol (100 µg/ml) (E) 2. menadione (150 µg/ml) (K3) 3. gamma tocopherol (200 µg/ml) (E) 4. chlolecalciferol (100 µg/ml) (D) Time (min) column: Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µ particles ( U) mobile phase: A Hexane, B Ethylacetate gradient: time %B flow rate: 1.0 ml/min. temp.: 30 C det.: UV at 290 nm 81

82 Rychlé HPLC analýzy 82

83 Chromatografický trojúhelník 1 α 1 k' R S = N 4 α 1+ k' Účinnost Selektivita Retence Rychlost t r = L u (k +1) t r = retenčníčas L = délka kolony k = retentenční factor u = rychlost průtoku mobilní fáze Selektivita Účinnost 83

84 Rozlišení Účinnost R S = N 4 Retence k k +1.. Selectivita α-1 α Faktor účinnosti a) Rychlost toku MF b) Délka kolony c) Průměr zrna, teplota, viskozita Faktor kapacity a) Množství stacionární fáze v koloně b) Změna stacionární fáze nebo MF c) Teplota Faktor selektivity a) Změna stacionární fáze b) Změna MF c) Rychlost toku MF Rozlišení (R) α N Zhao, J.H. and P.W. Carr. Analytical Chemistry, (14): p k α N k 84

85 Zkrácení doby analýzy t r = L u (k +1) tr = retenční čas L = délka kolony k = retentenční factor u = rychlost průtoku mobilní fáze Existují tři způsoby zkrácení retenčního času (t r ) daného analytu: Zkrácení délky kolony (L) Zmenšení hodnoty retenčního factoru (k ), a to: Změnou stacionární fáze Zvýšením teploty Zvýšení průtoku mobilní fáze 85

86 Možnosti zrychlení separací Zmenšit rozměry kolony Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze Zvýšit teplotu mobilní fáze Změnit profil gradientu Zmenšit velikostčástic HPLC nosiče 86

88 Vliv zkrácení kolony Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital Columns: Discovery C18, 5µm particles Mobile Phase: CH 3 OH:H 2 O (45:55) Flow Rate: 1mL/min Temp.: 20 C Det.: UV, 214nm cm x 4.6mm ID cm x 4.6mm ID Time (min) 15cm x 4.6mm ID 25cm x 4.6mm ID

89 Vliv zkrácení kolony Columns: Discovery C18, 5µm Mobile Phase: CH 3 OH:H 2 O (45:55) Flow Rate: 1mL/min Temp.: 20 C Det.: UV, 214nm Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital cm x 4.6mm ID Time (min) 25cm x 4.6mm ID 89

91 Vliv průtokové rychlosti 1 1. Barbital 2. Phenobarbital 3. Butabarbital 4. Mephobarbital 5. Pentabarbital 6. Secobarbital Columns: Discovery C18 column, 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: CH 3 OH:H 2 O (45:55) Flow Rate: see figure Temp.: 25 C Det.: UV, 214nm mL/min mL/min Time (min) 2mL/min 1mL/min 91

92 Účinnost kolony při různých průtokových rychlostech (porézníčástice sorbentu) Flow Rate 1.0mL/min 2.0mL/min 3.0mL/min 4.0mL/min N (Barbital) N (Phenobarbital) N (Butabarbital) N (Mephobarbital) N (Pentobarbital) N (Secobarbital)

94 Vliv teploty 1. Clonazepam 2. Chlorazepate 3. Diazepam Column: Discovery RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Mobile Phase: ACN:H 2 O (30:70) Flow Rate: 2.0mL/min Temp.: see figure Det.: UV, 254nm C C C Time (min) 50 C

96 Profil gradientu Column: Discovery RP-Amide 5.0cm x 4.6mm, 5µm particles Flow Rate: 1mL/min Temp.: 30 C Det.: UV, 220nm Elution: 10:90 ACN, 0.1%TFA: H 2 O, 0.1%TFA gradient to 90:10 ACN, 0.1%TFA:H 2 O,0.1%TFA hydroxy-7-azabenzotriazole 2. 4-methoxybenzene sulfonamide 3. Methyl-3-amino-2-thiophene-carboxylate 4. 4-aminobenzophenone %/min gradient 16%/min gradient Time (min) 10%/min gradient 6.67%/min gradient

99 Účinnost versus velikostčástic Columns: All C18, All 150 x 4.6mm Flow: 1.8mL/min Detection: 254nm Temp: 30 C Injection Vol: 5µL Analytes: 1. o-xylene (0.04mg/mL 2. p-xylene (0.01mg/mL N ave = 36, N ave = 18, N ave = 12, sub-2µm N ave = 6, µm 5µm 20 10µm

100 Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace HETP (µm) 16, Pressure (psi) 16,000 14,000 12,000 10,000 8,000 6, ml/min UHPLC 1.7 µm ,000 3 µm , Mobile Phase Velocity (mm/sec) Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 100

101 Povrchově porézníčástice versus zcela porézníčástice: 0.5 µ Difuzní vrstva 0.75 µ 2.7 µm 1.7 µm Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp. 101

102 Ascentis Express Fused-Core tm specifikace Sorbent: vysoce čistý silikagel 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B Velikost částic: 2.7 µ Distribuce velikosti částic: 2.7 +/ µ (6% standardní odchylka*) Velikost pórů: 90 Å, 160 Å Velikost povrchu: 150 m²/g ( m²/g efektivní) ph rozsah: 2 9 (minimálně) Limitní tlak: 600 barů (testováno na UHPLC) Nabídka stacionárních fází C18, peptide ES C18, C8, F5 (RP nebo HILIC), RP-Amide,Phenyl-Hexyl, HILIC (NP nebo HILIC), ES-CN LC-MS: vysoce kompatibilní * Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka. 102

103 Ascentis Express Fused-Core tm specifikace Ascentis Express Sterically Protected ph range endcapping Pore size Angstroms Particle size microns C18 No 2-9 Yes C8 No 2-9 Yes RP-Amide No 2-9 Yes Phenyl-Hexyl HILIC No No 2-9 Live area for full-page graphic 2-8 Yes No Peptide ES-C18 Yes 1-8 No F5 No 2-8 Yes ES-Cyano Yes 1-8 Yes

104 Předkolony malý mrtvý objem vhodné pro všechny přístroje kompatibilní s vysokým tlakem 104

105 Distribucečástic 105

106 Výhody silikagelových častic s pevným jádrem 106

107 Výhody silikagelovýchčástic s pevným jádrem 107

108 Zpětný tlak & účinnost a velikostčastic Effiiciency 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 N 1 d p bar 5, d p (µm) P 1 2 d p Particle (µm) psi bar N 27,500 20,000 16,500 10,000 5,000 3,750 2,

109 Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace 16, ,000 14, µm HETP (µm) Pressure (psi) 12,000 10,000 8,000 6, ml/min 2.7 µm FC ,000 3 µm µm Ascentis Express 2, Mobile Phase Velocity (mm/sec) Mobile Phase Velocity (mm/sec) *4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water 109

110 Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech Zpětný tlak versus průtoková rychlost Maximální limit Pressure drop (bar) Limit tradičních HPLC systemů N = >30, Flow rate (ml/min) Experimentáln lní zavislost celkového zpětn tného tlaku jako funkce průtokov tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm, 2.7 m Ascentis Express kolony při různých teplotách ch.. MF: 30:70 voda:acetonitril Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina 110

111 Převod metod 111

112 Rychlejší, účinnější a levnější analýza *původní metoda je na koloně 4.6 x 250 mm, 5µ 4.6 x 50 mm, 2.7 µ 1 ml/min 2 µl inj N(5) = Rs = 1.8 6,9 MPa 8x úspora rozpouštědel Column: Ascentis Express C18 Mobile Phase: 64:36, water : acetonitrile Temp: 35 C Det: 250 nm 3 x 50 mm, 2.7 µ 0.43 ml/min 0.9 µl inj N(5) = Rs = 1.8 6,6 MPa 19x úspora rozpouštědel Sample 1. Oxazepam 2. Alprazolam 3. Clonazepam 4. N-desmethyldiazepam 5. Diazepam 2.1 x 50 mm, 2.7 µ 0.21 ml/min 0.4 µl inj N(5) = 8360 Rs = 1.6 6,5 MPa 38x úspora rozpouštědel Time (min) 112

113 Vliv zkrácení a zmenšení průměru kolony na úsporu rozpouštědel Kolona µ ID (mm) L (mm) Rs Průtok (ml/min) Doba analýzy (min) ml/ nástřik Úspora Ascentis C x Ascentis Express C x Ascentis Express C x Ascentis Express C x Ascentis Express C x Ascentis Express C x Ascentis Express C x 113

114 Ascentis Express Fused Core HPLC kolony s vysokou účinnosti a možnosti rychlé chromatografie jak na běžných systémech tak na systémech UHPLC. Krátká difúzní dráha analytu v povrchově porézníchčásticích - užší a vyšší píky než lze dosáhnout na porézníchčásticích větší citlivost, vyšší účinnost. Tvar Deemterovy křivky ukazuje na možnosti měření při vyšších průtokových rychlostech s vysokou účinností. Zpětný tlak na kolonách s povrchově porézním sorbentem je nižší něž na kolonách s poréznímičasticemi sub-2µ odpovídá přibližně 3 µ sorbentům. 114

115 USP aplikace column: as listed mobile phase: * Phosphate buffer flow rate: 1.5 ml/min temp.: 30 C det.: UV at 215 nm H 3 C NH phase injection: 5 µl sample: 50 µg/ml in mobile CH 3 CH 3 O H 3 C OH *Phosphate buffer Combine 500 ml of potassium phosphate monobasic 500 mg/l in water and 500 ml of acetonitrile Adjust to ph 3.3 with phosphoric acid H 3 C Ibuprofen OH Pseudoephedrine 115

116 Ibuprofen /Pseudoefedrin Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm Time (min) Time (min) phase length void rt (pseu) rt (ibu) resolution plates (ibu) k (ibu) plates/m (ibu) Ascentis Express ES-Cyano Discovery Cyano Ascentis Express C Ascentis ES-Cyano Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Time (min) Time (min) 116

117 USP aplikace column: as listed mobile phase: 30:40:30, 20 mm sodium acetate (ph 4):methanol:acetonitrile flow rate: 1.5 ml/min temp.: 30 C det.: UV at 210 nm injection: 5 µl sample: 50 µg/ml in mobile phase H 3 C H N O O OH NH CH 3 Ritalin Methylphenidate OH Phenylephrine 117

118 Ritalin /Fenylefrin phase length void rt (phen) rt (ritalin) resolution plates (ritalin) k (ritalin) plates/m (ritalin) Ascentis Express ES-Cyano Discovery Cyano Ascentis Express C Ascentis ES-Cyano Ascentis Express ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Ascentis ES-Cyano 10 cm x 4.6 mm, 3 µm Time (min) Time (min) Discovery Cyano 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm Time (min) Time (min) 118

119 Problém s nečistotami v mobilní fázi Nečistoty, které na HPLC nejsou detegovatelné mohou být problém na UHPLC 119

120 LC-MS Ultra CHROMASOLV Rozpouštěla a aditiva do MF Brand Product Name Description Pack size Fluka Acetonitrile LC-MS Ultra CHROMASOLV, 99.9%, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka Methanol LC-MS Ultra CHROMASOLV, 99.9%, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka Water LC-MS Ultra CHROMASOLV, tested for UHPLC-MS 1L, 2L Fluka Trifluoroacetic acid LC-MS Ultra eluent additive, 99.0% suitable for UHPLC-MS 1ML, 2ML Fluka Formic acid LC-MS Ultra eluent additive, 98% suitable for UHPLC-MS 1ML, 2ML Fluka Ammonium formate LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS 25G Fluka Ammonium acetate LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS 25G 120

121 LC-MS Ultra CHROMASOLV Rozpouštědla se testují na UHPLC Gradient UHPLC-UV, shodné vlastnosti mezi výrobními šaržemi Nízké pozadí a minimum nečistot jako jsou ftaláty a PEG. Testováno na UHPLC-MS TOF Testování v obou polaritách Obaly Bílé borosilikátové sklo Minimální výluh alkalických iontů 121

122 Identifikace nečistot v ESI + Intens. x LCMS Ultra UVMSpos_RD1_07_3218.d: BPC All MS, -Constant Bkgrnd New LC-MS ultra grade Intens. x104 Gradient Grade BASF pos_rd1_03_3255.d: BPC All MS, -Constant Bkgrnd High quality gradient grade Time [min] Nežádoucí nečistoty v rozpouštědlech (plastifikátory, PEGy). 122

123 LC-MS Ultra CHROMASOLV ESI + ESI - MS test v ESI + a ESI - ; 5ppb reserpinu a 20 ppb digoxinu; velmi nízký šum. 123

124 Borosilikátové skleněné láhve Intens. 800 LCMS Ultra UVMSneg_RD1_01_3235.d: -MS, min #( ), -Constant Bkgrnd LC MS Ultra (v borosilikátové láhvi) Chrom Gradient Grade UVMSneg_RD1_04_3232.d: -MS, min #( ), -Constant Bkgrnd Klastry mravenčanu sodného Gradient grade quality (v hnědé skleněné láhvi) m/z 124

125 C18 C8 HILIC (Si) RP-Amide Phenyl-Hexyl Peptide ES C18 F5 ES-CN Děkuji za pozornost 125