Návod k použití HISTO TYPE SSP Kits Low resolution

Transkript

1 Návod k použití HISTO TYPE SSP Kits Low resolution 0123 Testovací soupravy pro tkáňovou typizaci HLA alel (třída I. HLA-A, B, C, třída II. HLA-DR, DQ) na molekulárně genetickém základě IVD 20 typizací prealiquotováno a připraveno k použití KATALOGOVÉ NÁZEV BAREVNÉ OZNAČENÍ ČÍSLO HISTO TYPE A low ČERVENÁ HISTO TYPE B low BÍLÁ HISTO TYPE C low ŽLUTÁ HISTO TYPE DR low PURPUROVÁ HISTO TYPE DQB low BÍLÁ 7098 HISTO TYPE ABDR BÍLÁ 7102 HISTO TYPE ABC MODRÁ 7103 HISTO TYPE DR/DQB BÍLÁ HISTO TYPE DQB high MODRÁ HISTO TYPE DQB1*03 PURPUROVÁ OBSAH 1. Popis výrobku 2 2. Materiál obsah souprav HISTO TYPE/DNA-SSP další potřebné vybavení a reagencie skladování a stabilita 3 3. Výkonnost testu 4 4. Provedení testu bezpečnost práce a speciální poznámky izolace DNA amplifikace gelová elektroforéza dokumentace a interpretace výsledků 8 5. Varování a bezpečnostní opatření 9 6. Řešení problémů Literatura Použití in-vitro symbolů (IVD) 12 Verze: 09/2013 1

2 1. Popis výrobku Díky metodám PCR (polymerázová řetězová reakce) bylo dosaženo v diagnostice HLA v poslední době značného pokroku. Sekvenování HLA alel (1) umožnilo jasnou typizaci s vysokým rozlišením na úrovni DNA a má mnoho výhod oproti klasickým sérologickým metodám. Základním materiálem pro práci s HISTO TYPE/ DNA-SSP soupravami je purifikovaná DNA. Při práci s těmito soupravami je využito SSP (Sequence Specific Primers) PCR. (viz. obr. 1) (2,3) Metoda je založena na poznatku, že prodlužování primerů, a tím i úspěšná PCR je závislé na přesné shodě 3' konců obou primerů s templátovou DNA. A tedy pouze přesné usazení obou primerů na cílovou sekvenci vede k získání produktu, který je pak identifikován při gelové elektroforéze. obr. 1 Princip SSP-PCR Perfect match (specific Allel) Amplification Mismatch no Amplification (unspecific Allel) dokonalé dosednutí primeru namnožení specifického produktu nedokonalé nasednutí primeru amplifikace (namnožení) neproběhne Složení jednotlivých směsí primerů umožňuje jasnou HLA typizaci pomocí vyhodnocovacích diagramů a tabulek. Každá typizace je prováděna pomocí určitého množství (např. 24 nebo 96) prealiquotovaných a vysušených reakčních směsí. Směsi obsahují i vnitřní amplifikační kontrolu a celkový objem reakce je 10μl. 2

3 2. Materiál 2.1 obsah souprav HISTO TYPE SSP kits 20 destiček HISTO TYPE je dostatečných pro 20 HLA typizací. Předkapané, prealiquotované reakční směsi obsahují specifické primery, vnitřní kontrolu (specifická pro lidský gen G3PDH) a směs nukleotidů. První reakční směs je označená šipkou (podívejte se na schéma na str. 6). U některých ze souprav HISTO TYPE je na poslední pozici kontaminační kontrola (nahlédněte do pracovního listu a vyhodnocovacího diagramu pro danou soupravu). Číslo šarže je vytištěno na každém stripu/destičce. 24 PCR reakčních směsí pro kontaminační kontrolu (pokud souprava obsahuje kontaminační kontrolu na poslední pozici (viz výše), není přikládána samostatně). 10xPCR pufr v množství dostatečném pro 20 typizací. Víčka ke stripům nebo folie v množství dostatečném pro 20 typizací. Návod k použití, tabulka specifit, vyhodnocovací diagramy a pracovní listy. 2.2 další potřebné vybavení a reagencie Taq Polymeráza (5U/μl), (např. HISTO TAQ, kat.č ) (Nepoužívat Hot-start Taq Polymerázu!) BAG EXTRA GENE (doporučujeme) pro extrakci DNA z krve / lymfocytů / leukocytů. Nebo jiná souprava na DNA izolaci. pipety (0,5 250 μl) sterilní špičky s integrovaným filtrem DNA cyklér (např. PTC 200 s vyhřívaným víkem, MJ Research/BioRad); podívejte se na seznam schválených cyklérů na str. 6 Vybavení pro gelovou elektroforézu o agaróza pro separaci DNA o 0,5xTBE pufr (45 mm Tris, 45 mm kyselina boritá, 0,5 mm EDTA) o ethidium bromid (EtBr) o jednotka na gelovou elektroforézu DNA o zdroj napětí ( V, 20mA) o DNA délkový standard (kat. č. 7097) Vybavení pro interpretaci a dokumentaci výsledků o zdroj UV záření ( nm) o fotografický přístroj (např. Polaroid) s filmem (např. Polaroid typ 667) nebo video systém s termálním papírem (např. typ KP65HM-CE) o případně počítač s vyhodnocovacím softwarem HISTO MATCH (BAG Health Care) nebo SCORE 2.3 skladování a stabilita Soupravy jsou dodávány nezmrazené. Veškeré reagencie skladujte v temnu při -20 C až -80 C. Datum expirace je uvedeno na každé reagencii a platí i po prvním otevření. Datum expirace uvedené na obalu soupravy odpovídá reagencii s nejkratší dobou trvanlivosti. 10xPCR pufr nechte krátce před použitím zcela rozmrazit. 3

4 3. Výkonnost testu Uspořádání směsí primerů zaručuje spolehlivou identifikaci HLA-typů (na základě nejnovějších sekvenčních dat) podle evaluačních diagramů. Aktualizace dat bude probíhat pravidelně. Přesnost a reprodukovatelnost specifity každé směsi primerů byla verifikována pro každou šarži pomocí referenčních vzorků se známými HLA antigeny. Alely, které nejsou zahrnuty a/nebo z důvodů jejich vzácného výskytu netestovány, jsou vyznačeny ve vyhodnocovacích diagramech a tabulkách specifit. Studie výkonnosti testu byly prováděny s každou soupravou HISTO TYPE SSP s alespoň 50ti vzorky. Srovnání s výsledky SSP testů jiného výrobce neukázalo žádné rozdíly. Hodnocení a kontrola kvality směsí byly provedeny pomocí DNA vzorků, které byly extrahovány soupravami Extra Gene I nebo Qiagen. Pro testování byla použita polymeráza HISTO TAQ (kat. č ) nebo Taq Polymeráza od firmy Qiagen. Hodnověrné výsledky jsou zaručeny při obsahu DNA ng na reakční směs. 4

5 4. Provedení testu 4.1 bezpečnost práce a speciální poznámky PCR je obzvláště citlivá metoda a měla by být prováděna dobře zacvičenými pracovníky se zkušenostmi v molekulárně-biologické práci i testování histokompatibility. Dodržováním transplantačních směrnic a standardů EFI minimalizujete nebezpečí chybných typizací, obzvláště při neshodě sérologických a molekulárně-biologických výsledků. K zabránění kontaminaci a tím i chybným výsledkům je třeba dodržovat následující: Při práci používejte rukavice (pokud možno bez pudru). Pro každé pipetování berte novou špičku (s integrovaným filtrem). Vyhraďte oddělená pracovní místa pro pre-amplifikační (izolace DNA, příprava reakcí) a post-amplifikační (elektroforéza, dokumentace) část testu. Kde je to možné, používejte oddělené místnosti. Používejte přístroje a nástroje pouze pro jednotlivé části testu a nevyměňujte je. 4.2 izolace DNA Pro HLA-SSP typizaci jednoho pacienta je potřeba cca 5-10μg DNA (tj. cca 0,5 ml krve). Souprava BAG EXTRA-GENE je nejvhodnějším nástrojem k izolaci, neboť čistá DNA je získána z plné krve v krátkém čase bez použití toxických chemikálií a rozpouštědel. K získání DNA potřebné kvality jsou dále využitelné také komerční izolace jako kolonková nebo pomocí např. magnetických částic nebo jiné metody popsané v literatuře (5) jako je metoda využívající chloroform-triethyl-ammoniumbromid (CTAB) nebo fenol-chloroformová purifikace. Přítomnost heparinu ve vzorku může blokovat PCR (6). Proto je pro typizaci vhodným materiálem EDTA nebo citrátová krev. DNA by měla mít index čistoty (poměr extinkcí OD 260 /OD 280 ) mezi 1,5 2, amplifikace Veškeré prealiquotované a vysušené reakční směsi obsahují primery specifické pro danou alelu, stejně jako kontrolní primery a nukleotidy. Dodávány jsou vysušené na dně reakční zkumavky. Amplifikační parametry jsou nastaveny na celkový objem reakce 10 μl. 1. Vyjměte odpovídající počet HISTO TYPE HLA-SSP destiček z -20 C a nechte rozmrazit 10xPCR pufr. 2. Napipetujte MASTERMIX a dobře ho promíchejte 10xPCR pufr roztok DNA Taq-polymeráza čistá destilovaná voda Veškeré HISTO TYPE / DNA SSP soupravy pracují se stejným MASTERMIXEM a ten tedy může být používán se všemi soupravami. Složení MASTERMIXU závisí na počtu reakčních směsí tak, jak je uvedeno v tabulce 1 (str.6). V případě, že má být prováděna kontaminační kontrola, připravte MASTERMIX bez DNA a napipetujte 10μl této směsi do kontaminační kontroly (značeno červeně). Po té přidejte DNA a rozdělte MASTERMIX do jednotlivých reakčních zkumavek. 5

6 Tabulka 1: Složení MASTERMIXU v závislosti na počtu reakčních směsí. počet směsí destil. H xPCR pufr Roztok DNA (25-40 ng/μl) Taqpolymeráza (5U / μl) celkový objem ,08 10 μl ,6 80 μl ,8 100 μl ,2 280 μl ,7 340 μl ,9 360 μl ,2 520 μl ,6 580 μl ,8 600 μl ,2 780 μl ,9 860 μl , μl Množství DNA by mělo být 50-80ng na 1 reakční směs (mix) pro jiné koncentrace DNA je třeba změnit objem DNA roztoku a H 2 0. (např. pro 24 reakčních směsí: 28,0 μl DNA roztoku (50 ng/μl) a 222 μl dest.h 2 0) 3. Po smíchání na Vortexu přidejte okamžitě 10μl této směsi do předkapaných reakčních směsí. Vyměňujte špičku po každém pipetování. Pevně uzavřete mikrozkumavky víčky. Nedotýkejte se vnitřní strany víček, ani horních okrajů mikrozkumavek prsty, abyste omezili kontaminaci na minimum. U cyklérů s těsně uzavíratelnými víčky lze použít i PCR desky. Lehce sklepněte destičkou dolů, tak aby se MASTERMIX dostal ke zbytku reagencií na dně mikrozkumavky a rozpustil modrý pelet. Veškeré PCR reagencie by měly být na dně. 4. Vložte reakční mikrozkumavky do cykléru a upevněte těsně víko, aby se mikrozkumavky v průběhu PCR neotevřely. Nastavte a spusťte PCR program. Překrytí minerálním olejem není u cyklérů s vyhřívaným víkem potřeba. 6

7 Schválené typy cyklérů: krok programu teplota čas počet cyklů první denaturace 96 C 5 min. 1 denaturace 96 C 20 sec. 5 annealing + extenze 68 C 1min. denaturace annealing extenze 96 C 64 C 72 C 20 sec. 50 sec sec. denaturace annealing extenze 96 C 61 C 72 C 20 sec. 50 sec sec. závěrečná extenze 72 C 5 min. 1 PTC 100 / 200 / C1000 (MJ Reserch / BioRad) GeneAmp PCR-System 9600 / 9700 (použijte faktor ohřevu 9600) (ABI) Mastercycler epgradient S (použijte funkci simulate Mastercycler gradient ) (Eppendorf) Tprofessional (Biometra) Při použití cyklérů umožňujících velmi rychlé ohřívání a chlazení doporučujeme nastavit pomalejší ohřívání a chlazení. Vzhledem k faktu, že cykléry od různých výrobců se liší svými parametry reakce a někdy i jednotlivé přístroje jednoho typu mohou být různě kalibrovány, může být někdy nutné, v případě používání jiného typu cykléru optimalizovat amplifikační parametry nebo validovat cyklér uživatelem. K optimalizaci vašeho přístroje postupujte následujícím způsobem: Při falešně pozitivních výsledcích (nespecifické proužky, nadbytečné typy): zvyšujte teplotu annealingu v 1 C krocích. Při falešně negativních výsledcích (absence proužků): snižujte teplotu annealingu v 1 C krocích a/nebo zvyšujte dobu trvání annealingu v 5ti vteřinových krocích a/nebo zvyšujte dobu trvání denaturace v 5ti vteřinových krocích. Doporučujeme používat pouze pravidelně kalibrované cykléry. Pro kalibraci je velmi vhodný BAG-CyclerCheck (kat.č. 7104). Testy kontroly kvality byly prováděny na cyklérech PTC-200 resp. C1000 (MJ Research/BioRad), 9700 (ABI), Mastercycler epgradient S (Eppendorf) a Tprofessional (Biometra). 7

8 4.4 gelová elektroforéza Separace amplifikačních produktů se provádí pomocí gelové elektroforézy na horizontální agarózovém gelu. Doporučeným pufrem pro elektroforézu je 0,5 x TBE (45 mm tris, 45 mm kyselina boritá, 0,5 mm EDTA). Koncentrace gelu by měla být 2,0-2,5% agarózy. Před vnesením vzorků nechte gel polymerizovat alespoň 30 minut. Po ukončení amplifikace vyjměte vzorky z cykléru a vneste celý reakční objem vzorku opatrně do odpovídající jamky v gelu. Dále přidejte 10 μl DNA délkového standardu, tak aby bylo možno odečíst délku produktů amplifikace. Elektroforetická separace se provádí při V/cm (např. při 20cm vzdálenosti elektrod přibližně V) po dobu minut. Po ukončení běhu obarvěte celý gel v roztoku ethidiumbromidu (EtBr) (např. 0,5 μg/ml EtBr ve vodě nebo TBE pufru) po dobu minut. Jinou možností je přidat EtBr (0,5 μg/ml) do elektroforetického pufru nebo přímo do gelu. Pokud je to potřeba, lze odstranit přebytečný EtBr z gelu máčením ve vodě nebo 0,5xTBE po dobu minut. 4.5 dokumentace a interpretace výsledků K zobrazení výsledků prosviťte gel UV transluminátorem (λ= nm) a vyfotografujte výsledek vhodným fotografickým přístrojem. Ideálním je digitální fotografie, ale lze použít i klasický fotoaparát nebo systém Polaroid (film 667) nebo video systém s termálním papírem (např. typ KP65HM-CE). Nastavte čas a expozici tak, aby jednotlivé proužky byly vykresleny ostře a stály jasně proti tmavému pozadí (např. clona 11, expoziční čas 1s). Pro interpretaci výsledků použijte odpovídající vyhodnocovací diagram, nebo tabulku specificit (přiloženy samostatně). Pouze proužky s odpovídající délkou fragmentu (měřeno dle DNA délkového standardu) jsou považovány za pozitivní. Správné délky jsou uvedeny v tabulkách a vyhodnocovacích diagramech. V každé pozici musí být při nepřítomnosti specifického proužku přítomna 1070 bp dlouhá vnitřní kontrola. Ve většině případů je proužek vnitřní kontroly tato v přítomnosti specifického proužku slabý, nebo zcela chybí! Pro interpretaci špatných výsledků nahlédněte do kapitoly 6 - Řešení problémů. V kontaminační kontrole by neměl být patrný žádný proužek. Pokud došlo ke kontaminaci genomickou DNA, bude přítomen proužek o délce 282 bp. Další proužky se mohou vyskytovat v pozicích 78 bp, 104 bp, 176 bp a 580 bp. V případě kontaminace amplifikáty budou patrny proužky o délce 78 bp a/nebo 104 bp a/nebo 176 bp a/nebo 282 bp a/nebo 580 bp. Vyhodnocení může být provedeno s HISTO MATCH (Bag Health Care) nebo softwarem SCORE. 8

9 5. Varování a bezpečnostní opatření Ethidiumbromid je silný mutagen. Při práci s gely nebo roztoky obsahujícími EtBr používejte rukavice. Postupujte podle návodu a bezpečnostních instrukcí výrobce. Transluminátor vyzařuje velmi krátkovlnné UV záření, které může spálit kůži a sítnici, Používejte ochranný UV obličejový štít nebo masku! Veškerý materiál použitý pro extrakci DNA, tj. krev, tkáně atd. je třeba považovat za potenciálně infekční. Při práci s biologickým materiálem dodržujte standardní bezpečnostní opatření (nepipetujte ústy, používejte jednorázové rukavice, dezinfikujte ruce po ukončení práce). Veškerý biologický materiál musí být po práci inaktivován (např. autoklávováním). Stejně tak i veškeré jednorázové pomůcky. Rozlitý potenciálně infekční materiál musí být odstraněn okamžitě a kontaminovaná místa očištěna standardním dezinfekčním prostředkem nebo 70% alkoholem. Materiál použitý k čištění včetně rukavic je třeba inaktivovat před likvidací, (např. sterilizací v autoklávu). 9

10 6. Řešení problémů Problém Možný důvod Řešení žádná amplifikace, délkový standard viditelný DNA kontaminovaná ihibitory PCR opakujte izolaci DNA, použijte jinou metodu koncentrace DNA je příliš vysoká/nízká změňte koncentraci DNA, opakujte izolaci DNA chybí enzym nebo je jeho koncentrace příliš nízká opakujte PCR, změňte koncentraci enzymu DNA z heparinizované krve opakujte práci s EDTA, nebo citrátovou krví špatné amplifikační parametry optimalizujte amplifikační parametry (viz 4.3) * opakované chyby v jednotlivých reakčních liniích (chybí amplifikační netěsnící reakční mikrozkumavky, ztráta vody a změny koncentrace uzavírejte mikrozkumavky těsně, použijte jiné mikrozkumavky kontrola) v průběhu PCR nespecifické amplifikační produkty, nadbytečné kontaminace produkty amplifikace opakujte test, zajistěte přesnou práci proužky (žádné proužky špatné proužky nesmí být DNA kontaminována solemi opakujte izolaci DNA, použijte jinou metodu přítomny) příliš vysoká koncentrace použijte méně DNA DNA příliš vysoká koncentrace použijte méně enzymu enzymu špatné parametry optimalizujte amplifikační při interpretaci výsledky ukazují na víc než dvě specifity žádné, nebo pouze slabé proužky, délkový standard není vidět pozadí gelu svítí příliš silně rozmazané proužky amplifikace kontaminace přenosem amplifikačních produktů nová alela slabé barvení EtBr příliš dlouhá doba barvení, příliš vysoká koncentrace EtBr elektroforetický pufr je příliš horký nebo je spotřebovaný špatný elektroforetický pufr polymerizace Gelu není v pořádku parametry (viz. 4.3)* otestujte typizační směs bez přidání DNA zajistěte přesnou práci opakujte barvení máčejte gel ve vodě nebo v TBE snižte koncentraci EtBr snižte napětí použijte 0,5 x TBE pufr * Pokud používáte materiál a přístroje tak, jak je zde popsáno, je změna parametrů amplifikace až tím posledním řešením. Ve většině případů lze vyhodnotit test odstraněním nadbytečných proužků podle rozdílu v délkách fragmentů. 10

11 7. Literatura 1. Bodmer, J., Immunogenetics 37: Olerup, O., Zetterquist H., Tissue Antigens 39: Olerup, O., Zetterquist H., Tissue Antigens 41: Lu, Y.H. and Négre, S., Trends in Genetics 9: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory 6. Beutler, E. et al., BioTechniques 9: Bunce, M., Tissue Antigens 46:

12 8. Vysvětlení použitých symbolů teplota skladování použijte do s CONT HLA TYPING IFU IVD LOT PCRBUF 10x PCRCAP PCRFOIL PCRPLATE PCRSTRIP REACTIONMIX REF WORKSHEET viz návod k použití dostatečný pro n testy obsah, obsahovat určeno pro: HLA typizaci návod k použití pouze pro in-vitro použití číslo šarže PCR pufr, 10x koncentrovaný PCR víčko, uzávěr PCR fólie PCR desky PCR proužky reakční směsi katalogové číslo pracovní list Návod k použití v jiných jazycích viz BAG Health Care GmbH Na Hlínách 555/ Praha 8 Tel.: Fax: info@bag-healthcare.cz Auftragsannahme/Ordering: Customer Service: BAG Health Care GmbH Tel.: +49 (0) 6404 / Tel.: +49 (0) 6404 / Amtsgerichtsstraße 1-5 Tel.: +49 (0) 6404 / Fax: +49 (0) 6404 / Fax: +49 (0) 6404 / Lich / Germany Fax: +49 (0) 6404 / info@bag-healthcare.com verkauf@bag-healthcare.com service@bag-healthcare.com 12