Úloha vybraných podjednotek komplexu exocyst ve vývoji epidermis Arabidopsis

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra experimentální biologie rostlin Úloha vybraných podjednotek komplexu exocyst ve vývoji epidermis Arabidopsis Zdeňka Vojtíková Školitel: RNDr. Viktor Žárský, CSc. Diplomová práce Praha 2013

2 Tato diplomová práce byla vypracována v letech na Katedře experimentální biologie rostlin Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze pod vedením školitele RNDr. Viktora Žárského, CSc. a Mgr. Ivana Kulicha jako konzultanta. Prohlašuji, že jsem závěrečnou diplomovou práci vypracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu v Praze Zdeňka Vojtíková

3 Práce byla hrazena z grantového projektu GAČR č. P305/11/1629 a GAUK č Děkuji svému školiteli RNDr. Viktorovi Žárskému za odbornou pomoc, pochopení a za příležitost podílet se na zajímavých projektech v Laboratoři buněčné morfogeneze. A velmi srdečně děkuji Mgr. Ivanovi Kulichovi za spolupráci, přátelství a bezmeznou ochotu, se kterou se mi věnoval.

4 OBSAH SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ABSTRAKT ABSTRACT ÚVOD A CÍLE PRÁCE TEORETICKÝ ÚVOD Komplex exocyst Role exocystu v tvorbě buněčné stěny a recyklaci membránových proteinů Podjednotka EXO70 a její paralogy u rostlin Komplex TRAPPII a jeho podjednotka TRS Vliv UV záření na rostliny Funkce trichomů Trichomy Arabidopsis thaliana Morfogeneze buňky Trichom jako modelový systém Vývoj trichomu Kategorie trichomových mutantů Genová exprese v trichomu Arabidopsis thaliana Stádium zrání trichomu Mutace vedoucí k poruše zrání trichomu MATERIÁL A METODY Pěstování rostlin a bakterií Sterilní kultivace Arabidopsis thaliana Média Příprava kompetentních buněk Elektroporace bakterií Křížení Arabidopsis thaliana Práce s DNA Izolace genomické DNA Izolace plazmidové DNA Agarózová gelová elektroforéza Polymerázová řetězová reakce Genotypování RT-PCR Konstrukty Gateway klonování - LR reakce Restrikce DNA Ligace fragmentů DNA Sekvenování

5 Klonování konstruktů EXO70H4 v pubnyfp (UBQ::YFP-EXO70H4) EXO74H4 s přirozeným promotorem v pentr1a EXO70H4 s přirozeným promotorem v pmdc107 (EXO70H4::EXO70H4-GFP).. 30 TRS120 s přirozeným promotorem v pentr1a TRS120 s přirozeným promotorem v pmdc107 (TRS120::TRS120-GFP) TRS120 s přirozeným promotorem v pubc-rfp (TRS120::TRS120-RFP) Další použité konstrukty Transformace rostlin Tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana Stabilní transformace Arabidopsis thaliana Dvouhybridní kvasinkový systém Transformace kvasinek a screening Izolace DNA z kvasinek Testování proteinových interakcí dvouhybridním kvasinkovým systémem Mikroskopování Měření tloušťky buněčné stěny trichomů Výsledky Analýza inzerčních mutantů Arabidopsis v lokusu EXO70H4 pomocí RT-PCR Popis rostlin Arabidopsis s mutací v lokusu EXO70H Kvantifikace tloušťky buněčné stěny trichomů WT a mutantů exo70h Dvojití mutanti s dalšími podjednotkami EXO Vliv UV záření na vývoj trichomů WT a mutanta exo70h Buněčná lokalizace YFP-EXO70H Komplementace mutace exo70h Hledání potenciálních interaktorů EXO70H4 a jejich identifikace pomocí dvouhybridního screenu v kvasince Test interakce TRS120 s dalšími podjednotkami EXO Připravené experimenty pro další práci Diskuze Paralogy EXO70 ve vývoji trichomů Buněčná stěna při zrání trichomů Trichomy a UV stres Komplementace mutanta exo70h Interakce EXO70H4 s TRS Buněčná lokalizace EXO70H Závěr Použitá literatura

6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK Arabidopsis Arabidopsis thaliana AD Activation domain BD Binding domain CESA celulózosyntázový komplex COG Conserved oligomeric Golgi complex COP1 Coat Protein Complex I nebo CONSTITUTIVELY PHOTOMORFOGENIC1 ddh2o dvakrát destilovaná voda DNA deoxyribonukleová kyselina GARP Golgi associated retrograde protein complex GDSL Glycin, Kyselina asparagová, Serin, Leucin GFP Green fluorescent protein HOPS Homotypic fusion and vacuole protein sorting LB Lysogeny broth MPA Masopeptonový agar MPB Masopeptonový bujón MS Murashige-Skoog PCR Polymerase chain reaction SD synthetic defined SNARE Soluble NSF attachment protein receptor TIRF/VAEM Total internal reflection fluorescence/variable-angle epifluorescence microscopy TRAPP Transport protein particle RFP Red fluorescent protein RNA ribonukleová kyselina UV UV-B VAMP721 VESICLE-ASSOCIATED MEMBRANE PROTEIN 721 YEPD Yeast extract peptone dextrose YFP Yellow fluorescent protein

7 ABSTRAKT Exocyst je bílkovinný komplex, evolučně konzervovaný u kvasinek, živočichů i rostlin, který hraje roli v řízení buněčné morfogeneze a polarity. Jedná se o poutací komplex, jehož funkcí je navázat sekretorický váček na správné místo na plazmatické membráně. Komplex exocyst je tvořen osmi podjednotkami. Podjednotka EXO70 je v genomu Arabidopsis thaliana kódována 23 paralogními geny. Mutace v paralogní podjednotce EXO70H4 způsobuje defekt ve fázi zrání trichomů. Mutantní trichomy mají slabou, nezesílenou buněčnou stěnu, díky čemuž jsou trichomy měkké a ohebné. Transkripce genu EXO70H4 je indukována UV zářením a proto byla provedena také pozorování rostlin pěstovaných na UV-B záření. Analýza mutantů pěstovaných na UV-B záření odhalila v cytoplazmě hyperakumulaci váčků pozorovatelných světelným mikroskopem. U kontrolních rostlin pěstovaných na UV-B záření k hyperakumulaci váčků nedocházelo, ale bylo indukováno tloustnutí buněčné stěny, které dosud nebylo jako reakce na UV u trichomů nikde popsáno. Analýza buněčné lokalizace pomocí YFP značených konstruktů ukázala, že EXO70H4 lokalizuje do mobilních tělísek asociujících s Golgiho aparátem. Pomocí dvouhybridního kvasinkového systému bylo zjištěno, že EXO70H4 interaguje s TRS120, podjednotkou jiného poutacího komplexu TRAPPII aktivního na Golgiho aparátu. Dále bylo demonstrováno, že TRS120 interaguje také s podjednotkami EXO70B1, EXO70B2, ale neinteraguje s paralogem EXO70A1. Zjištěné výsledky naznačují, že EXO70H4 má významnou funkci v tloustnutí buněčné stěny trichomů ve fázi jejich zrání, a to také v odpovědi na UV-B stres a že tedy nějakým způsobem reguluje sekreci komponent buněčné stěny. Klíčová slova: buněčná morfogeneze, exocyst, exocytóza, epidermis, trichomy, UV, buněčná stěna, Arabidopsis thaliana

8 ABSTRACT Exocyst is protein complex evolutionary conserved in yeasts, animals and plants, which plays a role in control of cell morphogenesis and polarity. It is a tethering complex whose function is to attach secretory vesicles to specific foci on plasma membrane. Complex exocyst is formed by eight subunits. Subunit EXO70 is encoded by 23 paralogue genes in genome of Arabidopsis thaliana. Mutation in paralogue subunit EX070H4 causes defect in trichome maturation. Mutant trichomes have thin, not reinforced cell wall, making them soft and elastic. Transcription of EXO70H4 gene is induced by UV radiation, therefore observations of plants cultivated on UV-B radiation were done. Analysis of mutants cultivated on UV-B radiation revealed hyperaccumulation of vesicules in cytoplasm, which were visible by light microscope. Hyperaccumulation was not observed in control plants cultivated on UV-B radiation, but thickening of cell wall was induced. This reaction to UV in trichomes hasn t been described yet. Analysis of cellular localization made with YFP tagged constructs revealed that EXO70H4 localizes into mobile corpuscules associating with Golgi apparatus. It was found with yeast two hybrid system that EXO70H4 interacts with TRS120, subunit of tethering complex TRAPPII which is active in Golgi apparatus. Furthermore it was demonstrated that TRS120 interacts with subunits EXO70B1, EXO70B2, but does not interact with paralogue EXO70A1. These results imply that EXO70H4 has function in thickening of cell walls of trichomes in stage of their maturation and that also plays role in UV-B stress response. So it might somehow regulate secretion of cell wall components. Keywords: cell morphogenesis, exocyst, exocytosis, epidermis, trichomes, UV, cell wall, Arabidopsis thaliana

9 ÚVOD Epidermis rostlin lze chápat jako anténu a zároveň štít, pomocí kterých rostlina komunikuje, ale také čelí nástrahám svého prostředí. Vzhledem ke své přisedlosti, nemůže rostlina na stres odpovědět evolučně prověřenou strategií útěku, a tak si musela vyvinout obranný val s velmi vysokým stupněm odolnosti. Epidermální buňky musí rostlinu uchránit před invazí zákeřných hub a bakterií, před útoky nenasytných hmyzích býložravců a nekončícími abiotickými stresy. Variabilita poškození, které rostlině hrozí, je nesmírná a stejně tak nesmírná musí být i připravenost rostliny se bránit. Epidermální buňky v sobě skrývají mocnou sílu morfogeneze a buněčné polarity, která jim umožňuje nabývat velmi specifických tvarů a aktivovat se v případě potřeby i v diferencovaném stavu. Ať už se jedná o lalokovité pokožkové buňky, svěrací buňky průduchů, trichoblasty rhizodermis nebo trichomy, plesá srdce vnímavého pozorovatele nad jejich polarizovaným vývojem. A právě trichomy, pěšáci stojící na stráži listu, se hříčkou molekulárního osudu staly předmětem studia této práce. Analýza podjednotky EXO70H4 komplexu exocyst vedla k identifikaci mutanta s poruchou zrání trichomů. Vzhledem k tomu, že dosavadní poznatky o procesech odehrávajících se v trichomu po dokončení jeho růstu, jsou velmi omezené, otevřelo se pole neorané, slibující napínavou cestu za poznáním. A trichom, kouzelná to buňka, nezklamal, jak se dočtete na následujících stránkách. CÍLE PRÁCE analyzovat fenotypový projev jednoduchého mutanta Arabidopsis thaliana exo70h4 a vytvořit kombinované mutanty s dalšími podjednotkami EXO70 a testovat tak jejich případnou funkční zastupitelnost připravit konstrukty značené XFP, ověřit jejich funkčnost komplementací mutantního fenotypu a s jejich pomocí studovat buněčnou lokalizaci podjednotky EXO70H4 pomocí dvouhybridního kvasinkového systému identifikovat nové interaktory podjednotky EXO70H4 provést pozorování rostlin pěstovaných na UV záření a stanovit případné odchylky analýzou výsledků se pokusit definovat roli EXO70H4 v komplexu exocyst nebo mimo něj

10 TEORETICKÝ ÚVOD KOMPLEX EXOCYST Exocyst je evolučně vysoce konzervovaný bílkovinný komplex v eukaryotických buňkách, jehož úkolem je zařídit správné adresování sekretorických váčků na plazmatickou membránu (Munson and Novick, 2006). Jedná se o jeden z více poutacích komplexů, které se v buňce vyskytují. Funkcí těchto poutacích komplexů je uchycení sekretorických váčků na cílové membráně a zdá se, že hrají hlavní roli v procesu doručení váčku na správné místo (Whyte and Munro, 2002). Poutací komplexy uchytí váček na místě určení velmi blízko membrány. Další přiblížení a fúzování váčku s membránou již zajišťují proteiny SNARE. Poutacích komplexů je v buňce několik a každý z nich je specifický pro transport mezi jinými kompartmenty. Patří sem, viz obr. 1, exocyst, COG, GARP, TRAPPI, TRAPPII, TRAPIII, HOPS a Ds11p (Whyte and Munro, 2002; Lynch-Day et al., 2010). Komplex exocyst je specifický pro adresování a poutání post-golgi váčků na plazmatickou membránu, kde usnadňuje poslední fázi exocytózy a recyklování plazmatické membrány (TerBush et al., 1996). Identifikován byl nejdříve v kvasinkách (Novick et al., 1980) a později i u savců (Kee et al., 1997). Jak v kvasinkách, tak u savců se skládá z osmi podjednotek, SEC3, SEC5, SEC6, SEC8, SEC10, SEC15, EXO70 a EXO84 (Guo et al., 1999; Matern et al., 2001). Podjednotky SEC6, SEC8, SEC10, SEC15 a EXO84 jsou asociovány s váčky, zatímco pouze dvě podjednotky, SEC3 a EXO70, se lokalizují na cílové membráně (Finger et al., 1998; Boyd et al., 2004; Bendezu et al., 2012; Heider and Munson, 2012; Fendrych et al., 2013). Homology všech osmi podjednotek exocystu byly identifikovány i u rostlin (Cvrckova et al., 2001; Elias et al., 2003) a posléze byla jeho existence u rostlin prokázána i experimentálně (Hala et al., 2008). Zajímavé je, že mnoho z nich se v rostlinných genomech vyskytuje ve více kopiích. Genom Arabidopsis thaliana kóduje jednu kopii SEC6 a SEC8, dvě kopie SEC3, SEC5, SEC10 a SEC15, tři kopie EXO84 a 23 kopií EXO70 (Elias et al., 2003; Hala et al., 2008). Obrázek 1: Poutací komplexy. Šipky naznačují dráhy jejichž regulace se účastní unich vyobrazené komplexy. ER-endoplazmatické retikulum, endo.-endozom. Upraveno podle Whyte and Munro, (2002). 10

11 ROLE EXOCYSTU V TVORBĚ BUNĚČNÉ STĚNY A RECYKLACI MEMBRÁNOVÝCH PROTEINŮ Polarizovaná exocytóza zprostředkovaná komplexem exocyst, umožňuje efektivně řídit růst a výsledný tvar rostlinných buněk a pletiv. A to i přesto, že u rostlin je tvar buněk determinován zejména ovlivňováním plasticity buněčné stěny. Role polarizované exocytózy v tvorbě buněčné stěny je naprosto zásadní a umožňuje vytvářet i extrémně polarizované buňky jako třeba kořenové vlásky, pylové láčky nebo trichomy (Cole et al., 2005; Cole and Fowler, 2006; Synek et al., 2006; Szymanski, 2009; Zarsky et al., 2009). Exocyst se účastní polarizovaného doručování pektinů do buněčné stěny vulkanických buněk na povrchu semen Arabidopsis, konkrétně podjednotky SEC8 a EXO70A1 (Kulich et al., 2010). Podjednotka EXO70A1 je důležitá také pro tvorbu xylému v Arabidopsis, kde reguluje ukládání sekundární buněčné stěny (Li et al., 2013), a pro tvorbu kořenových vlásků a bliznových papil (Synek et al., 2006). Dále paralog EXO70A1 u Arabidopsis a Brassica napus odpovídá za vývoj bliznových papil (Kitashiba et al., 2011). Exocyst se podílí i na tvorbě buněčné přepážky při cytokinezi, konkrétně byly studovány podjednotky SEC6, SEC8, SEC15b, EXO70A1 a EXO84b (Fendrych et al., 2010). Dále bylo ve dvou pracích prokázáno, že se exocyst úpravami buněčné stěny podílí na biotických interakcích rostlin. V arbuskulární mykorrhyze mezi Medicago truncatula a glomeromycetes se podjednotka EXO84b jako člen prepenetračního aparátu angažuje v proliferaci perifungální membrány (Genre et al., 2012). Podjednotky EXO70B2 a EXO70H1 hrají roli v tvorbě obranné papily při napadení houbou (Pecenkova et al., 2011). Komplex exocyst a exocytóza jako taková jsou potřebné nejen při biogenezi buněčné stěny, nýbrž i při recyklaci membránových proteinů, jak dokumentuje práce Drdova et al., (2013). V případě mutace v podjednotkách EXO70A1 (exo70a1-2) a SEC8 (sec8-1) byla porušena recyklace auxinových přenašečů PIN1 a PIN2 a jiných proteinů. Vizualizace exocystu pomocí TIRF/VAEM přinesla vhled do jeho dynamiky na plazmatické membráně (Fendrych et al., 2013). Bylo zjištěno, že se jedná o vysoce dynamickou částici a že jeho podjednotky lokalizují do sekretoricky aktivních oblastí plazmatické membrány. Místa lokalizace exocystu byla nezávislá na cytoskeletu a lišila se od míst endocytózy. Pozorování váčků vizualizovaných pomocí markeru VAMP721-GFP v-snare ukázalo, že sekretorické váčky často kolokalizovaly s exocystem, ale také se exocyst nacházel v místech bez váčků. Tyto výsledky podpořily představu o exocystu jako vysoce dynamické částici, která neustále cykluje mezi plazmatickou membránou a cytoplazmou a zajišťuje poutání váčků. V mutantovi exo70a1 došlo k výrazné redukci výskytu exocystu na plazmatické membráně a následkem toho také ke snížení exocytózy (Fendrych et al., 2013). PODJEDNOTKA EXO70 A JEJÍ PARALOGY U ROSTLIN Poznatky ze studia kvasinek naznačují, že EXO70 je klíčovou podjednotkou komplexu exocyst a svou interakcí s Rho GTPázami v kvasince reguluje polarizovanou exocytózu a ukládání buněčné stěny (Robinson et al., 1999; He et al., 2007b; Wu et al., 2010). Podjednotka EXO70 se společně s podjednotkou SEC3 lokalizuje na membráně, kde značí cíl transportovaného 11

12 váčku. Zbytek komplexu exocyst je navázán na váček a spojením se SEC3 a EXO70 je váček upoután v místě jeho následné fúze s membránou, o kterou se postarají proteiny SNARE. Mutace těchto podjednotek, sec3 a exo70, u kvasinek vede v místech pučení k akumulaci sekretorických váčků, které nejsou schopny sfúzovat s plazmatickou membránou (He et al., 2007). Jak již bylo uvedeno, některé geny pro podjednotky komplexu exocyst jsou v rostlinném genomu zmnoženy. Naprosto vyčnívající mezi všemi je počet paralogů podjednotky EXO70. V genomu Physcomitrella patens je kódováno 13 paralogů, 15 jich je ve Vitis vinifera, 23 v Arabidopsis thaliana a 47 v Oryza sativa (Cvrckova et al., 2012). Pomnožení členů rodiny EXO70 je vlastností výhradně jen suchozemských rostlin. je otázkou, zda jsou funkce jednotlivých paralogů u rostlin redundantí nebo specializované. Začíná se ukazovat, že se některé paralogy EXO70 specializovaly na konkrétní buněčné typy nebo určité dráhy v jedné buňce (Zarsky et al., 2009; Li et al., 2010). Nové poznatky naznačují, že alespoň některé podjednotky EXO70 mají zcela jinou funkci, než nejlépe známá EXO70A1. U podjednotky EXO70B1 byla demonstrována role v transportu autofagických váčků do vakuoly (Kulich et al., 2013). U savčí podjednotky EXO70 bylo zjištěno, že dokáže indukovat deformaci membrány a tím tvorbu membránových výčnělků a že tak činí ve formě dimeru a navíc nezávisle na zbytku komplexu exocyst (Zhao et al., 2013). KOMPLEX TRAPPII A JEHO PODJEDNOTKA TRS120 Komplex TRAPP je stejně jako exocyst jedním z poutacích komplexů. Vyskytuje se v buňce ve třech formách, TRAPPI, TRAPPII a TRAPPIII. Komplex TRAPPI se skládá ze sedmi podjednotek - BET3, BET5, TRS20, TRS23, TRS31, TRS33, TRS85 a účastní se transportu váčků mezi endoplazmatickým retikulem a Golgiho aparátem. Komplex TRAPPII má tři podjednotky navíc - TRS65, TRS120 and TRS130, skládá se tedy celkem z deseti podjednotek a zprostředkovává pozdější fáze transportu v Golgiho aparátu. V kvasinkách se mutace v genu TRS120 projevuje defektní lokalizací podjednotek proteinu COPI (coat protein I) a narušením recyklace proteinů v časném endozómu (Cai et al., 2005). Byla také pozorována kolokalizace TRS120 s markerem Golgiho aparátu, SEC7p. Tato zjištění naznačují funkci TRS120 v COPI dependentním transportu z časného endozómu do Golgiho aparátu (Cai et al., 2005). VLIV UV ZÁŘENÍ NA ROSTLINY Součástí slunečního záření, které na Zemi dopadá, je i UV spektrum ( nm), které je pro organizmy škodlivé. Relativně málo je zatím známo o typech fotomorfogenických odpovědí a signálních drah rostlin při reakci na UV. Narozdíl od živočichů neznamená pro rostliny UV záření čistě jenom stres, nýbrž může také rostlině zprostředkovat informace o jejím okolí a může tak být růstovým či vývojovým stimulem (Kim et al., 1998). Obecně se dá říct, že nízké ozáření UV rostlinu nestresuje a rostlina v tu chvíli vnímá UV záření jako signál, zatímco vysoké ozáření rostlině škodí, vyvolává v ní oxidativní stres a spouští stresové signální dráhy. V několika expresních analýzách byla identifikována řada genů, které jsou 12

13 aktivovány či naopak potlačeny UV zářením (Casati and Walbot, 2004; Ulm et al., 2004; Ulm and Nagy, 2005). Také bylo odhaleno, že ELONGATED HYPOCOTYL5 (HY5, transkripční faktor) a CONSTITUTIVELY PHOTOMORFOGENIC1 (COP1, ubiquitin E3 ligáza) hrají roli v signální dráze odpovědi na UV (Ulm et al., 2004; Oravecz et al., 2006). Odpověď na UV je v mutantovi cop1 a hy5 blokována. Díky expresní analýze mutantů hy5 a cop1, bylo zjištěno, že UV záření zesiluje transkripci genu EXO70H4 (Oravecz et al., 2006). V mutantovi hy5 a cop1 však po ozáření UV k zvýšení transkripce EXO70H4 nedocházelo. Gen EXO70H4 tedy velmi pravděpodobně hraje nějakou roli v odpovědi na UV a jeho transkripce je UV zářením stimulována. FUNKCE TRICHOMŮ Trichomy jsou morfologicky rozličné, metabolicky aktivní či neaktivní, jedno či vícebuněčné specializované výrůstky epidermálních buněk, které se vytvářejí na povrchu skoro všech suchozemských rostlin (Johnson, 1975). Mají pro ně velký adaptivní význam a plní u nich mnoho funkcí. Podle funkce se trichomy dají rozdělit na krycí, žláznaté, žahavé a absorpční. Tyto funkce a z nich vyplývající morfologie trichomů se u různých druhů rostlin liší vzhledem k vlastnostem prostředí, na které se druh adaptoval. Charakteristickým příkladem jsou pouštní podmínky, kde se rostliny proti intenzivnímu slunečnímu záření brání mimo jiné také hustým porostem krycích trichomů na svém povrchu. Trichomový porost u nich zvyšuje odrazivost listu, čímž upravuje teplotu na povrchu listu a míru fotosyntézy a transpirace. Kromě regulace teploty a vodní regulace ještě trichomy slouží rostlině k rozptýlení semen, k ochraně před UV, mikroby, hmyzem a herbivory (Traw and Bergelson, 2003). Velký význam v ochraně rostlin mají žlaznaté trichomy u nichž dochází k masivní sekreci metabolických produktů do prostoru mezi buněčnou stěnou a kutikulou. Jedná se o metabolity zásobní nebo určené k sekreci při obraně rostliny. Velký význam pro člověka mají jednobuněčné trichomy semen bavlníku známé jako vlákna bavlny (jedny z nejdelších rostlinných buněk), které jsou nejpoužívanějšími rostlinnými vlákny textilního průmyslu (Wilkins et al., 2000). Dosahují délky až 1 cm a tloušťky μm a jejich funkce v rostlině je opět ochranná. Slouží bavlníku k ochraně semen před škůdci a přehřátím. TRICHOMY ARABIDOPSIS THALIANA U Arabidopsis se tvoří trichomy během vegetativní i reproduktivní fáze růstu na různých částech rostliny. Nevětvené trichomy vznikají hlavně na řapících listů, na stoncích květenství a na kališních listcích. Větvené trichomy se dvěma až pěti větvemi, nejčastěji však třívětvé, rostou v pravidelných rozestupech na listech rozety. První dva až tři lístky rozety mají trichomy pouze na svrchní straně. U dalších lístků se trichomy vytvářejí i na spodní straně. Normálně se trichomy nevytvářejí na kořenech, hypokotylu, kotyledonech, okvětních lístcích, tyčinkách ani pestících (Marks, 1997). Tato diplomová práce bude pojednávat o větvených trichomech, které během vývoje procházejí komplexní buněčnou morfogenezí, na jejímž konci je dospělý zralý trichom charakteristické velikosti s velmi precizní a polarizovanou architekturou. 13

14 MORFOGENEZE BUŇKY Vzhledem k obrovskému pokroku biologie došlo k přesměrování pozornosti od studia morfogeneze celého organizmu ke studiu tkání a jednotlivých buněk. Buněčná morfogeneze je aktivní proces, který často významně mění nejen vnější, ale také vnitřní organizaci buňky. Procesu morfogeneze předchází určení buněčného osudu buňky. Ve chvíli kdy je buněčný osud stanoven, buňka projde diferenciací, která může u některých vysoce specializovaných buněk představovat až extrémní morfologickou změnu tvaru, obsahu a velikosti, díky které buňka získává svou charakteristickou architekturu (Hulskamp, 2000). Typickým příklad v živočišné říši je diferenciace neuronu nebo spermiogeneze, kde v obou příkladech vznikají tvarově složité a polarizovaně strukturované buňky. V rostlinné říši je krásným příkladem morfogeneze vývoj větveného trichomu na listu Arabidopsis (a dalších rostlin z čeledi brukvovitých, Brassicaceae), který se diferencuje z jedné buňky epidermálního původu. A právě studium vývojových fází jedné buňky je dobrým odrazovým můstkem k pochopení toho, jak jsou během vývoje celé rostliny propojeny obecné buněčné morfogenetické procesy (Hulskamp, 2004). TRICHOM JAKO MODELOVÝ SYSTÉM Trichom Arabidopsis je dobře prostudovaný modelový systém rostlinné determinace buněčného osudu a morfogeneze na úrovni jedné buňky. Na jedné buňce lze zároveň studovat mnoho jednotlivých aspektů jejího vývoje. Primárně lze vývoj trichomu rozdělit na dvě hlavní fáze. Zaprvé to, jak se určuje, která z buněk uniformní protodermální vrstvy se stane trichomem, tzv. determinace buněčného osudu. A za druhé následná vlastní morfogeneze trichomu, která zahrnuje změny v buněčném cyklu a regulaci buněčného tvaru a polarity. Mezi výhody, které z trichomů dělají excelentní jednobuněčný model, patří fakt, že poruchy jejich vývoje neohrožují život rostliny a pro normální růst a vývoj nejsou trichomy potřebné. Velkou výhodou je také snadná dosažitelnost trichomů, jelikož se vyvíjí na povrchu rostliny a všechny vývojové fáze je možné snadno pozorovat. Dalším kladem je fakt, že se většina trichomových genů účastní i jiných procesů než jen vývoje trichomu a hraje roli při vývoji i jiných buněčných typů. Díky tomu přineslo studium vývoje trichomů mnoho nových šíře použitelných poznatků o funkci transkripčních faktorů, cytoskeletu, regulaci buněčného cyklu a buněčné smrti (Hulskamp, 2004). V rostlinách existuje více dobře probádaných silně polarizovaných buněčných typů, které lze považovat za modelové systémy. Kromě trichomů jsou to třeba kořenové vlásky a pylové láčky. U nich ovšem k růstu dochází jen v apikální části a formuje se tak jednoduchý válcovitý útvar bez komplikované struktury. Trichomové buňky narozdíl od nich prochází řadou rozličných morfogenetických událostí a nakonec nabývají poměrně složitého hvězdicovitého tvaru. Tedy jsou z tohoto hlediska bohatším studijním materiálem. VÝVOJ TRICHOMU Vývoj trichomů Arabidopsis je možné na základě morfologických kritérií rozdělit do šesti stádií, viz obr. 2. Iniciační stádium (radiální růst, buňka nevybočuje z roviny listu), válcovité stádium (růst nad rovinu listu, vznik stonku), stádium větvení, stádium prodlužování větví, 14

15 stádium difúzního růstu (zašpičatění větví) a stádium zrání buněčné stěny (Szymanski et al., 1998; Szymanski et al., 1999). Obrázek 2: Stádia vývoje trichomu. 1 - iniciační stádium; 2 - válcovité stádium; 3 - stádium větvení; 4 - stádium prodlužování větví; 5 - stádium difúzního růstu; 6 - stádium zrání buněčné stěny. Upraveno podle Hulskamp, (2004). Nezralá epidermis listového primordia je ze začátku tvořena uniformní vrstvou protodermálních buněk. Později mezibuněčné interakce přidělí buňkám jeden z buněčných osudů. z buňky se stane buď pokožková buňka, svěrací buňka průduchů nebo trichom. Právě trichomy jsou první buněčný typ, který se v epidermis listového primordia diferencuje. Jen některé buňky z uniformní vrstvy protodermálních buněk jsou vybrány k tomu, aby se z nich stal trichom. Tato determinace trichomové buňky a iniciace jejího buněčného osudu je pozitivně regulována skupinou tzv. patterningový genů (pattern = vzor/šablona) a jimi kódovanými bílkovinami, které společně prostřednictvím reakčně difúzních interakcí určují, kde a kdy trichom vznikne. Součinnost těchto genů zajišťuje, že jsou trichomy na listu rozmístěny rovnoměrně v pravidelných rozestupech a jen vzácně je možné spatřit dva bezprostředně sousedící trichomy. k iniciaci trichomů dochází pouze v oblastech, kde ještě probíhá dělení pokožkových buněk. Trichomy se na listovém primordiu nevyvíjejí synchronně v jeden moment, nýbrž vznikají postupně v průběhu 3-4 dní. První trichom se objevuje na špičce svrchní strany listového primordia poté, co primordium dosahuje délky přibližně 100 μm (Larkin et al., 1996). Během dozrávání listu se objevují nové trichomy směrem k jeho bázi. Takže trichomy v nejpokročilejší fázi vývoje se nachází u okrajů listové čepele a blíže ke špičce listu, trichomy ve střední fázi vývoje se objevují uprostřed listu a nejmladší trichomy se vytvářejí na bazálním konci listu. Nejedná se však o prostý časový gradient napříč listem, jelikož mezi starší trichomy, mezi nimiž dělením přibyly pokožkové buňky, se dále vmezeřují nová trichomová primordia, což časový gradient rozrušuje. Na mladém listu jsou tedy nenáhodně rozmístěny trichomy v různých stádiích vývoje (Marks et al., 1991). Jakmile je buněčný osud trichomu stanoven, zastaví buňka budoucího trichomu mitotické buněčné dělení, ale pokračuje v replikaci DNA a výsledkem je endoreduplikace genomu. Buňka projde v tuto chvíli třemi endoreduplikačními cykly. Obsah DNA v jedné buňce vzroste z 2C na 16C (1C rovná se obsahu DNA nereplikovaného haploidního genomu). Okolní buňky vznikajícího trichomu se nadále dělí normálně. V tuto chvíli může být trichomová buňka poprvé rozlišena od okolních pokožkových buněk díky jejímu zvětšenému jádru 15

16 a nárůstu velikosti. Buňka v této první fázi roste radiálně (izodiametricky) a expanduje do svého okolí, ale zatím nevyčnívá nad rovinu listu. Ve druhé fázi se prekurzorová buňka trichomu zvětší oproti okolním pokožkovým buňkám dvakrát až třikrát a začne na své vnější straně vyčnívat a růst nad rovinu listové čepele. Tato změna směru růstu z radiálního na růst směrem nad povrch listu dává vzniknout válcovitému zárodku budoucího stonku trichomu (Hulskamp et al., 1994). Zvětšující se buňka válcovitě roste nad povrch procesem podobným apikálnímu růstu pylové láčky nebo kořenového vlásku a postupně přesouvá své jádro do subapikální pozice. Ve chvíli, kdy trichomová buňka dosáhne tímto dlouživým růstem přibližně desetkrát větší velikosti než okolní pokožkové buňky, vstoupí do třetí fáze. Během ní se objeví na rostoucím stonku sekundární centra buněčného růstu ve formě viditelných vyboulenin, ze kterých vzniknou větve trichomu (Hulskamp et al., 1994; Marks, 1994). Tyto vybouleniny nevznikají najednou, nýbrž postupně. První větev se objevuje jako vyboulení na distální straně válcovitého trichomu a to nikoli na špičce válce, nýbrž přibližně v polovině válce, mezi bazí a špičkou (Hulskamp et al., 1994; Folkers et al., 1997). Druhá větev následně vzniká prodlužováním původní apikální špičky válce. Toto první větvení je orientováno k proximodistální ose listu tak, že vzniklé dvě větve leží podél této osy listového primordia (jedna míří ke špičce listu a druhá k jeho bázi). Třetí větev vzniká později na bázi prodlužující se první větve, která směřuje ke špičce listu (Hulskamp et al., 1994; Folkers et al., 1997), zatímco k bázi směřující větev se dále nerozvětvuje. Během větvení trichomu dochází k poslednímu zvětšení jádra čtvrtou endoreduplikací, kdy se obsah DNA změní z 16C na konečných 32C (pro porovnání obsah DNA svěrací buňky průduchu je 2C). Jádro se v té době stěhuje k místu větvení, konkrétně k bázi poslední vzniklé větve (Hulskamp et al., 1994). Po založení všech větví nastává čtvrtá fáze, kdy se větve prodlužují. Proto mají větve v této době tupě zaoblené konce a jejich obvod se nezvětšuje. Během přechodu ze čtvrté do páté fáze se buňka vakuolizuje. Naprostá většina objemového růstu buňky se odehrává během páté fáze jako výsledek této vakuolizace. Elongačním růstem trichomová buňka dosáhne výšky μm a průměru báze přibližně 50 μm (Marks, 1997). V této fázi se konce větví zašpičaťují, jelikož růst je směrován spíše do boků větví, než do špičky. od poloviny této fáze Obrázek 3: Trichom Arabidopsis thaliana. se na povrchu trichomů začínají Na obrázku je vyznačena rozvětvená buňka trichomu, formovat první výrůstky, zvané lalokovitá pokožková buňka a obdélníkovitá podpůrná papily. Po ukončení růstu nastává buňka trichomu (zdroj: 16

17 šestá fáze, fáze zrání, ve které se buněčná stěna zesiluje do konečné tloušťky přibližně 5 μm. i v této fázi pokračuje tvorba povrchových papil, čímž buněčný povrch získává bradavičnatý vzhled a zmatní se (Marks et al., 1991; Hulskamp et al., 1994). V této době se pokožkové buňky obklopující bázi trichomu diferencují v buňky podpůrné. Jedná se o osm až dvanáct buněk, jejichž diferenciace obnáší jejich zvětšení, zpevnění a změnu tvaru z lalokovitého na obdélníkovitý, viz obr. 3. KATEGORIE TRICHOMOVÝCH MUTANTŮ Molekulárně-genetickými metodami bylo charakterizováno mnoho mutantů s poškozeným vývojem trichomu (Marks, 1997; Kryvych et al., 2008; Marks et al., 2008; Marks et al., 2009). Většina těchto mutací postihuje všechny trichomy na rostlině (větvené, nevětvené, na lístcích rozety, na stonku, atd.). Vývoj a morfologie rozdílně tvarovaných trichomů jsou tedy často řízeny stejnými geny (Marks, 1997). Některé mutace vykazují fenotyp pouze ve vývoji trichomů, ale většina mutantů vykazuje i jiné vývojové defekty rostliny, ne jen trichomové. Hlavně díky těmto genům, které nejsou trichomově specifické, je vývoj trichomu použitelný i jako model pro studium celkového vývoje rostlin. Projev mutace je u většiny mutantů svázán s konkrétním vývojovým stádiem trichomu. A podle toho, které morfologické stádium je mutací postiženo, je mutanty možné kategorizovat do fenotypických skupin: iniciační mutanti, endoreduplikační mutanti, mutanti větvení, mutanti s pokřiveným růstem a mutanti zrání (Hulskamp et al., 1994). Jednotlivé skupiny jsou vyčerpávajícím způsobem charakterizovány v několika přehledových článcích (Hulskamp, 2004; Mathur, 2006; Yang and Ye, 2013) a kromě fáze zrání v této práci nebudou blíže popisovány. GENOVÁ EXPRESE V TRICHOMU ARABIDOPSIS THALIANA Díky publikovaným genovým profilům trichomu a analýzám trichomového transkriptomu Arabidopsis byl umožněn první komplexní vhled do genové exprese trichomu (Jakoby et al., 2008; Kryvych et al., 2008; Lieckfeldt et al., 2008; Marks et al., 2008; Marks et al., 2009). Analýza těchto dat identifikovala geny, které jsou silněji exprimovány v trichomech než v celých listech nebo rostlině. V práci Marks et al., (2009) byl porovnáván transkriptom trichomu a transkriptom rostlinného prýtu. Podle výsledků bylo genů exprimováno jak v trichomových vzorcích, tak ve vzorcích z rostlinného prýtu. z této skupiny společných genů byly ještě stanoveny geny, které jsou sice exprimovány v obou vzorcích, ale v jednom jsou exprimovány silněji, a to alespoň trojnásobně. Bylo tak identifikováno 450 genů se silnější expresí v trichomech a 850 genů se silnější expresí v prýtu. Dalších 1764 genů bylo specifických pouze pro trichomy a 906 genů pouze pro rostlinný prýt. Nebylo překvapivé zjištění, že 17 z 25 nejsilněji exprimovaných genů z prýtových vzorků kódovalo proteiny s funkcí v chloroplastech, zatímco pouze dva z těchto chloroplastových genů patřily mezi 25 nejexprimovanějších genů ve zralém trichomu. Díky četným studiím je dnes známo 14 genů kódujících transkripční faktory, u kterých byl prokázán vliv na vývoj trichomů (Marks et al., 2009). V transkriptomické 17

18 analýze Marks et al., (2009) bylo testováno 12 z těchto transkripčních faktorů a u 10 z nich byla detekována exprese ve zralém trichomu. U 7 z těchto 10 transkripčních faktorů byla detekována exprese pouze v trichomech, zatímco u zbývajících 3 analyzovaných transkripčních faktorů byla detekována exprese jak v trichomech, tak v rostlinných prýtech, ačkoli exprese v trichomech byla významně silnější. Dále bylo analyzováno 37 známých genů, jejichž mutace vede k abnormálnímu vývoji trichomů a současně v mnoha případech i k abnormálnímu vývoji rostlinného prýtu. U 34 z nich byla detekována exprese ve zralém trichomu. Jen 11 z těchto 34 vykazovalo vyšší expresi v trichomu než v rostlinném prýtu. U zbylých 23 genů nebyl pozorován rozdíl mezi expresí v trichomu a v prýtu. Tento výsledek nebyl překvapující, jelikož většina genů hrajících roli ve vývoji trichomu zároveň hraje roli i v jiných aspektech rostlinného vývoje (Marks et al., 2009). V jiné analýze genové exprese, Jakoby et al., (2008), porovnávali transkriptom listů porostlých trichomy a transkriptom mutantních listů bez trichomů. Identifikovali 3231 genů se zvýšenou expresí ve zralých trichomech oproti listům bez trichomů. A tak díky analýze tranksriptomu mutantů glabra3 a triptychon získali mnoho poznatků o buněčné stěně trichomů. Transkripty související s tvorbou buněčné stěny byly v trichomech přítomny ve vyšším množství. Byla také analyzována trichomová exprese 900 genů, u nichž se předpokládá funkce v biosyntéze buněčné stěny (Carpita et al., 2001). U 111 z nich byla exprese ve zralém trichomu skutečně zesílená. i podle Marks et al., (2008) mnoho skupin genů se zesílenou expresí v trichomu hraje roli v biosyntéze buněčné stěny - geny účastnící se biosyntézy polysacharidů, ligninu nebo dalších prekurzorů buněčné stěny. Studium expresních map také odhalilo vysokou aktivitu flavonoidových, anthokyanových a glukosinolátových drah, což indikuje roli trichomů v biosyntéze sekundárních metabolitů sloužících k ochraně rostliny (Jakoby et al., 2008). Mezidruhové porovnání odhalilo mnoho společných exprimovaných genů v trichomech Arabidopsis a vláknech bavlny - Gossypium hirsutum (Jakoby et al., 2008). V této studii byl též sestaven žebříček nejsilněji exprimovaných genů v trichomu. Na devátém místě se nacházel gen pektinové methylesterázy PME35, jehož mutace má u Arabidopsis za následek snížení obsahu pektinů v buněčné stěně stonku. Takovéto stonky přichází o mechanickou odolnost a jsou poléhavé, což dokládá význam pektinů pro pevnost buněčné stěny (Hongo et al., 2012). Dále se v expresní studii na jedenáctém místě nacházel gen EXO70H4 - podjednotka komplexu exocyst. Exprese dalších dvou paralogů EXO70, konkrétně EXO70H7 a EXO70B1, byla zvýšena. Nebyla však zjištěna zvýšená exprese žádných dalších podjednotek komplexu exocyst. STÁDIUM ZRÁNÍ TRICHOMU Po ukončení růstu trichomu nastává fáze zrání, konec morfogeneze. Tato fáze je doprovázena tloustnutím buněčné stěny a vytvářením papilových sekundárních ztluštěnin. V současnosti je o funkci těchto papil a o molekulárních mechanismech, které řídí procesy zrání, známo jen málo. Základní struktura rostlinné buněčné stěny je určena vlákny celulózy. Mezi nimi se nachází matrix tvořená hemicelulózami, pektiny a proteiny. V oblastech sekundárních 18

19 vrstev může být buněčná stěna lignifikována. Sekundární stěna se vytváří v okamžiku, kdy buňka přestane růst a již se dále nebude zvětšovat roztahováním primární buněčné stěny. od primární stěny se sekundární stěna liší složením a strukturou. Obsahuje více celulózy než primární stěna, neobsahuje glykoproteiny charakteristické pro primární stěnu a má málo pektinů. Kvůli nízkému podílu pektinů přichází sekundární stěny o elasticitu. Jednou z hlavních složek sekundárních buněčných stěn rostlin je lignin, po celulóze druhý nejhojnější biopolymer na planetě. Jedná se o heterogenní amorfní biopolymer, který je tvořen směsí tří derivátů fenylpropanu - guajacylem (4-hydroxy-3-methoxyphenyl), syringylem (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) a p-hydroxyfenylem (Terashima and Fukushima, 1989). Vzájemný poměr těchto složek ligninu se liší u jednotlivých taxonomických skupin rostlin. V případě květního stonku Arabidopsis je lignin tvořen guajacylem a syringylem (Yamamura et al., 2011). Přítomnost ligninu v trichomech Arabidopsis byla prokázána v práci Marks et al., (2008), kde byla iontovou chromatografií zjištěna přítomnost guajacylových jednotek a menšinový obsah syringylových jednotek. Lignin v buněčných stěnách vyplňuje prostor mezi celulózou, hemicelulózami a pektiny. Kovalentně se k těmto polysacharidům váže a vytváří tak mezi jejich vlákny spojení a dodává tím buněčné stěně sílu a pevnost, především v tlaku. Navíc je lignin hydrofobní, na rozdíl od ostatních polysacharidových složek stěny, a tak jejich zesíťování ligninem brání vodě prostupovat buněčnou stěnou. Ve zrajících trichomech tedy nadále probíhá biosyntéza buněčné stěny, ale protože už trichomy dále nerostou, dochází k jejímu ukládání na vnitřní stranu stěny trichomu. To má za následek zesilování stěny směrem do nitra buňky, zmenšování vnitřního prostoru buňky a utlačování cytoplazmy a organel ve zmenšeném lumen. Buněčná stěna trichomu pak dosahuje tloušťky až 5 μm. V práci Marks et al., (2008) byla stěna trichomů podrobena analýze. z trichomů byly izolovány stěnové monosacharidy, které byly poté analyzovány plynovou chromatografií. Největší izolovaná frakce monosacharidů byla frakce glukózy, galaktózy a arabinózy. Následovala v menším množství izolovaná frakce manózy, rhamnózy, xylózy a fukózy. Tato data z biochemické analýzy poukázala na to, že trichomové buněčné stěny v sobě spojují charakteristiky jak primárních, tak sekundárních stěn (Marks et al., 2008). Dále bylo prvkové složení buněčné stěny trichomů studováno v práci Esch et al., (2003), kde k tomu byla využita skenovací elektronové mikroskopie a rentgenové záření. Výsledky ve stěně prokázaly přítomnost uhlíku, kyslíku, hořčíku a vápníku. Povrchové papily obsahovaly navíc ještě fosfor. Dospělé pokožkové buňky a svěrací buňky průduchů vykazovaly přítomnost pouze uhlíku a kyslíku. MUTACE VEDOUCÍ K PORUŠE ZRÁNÍ TRICHOMU Do dnešní doby je známo jen málo genů, jejichž mutace způsobuje defekty ve fázi zrání trichomu. Byli identifikováni mutanti, u kterých se na trichomech netvoří povrchové papily nebo se tvoří méně. Jejich povrch se zdá být průhledný a skelný a proto se sdružují do fenotypické skupiny nazývané glassy (z anglického hladký jako sklo ). Mezi první 19

20 objevené mutanty s takto nedovyvinutými transparentními trichomy patří chablis, chardonnay a retsina (Hulskamp et al., 1994), o kterých dodnes bohužel není více známo. Později popsaný deflated trichomes též postrádá bližší charakterizaci (Brininstool, 2003). Mutace underdeveloped trichome má za následek útlejší a celkově menší trichomy s nedovyvinutými papilami směrem ke špičce větví (Haughn and Somerville, 1988), opět bohužel schází hlubší poznatky. Jen velmi málo se ví o constitutive pathogen resistance5 (Brininstool et al., 2008). Více prostudované mutace s trichomovým fenotypem jsou noeck (Folkers et al., 1997), murus2 (Vanzin et al., 2002), murus3 (Madson et al., 2003), trichome birefringence (Potikha and Delmer, 1995) a homeodomain glabrous2 (Marks et al., 2009). Mutace noeck (nok) se projevuje zvýšeným počtem větví trichomu a skelným povrchem bez papil, viz obr. 4. Byl to první případ mutanta, u kterého nebylo zesílené větvení doprovázeno i zmnožením cyklů endoreduplikace (Folkers et al., 1997). Gen NOK kóduje transkripční faktor MYB106 patřící do rodiny MIXTA (Stracke et al., 2001). Ta je známá z hledíku (Antirrhinum majus), kde transkripční faktory rodiny MIXTA regulují růst kónických epidermálních buněk okvětních lístků (Avila et al., 1993; Noda et al., 1994; Baumann et al., 2007). Silná exprese genu NOK v okvětních lístcích Arabidopsis odpovídá jeho příbuznosti s rodinou MIXTA (Noda et al., 1994). Obrázek 4: Fenotypový projev mutanta noeck. A a C - WT; B a D - noeck; měřítko = 50 μm. mutace se projevuje zvýšeným počtem větví, viz B, a ztrátou povrchových papil viz D. Podle Jakoby et al. (2008). Na druhou stranu v Arabidopsis u mutanta nok nebyl zatím u okvětních lístků žádný fenotypový projev pozorován. Zdá se, že došlo v evoluci ke změně původní funkce. Velmi pravděpodobně NOK reguluje geny tvorby papil, a proto by bližší prostudování transkripčního profilu mutanta mohlo tyto papilové geny identifikovat. Vzhledem k tomu, že papily se začínají vytvářit až poté, kdy jsou založeny všechny větve, dá se předpokládat, že funkce genu NOK 20

21 hraje roli při zrání trichomů (Jakoby et al., 2008). To se shoduje se silnou expresí genu NOK ve zralém trichomu, kde patří mezi 200 nejsilněji exprimovaných genů. Zajímavé je, že NOK není exprimován v kořenech, tudíž by to mohl být jeden z regulátorů odpovědných za fenotypový rozdíl mezi trichomy listů a trichoblasty rhizodermis (Jakoby et al., 2008). V pracích Reiter et al., (1993, 1997) byli izolováni mutanti s pozměněným složením monosacharidů buněčné stěny, kteří byli nazváni murus (mur1 - mur11), kdy mur2 a mur3 vykazovali snížený obsah fukózy. V pozdějších pracích byl u mur2 a mur3 popsán trichomový fenotyp (Vanzin et al., 2002; Madson et al., 2003). Povrchové papily jejich trichomů byly vrásčité, pomačkané a kolabovaly. V případě mutanta mur3 byl defekt papil o něco silnější než u mutanta mur2. Mutant mur2 má defektivní fukosyltransferázu xyloglukanů. Po naklonování lokusu obsahujícího mutaci mur2 bylo zjištěno, že se mutace nachází v kódující sekvenci genu FUT1. Mutant mur3 kóduje xyloglukanovou galaktosyltransferázu evolučně příbuznou s exostosinem živočichů (Madson et al., 2003). V rostlinách jsou fukosylovány tři polymery buněčné stěny - glykoproteiny, pektiny a xyloglukany. Jak u mutanta mur2, tak u mutanta mur3 je porušena fukosylace xyloglukanů, nikoli glykoproteinů nebo pektinů (Vanzin et al., 2002; Madson et al., 2003). Obsah L-fukózy v xyloglukanech mutanta mur2 je snížen na méně než 2 % normálního obsahu. je zajímavé, že i přesto se rostlina až na trichomové papily vyvíjí bez viditelných komplikací. Stejně tak je i mutant mur3 kromě poškozených papil skoro nerozlišitelný od normálních rostlin. A to i přes úplnou absenci postranního fukosylovaného řetězce xyloglukanů (Madson et al., 2003). V práci Potikha and Delmer, (1995) pomocí polarizovaného světla elegantním způsobem identifikovali recesivního mutanta trichome birefringence (tbr). Mutant tbr vykazuje jen lehké odchylky ve tvaru trichomu, nevytváří se u něj papily a především je defektní v ukládání celulózy do sekundární buněčné stěny. Defekt sekundární buněčné stěny se projevuje mimo jiné ztrátou schopnosti lámat polarizované světlo. Trichomy WT rostlin obsahují velké množství vysoce uspořádaných celulózových mikrofibril, a protože má celulóza krystalické vlastnosti, způsobuje silný dvojlom polarizovaného světla. Tento jev je typický pro rostlinné buňky s vysoce uspořádanou celulózou v sekundárních buněčných stěnách a je možné ho pozorovat polarizačním mikroskopem u celého listu nebo jednotlivých trichomů, ba dokonce i u jednotlivých papil, viz obr 5. Trichomy mutanta trichome birefringence polarizované světlo nelámou. Kvantifikace celulózy ukázala, že celkový obsah celulózy v trichomech tbr mutanta je proti trichomům WT rostlin snížen o více než 80 %. V buňkách vodivých pletiv listů bylo u mutanta naměřeno snížení obsahu celulózy až o 30 %. Obsah celulózy ve stonku, kořenech či kalusu nebyl u mutanta pozměněn. Gen TBR dal jméno nové genové rodině TRICHOME BIREFRINGENCE-LIKE (TBL). Všech 46 členů rodiny TBL obsahuje rostlinně-specifickou doménu zatím neznámé funkce s konzervovaným motivem GDSL známým z některých esteráz (Bischoff et al., 2010). Ukázalo se, že TBR a ještě jeden člen této rodiny, TBR-like3 (TBL3), hrají roli v syntéze a ukládání sekundární buněčné stěny, pravděpodobně ovlivňováním míry 21

22 esterifikace pektinů (Bischoff et al., 2010). Gen TBR je transkripčně koordinován s geny primárních celulózosyntáz a TBL3 je transkripčně koordinován s geny sekundárních celulózosyntáz (Bischoff et al., 2010). Oba dva mutanti mají ve stoncích a v trichomech pozměněné složení pektinů. U etiolovaných hypokotylů mutantních rostlin tbr byl naměřen nezměněný obsah celulózy primární stěny, zatímco obsah esterifikovaných pektinů byl snížen a aktivita pektinové metylesterázy byla zvýšena (Bischoff et al., 2010). Obrázek 5: Celulózou zapříčiněný dvojlom polarizovaného světla. Dále byly etiolované hypokotyly kratší než u WT rostlin a jejich A a C - WT - láme polarizované světlo; epidermální buňky byly nabobtnalé. B a D - trichome birefringence; Tyto fenotypické odchylky jsou shodné mutace se u trichomů projevuje ztrátou schopnosti lámat polarizované světlo, viz B a D. s těmi u mutatnů v genech primárních celulózosyntáz nebo s fenotypem WT Podle Bischoff et al. (2010). rostlin opůsobených inhibitory syntézy celulózy (Arioli et al., 1998). Podle výsledků expresních analýz se zdá, že geny primárních celulózosyntáz (CESA1, CESA3, CESA5 a CESA6) jsou v trichomech exprimovány zatímco geny sekundárních celulózosyntáz (CESA4, CESA7 a CESA8) v trichomu exprimovány zdá se nejsou (Jakoby et al., 2008; Marks et al., 2008). V práci Bischoff et al., (2010) si na základě těchto zjištění dovolili vyslovit hypotézu, že tzv. krystalická celulóza sekundárních stěn je v trichomech produktem primárního celulózosyntázového komplexu. U mutanta v genu CONSTITUTIVE PATHOGEN RESISTANCE5 (CPR5) byla také zpozorována snížená schopnost lámat polarizované světlo (Brininstool et al., 2008). CPR5 byl již dříve identifikován díky sníženému větvení u mutanta cpr5. Listy, stonky a kořeny rostlin mutanta cpr5 mají redukovaný polární růst, což má za následek podélně kratší buňky. Kořeny mutanta rostou pomaleji než u WT rostlin. Gen CPR5 podléhá regulaci genů trichomové iniciace. Snížená schopnost mutantních trichomů lámat polarizované světlo naznačuje změnu struktury buněčné stěny (Brininstool et al., 2008). Díky analýze trichomového transkriptomu byl identifikován trichomový fenotyp u již dříve objeveného genu HDG2 (Marks et al., 2009). Mutace nezpůsobuje změny v růstu trichomu, nýbrž ve zrání buněčných stěn trichomu. Povrchové papily hdg2 trichomů jsou značně nedovyvinuté a povrch trichomu se tak zdá být mnohem hladší než u WT. 22

23 Ve shodě s dřívějšími poznatky, že trichomové papily Arabidopsis obsahují proti okolní buněčné stěně navíc fosfor (Esch et al., 2003), přinesla analýza mutanta hdg2 výsledek také vypovídající o výrazně sníženém obsahu fosforu v papilách. Navíc pozorování skenovacím elektronovým mikroskopem ukázalo, že papily mutanta postrádají proti papilám WT některé uloženiny (Marks et al., 2009). Dá se tedy předpokládat, že jsou tyto uloženiny v papilách místem ukládání sloučenin obsahujících fosfor. Tato studie dále ukazuje, že kutikulární vrstva je u mutanta značně zredukovaná, a ačkoli v mutantovi k tloustnutí buněčných stěn dochází, barví se buněčné stěny méně než WT. Nižší barvitelnost buněčné stěny mutanta indikuje snížený obsah pektinů (rutheniová červeň) a celulózových sloučenin (tinopal LPW), zatímco obsah ligninu se zdá být nezměněn. HDG2 kóduje transkripční faktor z rodiny homeodoménových leucinových zipperů IV, která obsahuje 16 členů. První identifikovaný gen z této rodiny byl HDG1, u kterého mutace zamezuje růstu trichomů nad povrch listu, ale v případě slabšího mutanta se trichomy tvoří a mají také skelný povrch bez papil (Koornneef et al., 1982). z toho lze usuzovat, že i tento člen rodiny hraje roli ve zrání trichomu. Gen HDG2 je první případ transkripčního faktoru, jehož mutace zasahuje pouze zrání buněčné stěny trichomu, nikoli i morfologii trichomu. Exprese HDG2 ve zralém trichomu je velmi vysoká a je tak možné, že geny regulované tímto transkripčním faktorem hrají roli v procesech zrání trichomu. Analýza exprese genu přinesla zjištění, že exprese genu GL1 (GLABRA1) byla v mutantovi hdg2 výrazně zvýšená a exprese genu kódujícího CYP94C byla v mutantovi značně snížená. Funkce genu CYP94C je zatím nejasným způsobem spojená s oxidací mastných kyselin, která je potřebná při syntéze prekurzorů kutinu. Snížená exprese CYP94C v mutantovi hdg2 tedy může být příčinou redukce kutinové vrstvy (Marks et al., 2009). 23

24 MATERIÁL A METODY PĚSTOVÁNÍ ROSTLIN A BAKTERIÍ Pokusy byly prováděny na rostlinách Arabidopsis thaliana (ekotyp Columbia-8) a na rostlinách Nicotiana benthamiana. Semena Arabidopsis byla vyseta do rašelinových pelet (Jiffy), které byly kvůli vernalizaci semen na 3 dny umístěny do chladové místnosti (4 C). Poté byly pelety přeneseny do kultivační místnosti, kde byly rostliny kultivovány při 16h fotoperiodě ve 25 C. Rostliny Nicotiana benthamiana byly pěstovány ve stejných podmínkách, ale semena neprocházela vernalizací. Při pěstování rostlin na UV bylo použito měkké UV záření (360nm), přibližně 2W/m 2. Sterilní kultivace Arabidopsis thaliana K semenům Arabidopsis bylo přidáno 1,5 ml 20% roztoku SAVA a 1 μl detergentu Silwett L-77. V tomto roztoku byla semena 15 min třepána a následně byla ve flow-boxu (Alpina) pětkrát promyta sterilní ddh 2 O. Takto vysterilizovaná semena byla 2 dny vernalizována v lednici (4 C) a poté vyseta na poloviční MS médium. Miska byla ve svislé poloze umístěna v kultivační místnosti. Média YEPD médium: 2,75 g kvasinkového extraktu, 5,5 g peptonu a 5,5 mg adeninu bylo doplněno ddh2o do 250 ml, po autoklávování bylo přidáno 10 ml 50% glukózy. SD médium: 0,67 g yeast nitrogen base bez aminokyselin, 2 g rostlinného agaru, vhodný dropout, doplněno do 85 ml ddh2o, po autoklávování média byly přidány 4 ml 50% glukózy. 1/2 MS médium: 2,2 g MS média + B5 vitamíny (Duchefa M0231), 10 g sacharózy a 16 g agaru bylo do 1 l doplněno sterilní ddh2o. MPA médium: 23 g živného agaru (č. 1, ImunaPharm, a.s.) a 10 g NaCl bylo do 1 l doplněno sterilní ddh2o. MPB médium: 25 g živného bujónu č. 2 bylo doplněno do 1 l ddh2o, ph bylo upraveno na 7,5. LB médium: 10 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu, 5 g NaCl a 1 ml NaOH bylo do 1 l doplněno sterilní ddh2o. Média byla klávována při 121 C, 0,144 MPa, 20 min na autoklávu OmegaTMMedia. Příprava kompetentních buněk Za použití kompetentních buněk Escherichia coli (kmene DH5α, dále jen E.coli) z laboratorních sbírek byla zaočkována Petriho miska s MPA médiem. Ta byla přes noc inkubována ve 37 C. do 10 ml MPB média byla sterilním párátkem přenesena jedna kolonie. Toto inoku- 24

25 lum bylo za stálého míchání pěstováno přes noc ve 37 C. Druhý den byl narostlým inokulem naočkován 1 l MPB média. Připravená kultura byla napěstována za stálého míchání ve 37 C do OD 600 v rozmezí 0,5 a 0,8, měřeno oproti čistému MPB. Takto narostlá kultura byla rozdělena do 50ml zkumavek, 15 min chlazena na ledu a poté centrifugována 15 min při 3 600xg ve 4 C. Pelet byl rozpuštěn v 1 l ddh 2 O a opětovně centrifugován za stejných podmínek. Přečištěný pelet byl rozpuštěn v 0,5 l ddh 2 O a znovu centrifugován za stejných podmínek jako výše. Vzniklý pelet byl rozpuštěn ve 20 ml 10% glycerolu. Z této suspenze byl odebrán vzorek, u kterého byla změřena OD 600 oproti čisté vodě. Zbytek suspenze byl centrifugován 15 min při 4 600xg ve 4 C a pelet byl rozpuštěn ve 2-3 ml 10% glycerolu. Konkrétní množství glycerolu bylo vypočteno z naměřené OD 600 tak, aby konečná koncentrace buněk byla vyšší než 3 x buněk (za předpokladu, že OD 600 0,1 odpovídá 108 buněk). Takto naředěná suspenze byla po 50 μl rozdělena do mikrocentrifugačních zkumavek a zmrazena v tekutém dusíku. Tyto alikvoty byly skladovány v -80 C. Kompetentní buňky Agrobacteria tumefaciens (kmen GV3 101, dále jen Agrobacterium) byly připravovány podle stejného protokolu jako kompetentní buňky E.coli s tím rozdílem, že byly pěstovány na Petriho misce s rifampicinem (15 μl/ml) a gentamycinem (25 μl/ml) při 28 C. Jedna kolonie byla přenesena do 10 ml MPB média s rifampicinem a gentamycinem (1 μl/ml). Tímto inokulem naočkovaný 1 l MPB média bez antibiotik byl pěstován 5 hodin ve 28 C. Elektroporace bakterií K transformaci kompetentních buněk elektroporací byl použit elektroporátor Gene Pulser Xcell (BIORAD) nebo Eporator (Eppendorf). do vychlazené sterilní elektroporační kyvety byla na ledu přenesena směs 50 μl kompetentních buněk (E.coli nebo Agrobacterium) a 1,5 μl DNA určené k transformaci do bakterií. Následně byla DNA vnesena do kompetentních buněk elektroporací při 2500 V. Po elektrickém pulzu bylo k bakteriím přidáno 600 μl sterilního média LB a nechali se 1 hodinu míchat při 37 C (E.coli) nebo 3 hodiny ve 28 C (Agrobacterium) v třepacím inkubátoru (GFL 3032) za stálého míchání (180 ot./min). Poté byly bakterie sterilně vysety na Petriho misky s médiem MPA s vhodnými antibiotiky a pěstovány přes noc ve 37 C (E.coli) nebo 48 hodin ve 28 C (Agrobacterium). Křížení Arabidopsis thaliana Při křížení byly použity kvetoucí rostliny stáří přibližně 3-4 týdnů. Jedné rostlině byly odstraněny všechny rozkvetlé květy a malá poupata nevhodná ke křížení. Byla ponechána 3-4 velká poupata, kterým byly nabroušenou pinzetou otrhány kališní i korunní lístky a tyčinky tak, aby na květní stopce zbyla jen neopylená blizna. Z druhé rostliny byla odebrána zralá tyčinka a její pyl byl nanesen na odhalené blizny první rostliny. Vrcholky rostlin s takto opylenými bliznami byly zabaleny do proužku potravinové fólie, obvázány svrchu a zespodu tak, aby se zabránilo vysychání či napadení škůdci. Po vyschnutí šešulí byla semena sklizena. Byla vypěstována první heterozygotní generace. Z druhé generace byly genotypováním vybrány rostliny vykazující rodičovský mutantní genotyp. Z jejich semen byla vypěstována třetí generace. 25

26 PRÁCE S DNA Izolace genomické DNA Lístek o průměru přibližně 1 cm byl v mikrozkumavce rozemlet plastovým tloučkem. K rozdrcenému materiálu bylo přidáno 400 μl extrakčního pufru (200mM Tris-HCl, ph 7,5, 250mM NaCl, 25 mm EDTA, 0,5% SDS) a 300 μl chloroformu. Směs byla 1 min vortexována a poté centrifugována 1 min při xg. Supernatant byl přenesen do nové mikrozkumavky a smíchán s 300 μl isopropanolu. Vzniklá suspenze byla ponechána 10 min v pokojové teplotě a poté 5 min centrifugována při xg. Zkumavky s peletem DNA byly chvíli ponechány otevřené, aby se odpařily zbytky isopropanolu. Poté byl pelet rozpuštěn ve 100 μl 4mM Tris (ph 8,0). Izolace plazmidové DNA Jedna kolonie natransformovaných bakterií E.coli byla sterilním páratkem přenesena z Petriho misky do zkumavky s 2 ml MPB a s antibiotiky dle plazmidu (v koncentraci 1 μl/ml). Toto inokulum bylo pěstováno za stálého míchání přes noc ve 37 C. Druhý den byla bakteriální kultura centrifugována 30 s při 6000xg. K izolaci plazmidové DNA byl použit High Pure Plasmid Isolation Kit (250) Cat. No (Roche). Výstupem bylo 100 μl eluátu v elučním pufru (10 mm Tris-HCl, ph 8,5). Agarózová gelová elektroforéza K separaci, vizualizaci a purifikaci DNA fragmentů byla použita agarózová gelová elektroforéza. V TBE pufru (10 mm Tris, 20 mm kyselina boritá, 1 mm EDTA, ph 8,0) byla rozpuštěna prášková agaróza v koncentraci 0,1 g/ml. Ta byla následně povařena v mikrovlnné troubě po dobu 1-2 min, tak aby se agaróza plně rozpustila. Roztok se při pokojové teplotě nechal 2-3 min ochladit a poté do něj byla přidána fluorescenční barva GelRed (Biotium, x v ddh2o) ve finální koncentraci 1 μl barvy na 10 ml gelu. Roztok se dal utuhnout do utěsněné vaničky s hřebenem. Po zatuhnutí gelu (20-25 min) byl hřeben vyjmut a gel byl přemístěn do elektroforetické nádržky s TBE pufrem. Vzorky byly v poměřu 1:5 smíchány s 6x Loading Dye (Fermentas) a naneseny na gel. Kvůli následné analýze velikosti testovaných fragmentů byl do první jamky napipetován GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas), v množství 4 μl (0,5 μg/μl). Elektroforéza probíhala při 90 V. K vizualizaci DNA a vyhodnocení výsledků byl použit digitální zobrazovací systém G:BOX (Syngene) a program GeneSnap (Syngene). Pro izolaci fragmentů z agarózového gelu byl po dojetí gel v temnici umístěn na UV lampu a z vizualizovaných proužků byl vybrán fragment žádané velikosti. Ten byl sterilním skalpelem vyříznut a umístěn do 2ml mikrozkumavky. DNA byla z gelu vyizolována pomocí kitu MinElute Gel Extraction Kit (250) Cat. no (Quiagen). Výsledkem bylo 10 μl eluátu v elučním pufru. Vzorek byl skladován ve 20 C. 26

27 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE Polymerázová řetězová reakce (PCR) probíhala v 200μl mikrozkumavkách buď v termocykleru TPersonal (Biometra) nebo v gradientovém cykleru TGradient (Biometra). Když byla použita polymeráza DreamTaq (Fermentas), obsahovala 20μl reakční směs 0,04 μl DreamTaq DNA polymerázy (5U/μl), 2 μl 10x DreamTaq pufru, 0,25 μl dntp (každý 2,5mM), 0,2 μl levého primeru (100 μm), 0,2 μl pravého primeru (100 μm), 1 μl templátové DNA a 16,31 μl ddh2o. Teplotní program: 96 C 2 min, 96 C 30 s, C (T m -2) 30 s, 72 C 1 min/1 kbp, 72 C 10 min, krok 2-4 byl opakován 28x. V případě použití polymerázy Phusion High-Fidelity (Finnzymes) obsahovala 20μl reakční směs 0,2 μl Phusion DNA polymerázy (2U/μl), 4 μl 5x Phusion HF pufru, 0,4 μl dntp (každý 2,5mM), 0,5 μl levého primeru (100 μm), 0,5 μl pravého primeru (100 μm), 1 μl templátové DNA a 13,4 μl ddh2o. Teplotní program: 98 C 30 s, 98 C 10 s, 62 C 30 s, 72 C 30 s/1 kbp, 72 C 10 min, krok 2 4 byl opakován 30x. Při amplifikační PCR byla použita polymeráza Phusion High-Fidelity a následující primery, vložená restrikční místa jsou proložena tučným písmem, místo štěpení je vyznačeno lomítkem: Pro EXO70H4 s přirozeným promotorem: LP_H4-P: 5 -GGGAGGTAC/CTTCACAGTTCCTTAGCAA-3 RP_H4-P: 5 -CTG/TCGACGAGGACATGGATTGCCTTGA-3 Pro TRS120 s přirozeným promotorem: LP_TRS-P: 5 -GAGGTAC/CACCTCACAAAGAATTGAAAGCATATCC-3 RP_TRS-P: 5 -TAAG/TCGACACAGTGCACCTCCAGCTAC-3 K purifikaci PCR produktů byl použit High Pure PCR Product Purification Kit (250) Cat. No , (Roche). Výsledkem bylo 50 μl eluátu v elučním pufru (10mM Tris-HCl, ph 8,5). Nukleázová enzymatická aktivita restrikčních reakcí zde byla inaktivována. GENOTYPOVÁNÍ Genomická DNA izolovaná z listů Arabidopsis byla použita jako templát pro PCR s Dream Taq polymerázou. K testování přítomnosti T-DNA inzerce byl použit univerzální primer LBb1.3 (Salk) komplementární k T-DNA inzerci se sekvencí: 5 -ATTTTGCCGATTTCG- GAAC-3. Dále byly použity primery specifické pro testované geny. Pro exo70h4-1: LP_H4-1: 5 -TGGGATTTCGTTTCACAGTTC-3 RP_H4-1: 5 -AATCCGTCATXACGTTGGTAG-3 Pro exo70h4-3: LP_H4-3: 5 -AACAAACCTGAAGCCATGATG-3 RP_H4-3: 5 -GTTGCTGTAGTCAGCGAGGAG-3 27

28 Pro exo70h7-1: LP_H7-1: 5 -AATCGATTGTTGATGAGACGC-3 RP_H7-1: 5 -CCTGAGCCTCTAGACCCAAAG-3 RT-PCR K izolaci RNA byly použity rostliny Arabidopsis, které byly pěstovány na plotnách s polovičním MS médiem. Pětidenní semenáčky byly zváženy a zmraženy v tekutém dusíku. Celková RNA byla izolována pomocí RNeasy Plant Mini Kit (50) Cat. No (Quiagen). Výsledkem bylo 30 μl eluátu v ddh 2 O. Vzorky byly spektrofotometricky kvantifikovány a následně byl 1 μg izolované RNA použit k DNAzování pomocí 1 jednotky DNAse i RNase-free (Fermentas). Ta byla po 30 min inaktivována přidáním 50mM EDTA a zahřátím na 65 C. Výsledná RNA takto zbavená kontaminace DNA byla použita jako vstup pro Transcriptor High Fidelity cdna Synthesis Kit Cat. No (Roche) za použití random hexamer primerů. Výsledkem bylo 20 μl vzorku cdna. Z toho byly použity 2 μl pro detekční PCR s polymerázou DreamTaq. Získaná cdna byla skladována v -20 C. Primery pro RT-PCR: LP_H4-N 5 -CCCTCGCCAGAGTTTGGAAT-3 RP_H4-N 5 -CAAAGAGAAGAAGCGCACCG-3 LP_H4-C 5 -GTTTTCCGGCTGCTTGACAT-3 RP_H4-C 5 -TATAGCTGCCGGCGAATTGT-3 KONSTRUKTY Gateway klonování - LR reakce V LR reakci bylo smícháno 1-7 μl ( ng) inzerční DNA zaklonované ve vstupním (donorovém) vektoru s 1 μl ( ng) cílového (akceptorového) vektoru. Reakce byla do 8 μl doplněna TE pufrem (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 8,0) a nakonec byly přidány 2 μl LR Clonase II enzyme mixu (Invitrogen). Reakční směs byla promíchána na vortexu (Vortex2 Genie od Scientific Industries) a inkubována 1 hodinu ve 25 C. Reakce byla zainhibována 10min inkubací ve 37 C s 1 μl Proteinázy K. Výsledný produkt byl elektroporován do bakterií, které byly pěstovány na MPA médiu s příslušným antibiotikem. DNA byla z bakterií izolována a její správnost byla ověřena kontrolní restrikcí. Restrikce DNA Plazmidová DNA (4 μl) či inzerční DNA (10 μl) byla smíchána s 1 μl (10 U) restrikčního enzymu, se 2 μl vhodného pufru a ddh 2 O dopočítanou do celkového objemu reakce 20 μl. Restrikční směs byla inkubována 1 hodinu ve 37 C. V případě kontrolní restrikce k ověřování správnosti vzorků byly použity pouze 2 μl DNA, 0,2 μl restrikčních enzymů, 2 μl odpovídajícího pufru a ddh 2 O dopočítaná do celkového objemu reakce 20 μl. Restrikční směs byla inkubo- 28

29 vána přes noc ve 37 C. Výsledek restrikce byl analyzován pomocí agarózové gelové elektroforézy. Ligace fragmentů DNA Do ligační směsi byla přidána plazmidová DNA v množství 4 μl, inzerční DNA v množství 8 μl, 1 μl T4 DNA ligázy (Fermentas) a 2 μl 10x T4 ligačního pufru (Fermentas) a 5 μl ddh 2 O. Ligační směs byla inkubována 1 hodinu v pokojové teplotě nebo přes noc ve 14 C a následně byla ligace inaktivována 10 min v 65 C v termobloku (BioSan CH-100). Sekvenování Koncentrace sekvenované DNA byla určena spektrofotometricky nebo srovnáním světelnosti proužku elektroforetogramu s kalibrovaným vzorkem (GeneTool). Sekvenační směs obsahovala 5pmol sekvenačního primeru, plazmidovou DNA v množství 4 ng/100 bp a byla doplněna ddh 2 O do celkového objemu 8 μl. Vlastní sekvenování provedla sekvenační laboratoř Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy. Výsledky sekvenování byly pomocí programu TAIR WU-BLAST 2.0 na stránce porovnávány se sekvencemi nacházejícími se v TAIR databázi. K sekvenování byly použity následující primery: Pro TRS120 s přirozeným promotorem: LP_pENTR1A: 5 -CAATGCTTTTTTATAATGCC-3 LP1_TRS-P: 5 -CCAAAAATCACGAAACAGCTAAGTATTCATCGAT-3 LP2_TRS-P: 5 -TAATCGGAAGATGCTCGCCGTGAT-3 LP3_TRS-P: 5 -TTGGCTGGTTCACCTGTTGATGC-3 LP4_TRS-P: 5 -TTGTGTGTGTGTGGCTTTGATCCTCT-3 LP5_TRS-P: 5 -CTCTTGTGTTTGTTGGTAAAGGAAACTGGG-3 LP6_TRS-P: 5 -GCTCCTTCTGGGCCATTTATTTACACTCC-3 LP7_TRS-P: 5 -CTGATTCTGACAATACTATGAGCAGTGGCA-3 LP8_TRS-P: 5 -GCCCTTCAAGTAGTAGAAATCCGAGCTTC-3 LP9_TRS-P: 5 -CTTAGTGGAATCTCAATGGAAGTAGCGCC-3 RP_pENTR1A: 5 - GAGATTTTGAGACACGGG-3 Pro EXO70H4 s přirozeným promotorem: LP_pENTR1A: 5 - CAATGCTTTTTTATAATGCC-3 LP1_H4-P: 5 -TGGCAATATTCAAAGGTCAACAC-3 LP2_H4-P: 5 -GTCGAAGATCTAGATACGATCATCG-3 LP3_H4-P: 5 -CAGCAACGTACTAGTCGATATCCTC-3 RP_pENTR1A: 5 - GAGATTTTGAGACACGGG-3 Pro fragment TRS120 z dvouhybridního screenu: LP_pAD: 5 -AGATACCCCACCAAACCCA-3 29

30 Klonování konstruktů EXO70H4 v pubnyfp (UBQ::YFP-EXO70H4) Z konstruktu EXO70H4 v pentr221, který byl získán z The Arabidopsis Information Resource Centre, byla kódující sekvence EXO70H4 přenesena do binárního vektoru pubnyfp pomocí LR reakce. Výsledek reakce byl transformován do kompetentních buněk E.coli. Transformanti byli selektováni na Petriho miskách s MPA médiem a spektinomycinem. Z bakterií izolovaná DNA byla podrobena kontrolnímu štěpení, zda LR reakce proběhla správně a následně byla sekvenována. EXO70H4 s přirozeným promotorem v pentr1a Z genomické DNA byl pomocí PCR s polymerázou Phusion High-Fidelity namplifikován gen EXO70H4 spolu s přibližně 1 kbp předcházející start kodónu. do sekvence primerů byla přidána restrikční místa, LP_H4-P: KpnI, RP_H4-P: SalI. Přečištěný PCR produkt byl naštěpen restriktázami KpnI a SalI. Vektor pentr1a byl naštěpen restriktázami KpnI a XhoI (restriktázy SalI a XhoI vytváří kohezní konce). Požadované fragmenty byly získány pomocí gelové elektroforézy a zaligovány. Produktem ligace byly transformovány kompetentní buňky E.coli, které byly následně vysety na Petriho misky s MPA médiem a kanamycinem. Z narostlých bakterií byla izolována DNA. Správný výsledek klonování byl ověřen kontrolním štěpením a sekvenováním. EXO70H4 s přirozeným promotorem v pmdc107 (EXO70H4::EXO70H4-GFP) K vytvoření tohoto konstruktu byla kódující sekvence EXO70H4 s přirozeným promotorem z vektoru pentr1a přenesena do binárního vektoru pmdc107 pomocí LR reakce. Výsledek reakce byl transformován do kompetentních buněk E.coli. Transformanti byli selektováni na Petriho miskách s MPA médiem a kanamycinem a hygromycinem. Z bakterií izolovaná DNA byla podrobena kontrolnímu štěpení, zda LR reakce proběhla správně. TRS120 s přirozeným promotorem v pentr1a Tento konstrukt byl připraven stejně jako EXO70H4 s přirozeným promotorem v pentr1a. do sekvence primerů byla přidána stejná restrikční místa, LP_TRS-P: KpnI, RP_TRS-P: SalI. TRS120 s přirozeným promotorem v pmdc107 (TRS120::TRS120-GFP) K vytvoření tohoto konstruktu byla kódující sekvence TRS120 s přirozeným promotorem z vektoru pentr1a přenesena do binárního vektoru pmdc107 pomocí LR reakce, dále bylo postupováno stejně jako u EXO70H4 v pmdc107. S tím rozdílem, že transformanti byli selektováni na MPA médiu s kanamycinem a hygromycinem. TRS120 s přirozeným promotorem v pubc-rfp (TRS120::TRS120-RFP) K vytvoření tohoto konstruktu byla kódující sekvence TRS120 s přirozeným promotorem 30

31 z vektoru pentr1a přenesena do binárního vektoru pubc-rfp pomocí LR reakce, dále bylo postupováno stejným způsobem jako u EXO70H4 v pmdc107. S tím rozdílem, že transformanti byli selektováni na MPA médiu se spectinomycinem. Další použité konstrukty Konstrukt P19 byl použit při transformacích rostlin jako virový supresor posttranskripčního silencingu. Zdrojem byly laboratorní sbírky. Konstrukt ST-RFP v pk7rwg2 (35S::ST-RFP) byl použit jako marker Golgiho aparátu, tento konstrukt byl poskytnut Laboratoří buněčné biologie z Ústavu experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. Pro kvasinkový dvouhybridní systém byla použita knihovna CD4-30 ve vektoru pad, která byla získána z The Arabidopsis Information Resource Centre. Konstrukty EXO70A1 v pgbkt7, EXO70B1 v pgbkt7, EXO70B2 v pgbkt7 a EXO70H4 v pgbkt7 byly získány z laboratorních sbírek Laboratoře buněčné biologie z Ústavu experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. TRANSFORMACE ROSTLIN Tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana Sterilním párátkem byla z Petriho misky přenesena kolonie transformovaného Agrobacteria do zkumavky s 2 ml MPB média a s antibiotiky (1 μl/ml) dle plazmidu. Toto inokulum bylo pěstováno za stálého míchání ve 28 C do stacionární fáze. Narostlé inokulum bylo v 2ml mikrocentrifugační zkumavce centrifugováno 5 min při 2200xg. Pelet byl resuspendován v 1 ml infiltračního pufru (50mM MES, ph 5,6, 2mM Na 3 PO 4, 0,5% glukóza) a znovu zcentrifugován. Pelet byl resuspendován v 0,5 ml pufru a jeho OD 600 byla upravena na 0,03, v případě konstruktu P19 na 0,05. Z takto upravené suspenze byl 1 ml nabrán do injekční stříkačky bez jehly a infiltrován do spodní strany listů mladých rostlin Nicotiana benthamiana s několika dobře vyvinutými listy (přibližně čtyřtýdenní rostliny). Stabilní transformace Arabidopsis thaliana Buňky Agrobacteria transformované binárním plazmidem byly den před transformací inokulovány do 100 ml MPB média s antibiotiky (1μl/ml) podle plazmidu. Inokulum bylo kultivováno za stálého míchání ve 28 C přes noc. Druhý den byla bakteriální kultura centrifugována v 50ml zkumavkách 15 min ve 4 C při 3700xg. Pelet byl resuspendován ve zbytkové kapalině a dále rozředěn ve vodném roztoku 5% sacharózy, Silwettu L-77 (do konečné koncentrace 0,05 %) a acetosiringonu (do konečné koncentrace 0,1 %). Rostlinám Arabidopsis (5 6 týdnů) byly před namáčením ostříhány otevřené květy a šešule. Nadzemní části rostlin byly na 5-10 s ponořeny do suspenze a poté volně přikryty igelitovým pytlem. Přes noc byly rostliny ponechány ve tmě a druhý den ráno byly přeneseny do kultivační místnosti. Za týden byly rostliny transformovány znovu, tentokrát jim nebyly stříhány šešule ani otevřené květy. Sklize- 31

32 ná semena byla hromadně vyseta do půdy a po objevení prvních pravých listů (asi po týdnu) byly semenáčky selektovány postřikem BASTA (250 ng/ml, AgroBio). Roztok byl aplikován 4x, vždy s odstupem jednoho dne. Rezistentní rostliny byly přesazeny do rašelinových pelet a dopěstovány do semen již bez herbicidu. DVOUHYBRIDNÍ KVASINKOVÝ SYSTÉM Transformace kvasinek a screening K transformaci kvasinek Saccharomyces cerevisiae byl použit kmen AH109 s genotypem: MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4δ, gal80δ, LYS2::GAL1 UAS- GAL1 TATA- HIS3, GAL2 UAS- GAL2 TATA- ADE2, URA3::MEL1 UAS- MEL1 TATAlacZ. Několik kolonií kvasinek bylo zaočkováno do 1 ml YEPD média a resuspendováno. Toto inokulum bylo dále zaočkováno do 50 ml YEPD média, které bylo následně inkubováno přes noc (16 18 h) ve 30 C za stálého míchání (250 ot./min) tak, aby dosáhlo stacionární fáze. Z výsledné kultury bylo 30 ml zaočkováno do 300 ml nového YEPD média a inkubováno ve 30 C při stálém míchání (230 ot./min) přibližně 3 5 h tak, aby bylo dosaženo OD 600 v rozmezí 0,4-0,6. Kvasinková kultura byla rozdělena do 50ml centrifugačních zkumavek a centrifugována při pokojové teplotě 5 min při 1000xg. Supernatant byl vylit a usazené kvasinky byly resuspendovány v ddh2o o celkovém objemu 50 ml. Toto zředěné médium bylo znovu centrifugováno při pokojové teplotě 5 min, při 1000xg a vzniklý supernatant byl vylit. Sediment kvasinek byl rozpuštěn v 1,5 ml čerstvě připraveného sterilního roztoku TE/LiAc. Dále bylo v nové 1,5 ml centrifugační mikrozkumavce smícháno 0,1 μg plazmidové DNA určené k transformaci a 0,1 mg herring testes carrier DNA. do této zkumavky bylo přidáno 100 μl kvasinek v TE/LiAc z předchozího kroku a vzniklá směs byla dobře promíchána. do zkumavky bylo přidáno 600 μl sterilního roztoku PEG/ LiAc a 10 s se směs vortexovala při maximální rychlosti. Dále byla směs inkubována 30 min ve 30 C a míchána (200 ot./min). Po dokončení této inkubace bylo přidáno 70 μl DMSO a přemístěním směsi na 15 min do vodní lázně o 42 C a následným 2min zchlazením na ledu byl kvasinkám způsoben teplotní šok. Vzorky byly centrifugovány 5 s při xg, supernatant byl odlit. Usazené kvasinky byly resuspendovány ve 200 μl TE pufru. Tato směs byla přenesena na Petriho misky s SD médiem s vhodnou auxotrofní selekcí. Misky byly inkubovány ve 30 C, dokud se neobjevily kolonie, přibližně 2-4 dny. Izolace DNA z kvasinek Petriho misky s kvasinkami vybranými k izolaci DNA byly inkubovány tak dlouho, aby po celém povrchu vyrostlo dostatečné množství substrátu pro izolaci. Kvasinky byly z povrchu misky seškrábnuty sterilní bakteriální kličkou a resuspendovány v 1,5 ml ddh2o. Směs byla centrifugována 1 min při xg a sediment byl rozpuštěn ve 300 μl TE pufru s 0,2% SDS. Dále bylo přidáno cca 150 μl skleněných kuliček (Ballotina, průměr do 0,05 mm) a směs byla 20 min třepána v homogenizátoru (Retsch MM301) na maximální výkon. Po ukončení homogenizace bylo přidáno 300 μl fenolu. Zamíchaná směs byla centrifugována 5 min při xg. Supernatant byl přemístěn do nové centrifugační mikrozkumavky a byla k němu přidána 1/10 jeho objemu 3M NaOAc a trojnásobek jeho objemu 96% ethanolu. DNA byla srážena 15 min 32

33 při 20 C a poté 10 min centrifugována. Sediment byl rozpuštěn ve 30 μl TE pufru. Takto získaná DNA byla elektroporována do bakterií a následně z nich byla izolována. Testování proteinových interakcí dvouhybridním kvasinkovým systémem Dvouhybridní kvasinkový systém se používá k dokazování proteinových interakcí. Otevřený čtecí rámec prvního testovaného proteinu se vloží do vektoru obsahujícího mimo jiné vazebnou doménu transkripčního faktoru GAL4 a reportérový gen. Otevřený čtecí rámec druhého testovaného proteinu se vloží do vektoru s aktivační doménou transkripčního faktoru GAL4 a reportérovým genem. Testované proteiny se v kvasince exprimují s připojenou vazebnou doménou (BD) GAL4 nebo aktivační doménou (AD) GAL4. V případě, že tyto dva proteiny v buňce interagují, dojde k fyzickému přiblížení AD a BD a obnovení jejich funkce. Takto spolu mohou tyto domény aktivovat transkripční faktor GAL4 ve vnesených vektorech. Aktivovaný GAL4 následně aktivuje přepis reportérových genů v těchto vektorech, což kvasince propůjčí rezistenci k selekci. Více o metodě je možné si přečíst v článku (Gietz et al., 1997). V této práci byl k transformaci použit vektor pgbkt7 obsahující BD a reportérový gen TRP1 (umožňuje kvasince růst na selektivním médiu bez tryptofanu) a vektor pad obsahující AD a reportérový gen LEU2 (umožňuje kvasince růst na selektivním médiu bez leucinu). Transformované kvasinky obsahující interagující proteiny byly vysety na Petriho misky -TRP, -LEU. Interakce proteinů byla testována vykapávacím ředícím experimentem. Několik kolonií natransformovaných kvasinek bylo sterilním párátkem přeneseno do 500 μl sterilní ddh2o a rozmícháno. U jednotlivých vzorků byla změřena OD 600 a ředěním byla upravena na čtyři varianty. od každého vzorku tak vznikly čtyři mikrozkumavky, kdy v první mikrozkumavce byl roztok kvasinek a ddh2o s OD x 10-2, v druhé 5 x 10-3, ve třetí 5 x 10-4 a ve čtvrté 5 x Takto ředěné roztoky byly vykapány na misky s SD médiem -ADE -HIS -LEU -TRP a kultivovány přibližně pět dní ve 30 C. MIKROSKOPOVÁNÍ Mikroskopická pozorování byla prováděna na mikroskopu Nikon Eclipse Mikroskop 90i (kamera Andor). ke konfokální mikroskopii byl použit mikroskop Zeiss LSM 5 DUO 360 (Zeiss C-Apochromat x 50/1,2 W Corr objektiv) a odpovídající bariérové filtry. MĚŘENÍ TLOUŠŤKY BUNĚČNÉ STĚNY TRICHOMŮ Zralé adaxiální trichomy 6 týdnů starých rostlin pěstovaných na dlouhém dni byly snímány při zvětšení 20x. Tloušťka buněčných stěn trichomů byla odečítána v programu FiJi z pořízených fotografií. Byla měřena délka úsečky mezi špičkou trichomu a koncem cytoplazmy ve špičce trichomu, viz obr. 6. Obrázek 6: Způsob měření tloušťky buněčné stěny trichomu. 33

34 VÝSLEDKY ANALÝZA INZERČNÍCH MUTANTŮ ARABIDOPSIS V LOKUSU EXO70H4 POMOCÍ RT-PCR Z databáze inzerčních mutantů SALK byly použity dvě alely s T-DNA inzercí v kódující sekvenci EXO70H4 (AT3G09520). Alela exo70h4-1 s označením salk_ (T-DNA inzerce v místě bp na 3. chromozómu) a alela exo70h4-3 s označením salk_ (T-DNA inzerce v místě bp na 3. chromozómu), viz obr. 7. U některých rostlin třetí testované alely exo70h4-2 se projevoval nezávislý fenotyp, který nesegregoval s mutací exo70h4, a tak byla z důvodu podezření na přítomnost druhé mutace tato alela vyřazena. Zpěžné křížení WT s mutanty plodilo uniformní WT potomstvo. Tato klasická mendelovská segregace mutanta při kříženích s WT jednoznačně ukazovala, že se jedná o recesivní mutaci. Pro ověření ztráty transkriptu byla provedena kvalitativní RT-PCR. Gen EXO70H4 je kódován, stejně jako většina ostatních paralogů EXO70, pouze jedním exonem. Proto nebylo možné navrhnout primery pro RT-PCR tak, aby byly získány různě velké fragmenty z genomické DNA a cdna. Místo toho byl tedy vzorek RNA ošetřen DNÁzou I, aby byl zbaven možné kontaminace genomickou DNA. Absence genomické DNA byla potvrzena nepřítomností genomického fragmentu u kontroly (aktinu). Pomocí RT-PCR byla zjišťována přítomnost dvou fragmentů nacházejících se před a za inzercí exo70h4-3 (obr. 7 A). Detekce fragmentu před inzercí exo70h4-1 nebyla možná, protože tento fragment je příliš krátký. RT-PCR odhalila absenci N-terminálního fragmentu RNA u inzerce exo70h4-3. V případě inzerce exo70h4-1 byly přítomny oba fragmenty (obr. 7 B). U obou mutací se tedy v rostlinách vyskytují parciální transkripty. Vzhledem ke stejnému fenotypovému projevu u obou mutací však lze usuzovat, že obě inzerce vedou ke vzniku nefunkční RNA (u inzerce exo70h4-1 nejspíše chybí část se správným start kodonem). Jedná se tedy s velkou pravděpodobností o knock-down mutace. Obrázek 7: Kvalitativní RT-PCR mutanta exo70h4-1 a exo70h4-3. A: Inzerční mutace exo70h4-1 a exo70h4-3 rozrušují kódující sekvenci EXO70H4. Přerušovaná čára vyznačuje přepisovaný úsek při reverzní transkripci za použití primerů H4-N (počátek genu), tečkovaná čára vyznačuje přepisovaný úsek při reverzní transkripci za použití primerů H4-C (koncovější část genu). B: Výsledek kvalitativní RT-PCR. V prvním sloupci jsou vzorky z WT, v druhém sloupci z mutanta exo70h4-1 a ve třetím sloupci z mutanta exo70h4-3. První řádek ukazuje RT-PCR produkt aktinu jako vnitřního standardu. Druhý řádek je produkt RT- PCR při použití primerů H4-N. Třetí řádek je produkt RT-PCR při použití primerů H4-C (viz A). 34

35 POPIS ROSTLIN ARABIDOPSIS S MUTACÍ V LOKUSU EXO70H4 Mutace se fenotypicky projevuje pouze u recesivních homozygotů, heterozygotní rostliny nevykazují žádné fenotypové odchylky od WT. Jedná se tedy o recesivní, ztrátové (LOF - loss of function) mutace. Mutace exo70h4-1 a exo70h4-3 se projevují stejně, a to zeslabenou buněčnou stěnou trichomů. Mutace ovlivnila pouze trichomy, ostatní části rostliny mají nezměněnou velikost a vzhled, jelikož v ostatních částech rostliny není požadavek na funkčnost genu EXO70H4 tak silný jako u trichomů a případně dochází ke komplementaci dalšími paralogy EXO70. Pod světelným mikroskopem je možné pozorovat rozdíl v ukládání buněčné stěny v trichomech WT a mutanta. Rozdíly v tloustnutí stěny na bocích větví nebo na jejich bázi je málo patrný, ale dobře se pozoruje v apikální části větví. Špičky větví, ba dokonce skoro celé větve WT jsou postupně vyplňovány buněčnou stěnou, zatímco u mutantních trichomů k tomuto vyplňování nedochází, jak je vidět na obr. 8. Slabší buněčná stěna způsobuje, že jsou mutantní trichomy mnohem měkčí a ohebnější než trichomy WT, které jsou sekundární buněčnou stěnou zpevněné. Listy mutantů jsou proto znatelně jemnější na omak oproti drsným listům WT, u kterých pevné trichomy fungují pocitově jako struhadlo. Tvrdost trichomů byla testována také slepým experimentem, kde měl pozorovatel za úkol identifikovat v segregující populaci 40 rostlin jedince s měkkými trichomy. Ze 40 rostlin se podařilo pozorovateli ohmatáním listů určit všech 10 mutantních homozygotů. Dosud nebyly zpozorovány žádné jiné fenotypické odchylky. Povrchové papily na trichomech se u mutanta exo70h4 vytvářejí podle dosavadních pozorování normálně. Ani poruchy v jiné vývojové fázi trichomu nebyly objeveny. WT exo70h4-1 Obrázek 8: Buněčná stěna WT a mutanta exo70h4-1. Vlevo trichom WT s větvemi vyplněnými buněčnou stěnou až k místu větvení. Vpravo mutant exo70h4-1 se slabou buněčnou stěnou. 35

36 KVANTIFIKACE TLOUŠŤKY BUNĚČNÉ STĚNY TRICHOMŮ WT A MUTANTŮ EXO70H4 U 6 týdnů starých rostlin pěstovaných na dlouhém dni byly při dvacetinásobném zvětšení snímány zralé adaxiální trichomy. Tloušťka buněčných stěn trichomů byla z pořízených fotografií odečítána v programu FiJi. Byla měřena délka úsečky mezi koncem cytoplazmy a nejvzdálenějším bodem na špičce trichomu. Vyhodnocení výsledků potvrdilo signifikantní rozdíl mezi mutantem exo70h4-1 a WT, viz obr. 9. A C B Obrázek 9: Kvantifikace tloušťky buňečné stěny trichomů. A - WT, větev je vyplněna buněčnou stěnou skoro až ke své bázi; B - exo70h4-1, špička zůstává nevyplněna; C - graf naměřeného rozdílu ve vyplněnosti trichomových větví buněčnou stěnou, levý sloupec mutant exo70h4-1, pravý sloupec WT, osa Y - délka měřené úsečky v μm (p-value mezi vzorky je statisticky významný, p-value=7x10-10 ) DVOJITÍ MUTANTI S DALŠÍMI PODJEDNOTKAMI EXO70 Když mutace v EXO70H4 vyvolává ztenčení buněčné stěny trichomu, lze očekávat, že u dvojitých mutantů s dalšími podjednotkami EXO70 dojde k synergizmu a ještě výraznějšímu fenotypovému projevu. ke křížení byly vybrány paralogy EXO70B1 a EXO70H7, které jsou v trichomu další v pořadí nejvíce exprimované paralogy EXO70 dle (Jakoby et al., 2008). Z databáze inzerčních mutantů SALK byla použita alela s T-DNA inzercí v kódující sekvenci EXO70H7 (AT5G59730) a EXO70B1 (AT5G58430). Alela exo70h7-1 s označením salk_ (T-DNA inzerce v místě bp na 5. chromozómu) a alela exo70b1-2 s označením gabi_156g02 (T-DNA inzerce v místě bp na 5. chromozómu). 36

37 Linie exo70h7-1 x exo70b1-2 Po křížení rostlin mutantních v genu EXO70H7-1 s rostlinami mutantními v genu EXO70B1-2 se ukázalo, že tyto dva geny se nacházejí na stejném rameni chromozómu a z důvodu silné genové vazby by dvojitý mutant jen velmi obtížně segregoval. Proto nebylo potomstvo křížení exo70h7-1 x exo70b1-2 dále charakterizováno. Linie exo70h4-1 x exo70b1-2 Křížení rostlin mutantních v genu EXO70H4-1 s rostlinami mutantními v genu EXO70B1-2 bylo sice úspěšné, nemělo však viditelný vliv na fenotyp trichomů. Detailnější analýza byla znemožněna fenotypovým projevem mutace exo70b1-2, který zapříčiňuje předčasné odumírání listů. Jak se později ukázalo, paralog EXO70B1 je zapojen do autofagické dráhy a nevykazuje synergizmus ani s jinou izoformou EXO70, konkrétně s EXO70A1 (Kulich et al., 2013). Linie exo70h4-1 x exo70h7-1 Jediný úspěšně charakterizovaný dvojitý mutant, který mohl být podroben statistické analýze, byla linie rostlin mutantních v genu EXO70H4-1 s rostlinami mutantními v genu EXO70H7-1. Analýzou dvojitého mutanta exo70h4-1 x exo70h7-1se nepodařilo prokazatelně potvrdit hypotézu možného zesílení fenotypové odchylky zeslabené buněčné stěny trichomů. Při kvantifikaci tloušťky buněčné stěny WT, mutanta exo70h4-1 a dvojitého mutanta exo70h4-1 x exo70h7-1 vyšel jen statisticky neprůkazný rozdíl mezi jednoduchým a dvojitým mutantem, který však mohl být zapříčiněn nepřesností měření. VLIV UV ZÁŘENÍ NA VÝVOJ TRICHOMŮ WT A MUTANTA EXO70H4 Pěstování rostlin na UV způsobovalo u WT rostlin intenzivnější ukládání buněčné stěny a tedy výraznější vyplňování špičky trichomů a následně až celé větve. U mutantních rostlin exo70h4-1 a dvojitého mutanta exo70h4-1 x exo70h7-1 pěstovaných na UV a bez UV signifikantní rozdíl v tloustnutí buněčné stěny nenastal. Aby bylo dosaženo stejných kultivačních podmínek, byly pěstovány všechny rostliny, ozařované i kontrolní neozařované, ve stejném kultivačním boxu. Jak se však ukázalo, ke kontrolním rostlinám nejspíše pronikala část UV záření, jelikož se lišily od kontrolních rostlin v odděleném kultivačním prostoru. je také možné, že tento rozdíl způsobily reaktivní formy kyslíku, uvolňující se do kultivačního prostoru a pronikající ke kontrolním rostlinám. Výsledky třech vzorků zobrazuje graf na obr. 10, kde velmi slabé ozáření UV znamená podmínky, kde pravděpodobně došlo k nechtěnému ozáření UV a UV stres reprezentuje podmínky, kde došlo k přímému a prudkému ozáření. Záření UV tedy u mutantních rostlin tloustnutí buněčné stěny neindukovalo, zatímco u WT rostlin ano, viz graf na obr

38 Obrázek 10: Graf naměřeného rozdílu vyplněnosti trichomových větví buněčnou stěnou mezi rostlinami pěstovanými na UV záření a bez něj. Světle šedé (bez UV), středně šedé sloupce (velmi slabé ozáření UV), tmavě šedé sloupce (UV stres). První tři sloupce jsou hodnoty naměřené u WT rostlin, prostřední trojsloupec patří mutantovi exo70h4-3, pravý trojsloupec patří dvojitému mutantovi exo70h4-1 x exo70h7-1. Osa Y - délka měřené úsečky v μm. Hodnoty označené hvězdičkou se statisticky významně liší od WT, p-value < 1x10-5. Dále bylo testováno, jestli mutace v exo70h4-1 vede při pěstování na UV ke sníženému vzrůstu rostlin, stejně jako u jiných trichomových mutantů (Yan et al., 2012). Testováno bylo 44 mutantních rostlin a stejný počet kontrolních. Rozdíl mezi kontrolou a vzorkem byl však nepatrný a statisticky neprůkazný, viz graf na obr. 11. Obrázek 11: Plocha listů rostlin pěstovaných na UV. Světle šedé sloupce ukazují plochu listů WT, tmavě šedé sloupce plochu listů mutanta exo70h4-1. Jsou zobrazeny výsledky tří měření. Vlevo - na počátku umístění rostlin na UV; Uprostřed - po třech dnech ozáření rostlin UV; Vpravo - po 14 dnech ozáření. Osa Y - plocha listu v cm 2. Žádný z rozdílů není statisticky průkazný. 38

39 Bližší pozorování rostlin pěstovaných na UV přineslo ještě jedno zajímavé zjištění. V trichomech mutantů bylo zaznamenáno cytoplazmatického nahromadění váčků zatím neznámého charakteru, které by se dalo popsat jako intenzivní zácpa váčkového transportu, viz obr. 12. WT exo70h4-1 Obrázek 12: Trichomy rostlin pěstovaných na UV. Vpravo jsou u mutanta v cytoplazmě viditelné vezikuly. Vlevo u WT žádné viditelné vezikuly nejsou. BUNĚČNÁ LOKALIZACE YFP-EXO70H4 Pro sledování buněčné lokalizace byla nejdříve použita tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana pomocí konstruktu EXO70H4 s N-terminálním YFP pod ubiquitinovým promotorem (UBQ::YFP-EXO70H4). Protein EXO70H4 se kromě jádra a cytoplazmy lokalizoval do malých mobilních tělísek, která svou kinetikou a velikostí připomínala Golgiho aparát, viz obr. 13. Obrázek 13: Lokalizace YFP-EXO7OH4 (UBQ::YFP-EXO70H4) v Nicotiana benthamiana. Signál je vidět v cytoplazmě, v jádře a v malých mobilních tělíscích. Vlevo - GFP kanál, uprostřed - viditelné spektrum, vpravo - proložení obou kanálů. 39

40 Proto byla provedena druhá tranzientní transformace Nicotiana benthamiana, tentokrát společně s konstrukty UBQ::YFP-EXO70H4 a 35S::ST-RFP. Protein ST-RFP (sialyl transferáza) je buněčným markerem Golgiho aparátu a případná lokalizace YFP-EXO70H4 do Golgiho aparátu by se projevila prolnutím signálu RFP a YFP. Úspěšně natransformované listy byly pozorovány na konfokálním mikroskopu. Tato pozorování vyvrátila hypotézu lokalizace EXO70H4 v Golgiho aparátu, protože nedošlo ke kolokalizaci signálu RFP z konstruktu 35S::ST-RFP se signálem YFP z konstruktu UBQ::YFP-EXO70H4. Výsledek však nebyl čistě negativní. Jak je vidět na obr. 14, RFP signál značící Golgiho aparát se sice nepřekrýval s YFP signálem značícím EXO70H4, ale tyto dva signály spolu částečně asociovaly. Tato asociace byla viditelná také jako společný pohyb zeleného a červeného signálu. Protože s Golgiho aparátem je často asociován trans-golgi network, dala tato pozorování vzniknout nové hypotéze, že se EXO70H4 lokalizuje do trans-golgi network, které u rostlin funguje také jako časný endozom. Tuto hypotézu dále podpořily výsledky z kvasinkového dvouhybridního screenu. Obrázek 14: Částečná asociace EXO70H4 s Golgiho aparátem. Červený kanál 35S::ST-RFP (Golgiho aparát), zelený kanál UBQ::YFP-EXO70H4. KOMPLEMENTACE MUTACE EXO70H4-1 Mutantní linie exo70h4-1 rostliny Arabidopsis thaliana byly stabilně transformovány konstruktem UBQ::YFP-EXO70H4. Vyselektované transgenní rostliny byly pozorovány konfokálním fluorescenčním mikroskopem. V případě, že by exprese vneseného funkčního genu EXO70H4 dokázala zrušit projev fenotypu slabé buněčné stěny trichomů, znamenalo by to, že za tento fenotypový projev opravdu může mutace v genu EXO70H4. Ukázalo se však, že dochází pouze k částečné komplementaci fenotypu. Byla porovnávána tloušťka buněčné stěny trichomů WT, mutanta exo70h4-1 a mutanta exo70h4-1 transformovaného konstruktem UBQ::YFP-EXO70H4. Nejsilnější stěnu měly rostliny WT, nejslabší stěnu měly 40

41 rostliny mutanta a střední tloušťku měla buněčná stěna transformovaného mutant, viz. graf na obr. 15. Obrázek 15: Komplementace mutace exo70h4-1 konstruktem UBQ::YFP-EXO70H4. Levý sloupec - mutant exo70h4-1; Prostřední sloupec - mutant exo70h4-1 natransformovaný konstruktem UBQ::YFP-EXO70H4; Pravý sloupec - WT; Osa Y - délka měřené úsečky v μm (p-value jsou všechny menší než 0,0001, malé rozdíly jsou zapříčiněny malým vzorkem). HLEDÁNÍ POTENCIÁLNÍCH INTERAKTORŮ EXO70H4 A JEJICH IDENTIFIKACE POMOCÍ DVOUHYBRIDNÍHO SCREENU V KVASINCE K hledání možných interaktorů genu EXO70H4 byl využit kvasinkový dvouhybridní systém. Transformace kvasinek byla provedena ve dvou krocích. V primární transformaci byl do kvasinek vnesen konstrukt EXO70H4 v plazmidu pgbkt7. Výsledkem byli transformanti rostoucí na selekčním médiu (-TRP). do těchto kvasinek byla sekundární transformací přitransformována cdna knihovna CD4-30. Účinnost transformace dosáhla cca transformantů na 1 μg cdna. Celkem bylo použito 50 μg cdna knihovny a bylo získáno přibližně transformantů (v transformaci z celkem 20 replik na 20 Petriho miskách). k transformaci jedné Petriho misky bylo použito 2,5 μg cdna knihovny. Z těchto transformantů, vysetých na selekčním médiu pro selekci pozitivních interaktorů (-LEU-TRP- HIS-ADE), bylo náhodně vybráno 48 velkých kolonií, z nichž byla izolována DNA. Získaná DNA byla následně elektroporována do bakterií DH5α. Pomnožená DNA byla z bakterií úspěšně izolována jen u 44 vzorků. Tyto vzorky DNA byly sekvenovány. Analýza výsledků sekvenace ukázala, že v naprosté většině případů se jednalo o transkripční faktory a jiné známé pravděpodobné falešné pozitivy (konzultace s Mgr. Ivanem Kulichem). Z kandidátů byli pro další charakterizaci nakonec zvoleni tito tři: 1. TRS120 (AT5G11040, TRAFFICKING PROTEIN PARTICLE COMPLEX SUBUNIT 120) - jedna z podjednotek komplexu TRAPPII, který je důležitý pro transport váčků mezi Golgiho aparátem a trans Golgi network. 2. PYR1-LIKE 4 (AT2G38310, PYRABACTIN RESISTANCE1-LIKE 4) - jeden z komponentů receptoru kyseliny abscisové. 3. VDAC3 (AT5G15090, VOLTAGE DEPENDENT ANION CHANNEL 3) - jeden z pěti komponentů porinového kanálu vnější mitochondriální membrány. 41

42 Pro ověření interakce mezi EXO70H4 a těmito třemi potenciálními interaktory byl zopakován dvouhybridní test. Kvasinky byly společně natrasformovány EXO70H4 ve vektoru pgbkt7 s vazebnou doménou (BD) a jedním ze tří potenciálních interaktorů (TRS120, PYR1-LIKE 4 a VDAC3) ve vektoru pad s aktivační doménou (AD). Jako negativní kontrola byly použity kvasinky natrasformované prázdným vektorem pgbkt7 s BD a jedním ze tří potenciálních interaktorů ve vektoru pad s AD. Trasformované kvasinky byly vysety na Petriho misky se selekcí -LEU-TRP-HIS-ADE. Vyrostlé kolonie byly použity pro vykapávací ředící experiment, jehož výsledky potvrdily interakci pouze v případě TRS120, jak je vidět na obr. 16. Test interakce EXO70H4 s PYR1-LIKE 4 a s VDAC3 byl negativní, potenciální interakce tak nebyla potvrzena. Obrázek 16: Vykapávací ředící experiment ověřující interakci EXO70H4 s proteiny TRS120, PYR1-LIKE 4 a VDAC3. 1. řádek - interakce TRS120 s EXO70H4. 2. řádek - negativní kontrola, interakce TRS120 s prázdným vektorem. 3. řádek - interakce PYR1-LIKE 4 s EXO70H4. 4. řádek - negativní kontrola, interakce PYR1-LIKE 4 s prázdným vektorem. 5. řádek - interakce VDAC3 s EXO70H4. 6. řádek - negativní kontrola, interakce VDAC3 s prázdným vektorem. V prvním sloupci byly kvasinky ředěny do OD 600 0,05, další sloupce představují ředící řadu. TEST INTERAKCE TRS120 S DALŠÍMI PODJEDNOTKAMI EXO70 Pomocí dvouhybridního kvasinkového systému byly testovány možné interakce TRS120 a dalších podjednotek EXO70. Konkrétně se jednalo o podjednotky EXO70A1, EXO70B1 a EXO70B2. Pro zopakování dříve zjištěné interakce byla do tohoto testu zařazena i podjednotka EXO70H4. Na obr. 17 je vidět, že TRS120 neinteraguje s EXO70A1, ale interaguje s EXO70B1 i EXO70B2 a dle očekávání byl zopakován i pozitivní výsledek interakce s EXO70H4. Obrázek 17:Testování interakcí TRS120 a podjednotek EXO70A1, EXO70B1, EXO70B2 a EXO70H4. 1. řádek - interakce TRS120 s EXO70A1 2. řádek - interakce TRS120 s EXO70B1 3. řádek - interakce TRS120 s EXO70B2 4. řádek - interakce TRS120 s EXO70H4 42