Úvod do tkáňového inženýrství. Jana Horáková

Transkript

1 Úvod do tkáňového inženýrství Jana Horáková

2

3 Definice Interdisciplinární obor využívající znalostí inženýrství a přírodních věd k vývoji biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání nebo orgánů (Langer et Vacanti, 1993) Využití poznatků biologie, chemie, fyziky, inženýrství biomateriálů, počítačové technologie, medicíny.

4 Cíle (4R)

5 In vitro ve zkumavce Vysvětlení pojmů In vivo v živém organismu Scaffold nosič, podpůrná struktura pro růst buněk, popř. tkání Adheze přilnutí buněk, podmíněno přítomností specifických receptorů na povrchu buněk (adhezní proteiny) Proliferace buněčné dělení Diferenciace vývoj nespecializované buňky (kmenové) v buňku strukturně i funkčně specializovanou Kmenové buňky nediferencované buňky se schopností přeměny v jakýkoliv jiný buněčný typ

6 Proces tkáňového inženýrství 1. Izolace buněk 2. Kultivace buněk (2D) 3. Výroba scaffoldu 4. Osazení scaffoldu a následná kultivace (3D) 5. Implantace

7

8 1. Buňky Autologní zdrojem je sám pacient, imunotolerance Alogenní lidské buňky, nebezpečí rejekce implantované tkáně, přenosu infekce Xenogenní buňky jiného druhu (např. prasete) Primární Sekundární (buněčné kultury) Kmenové možnost diferenciace za využití růstových faktorů Tkáňově diferencované

9 Kmenové buňky (stem cells) Totipotentní schopnost vývoje ve všechny buněčné typy, např. embryonální kmenové buňky (ESC) Pluripotentní schopnost vývoje v několik buněčných typů (částečně diferencované), např. hematopoetické (HSC) kostní dřeň, krevní buňky; neuronální (NSC) neurony, gliové buňky; mesenchymální kmenové buňky (MSC) svaly, kosti, chrupavčitá tkáň, šlachy

10

11 1. Kostní dřeň Výskyt dospělých KB

12 2. Amniový vak 3. Pupečníková krev 4. Tuková tkáň 5. Bazální vrstva pokožky

13 Kultivace buněk in vitro Sterilní podmínky (jednorázový spotřební materiál, speciální chemikálie)

14 Snaha o napodobení přirozených podmínek v organismu Proliferace a růst buněk, příp. diferenciace do určitých typů buněčných linií (např. mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně kostní/nervová/chrupavčitá tkáň)

15

16 Podmínky kultivace Přísun cukrů, solí, aminokyselin, vitaminů, mastných kyselin, proteinů bikarbonátový pufrovací systém udržující ph v rozmezí 7,2-7,4 5% CO 2, 37 C ph indikátor: fenolová červeň růžová barva při optimálním ph žlutá-kyselé ph, filaová- zásadité ph Médium s obsahem 10-15% FBS (proteiny, růstové faktory) Přídavek směsi antibiotik/antimykotik

17 CO 2 inkubátor

18 Pasážování buněk Při dosažení 70-80% konfluence (souvislé vrstvy buněk) naředění buněk Uvolnění adherentních buněk od kultivačního povrchu i od sebe navzájem, přenesení do nové kultivační nádoby s čerstvým médiem Způsob: působení proteáz (trypsin), odstranění dvojmocných iontů (EDTAchelatačně váže Ca 2+, Mg 2+ )

19 Buňky v suspenzi po trypsinizaci 80% konfluence vhodné k pasážování

20 Růst buněk Růstová křivka: A - statická (lag) fáze: příprava na buněčné dělení B - exponenciální (log) fáze: intenzivní množení buněk do vyčerpání živin C - stacionární (plató) fáze: počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů D - fáze odumírání

21 Růstová křivka A-statická fáze B-exponenciální fáze C-stacionární fáze D-fáze odumírání T (osa x)=čas L (osa y)=počet buněk

22 Růst buněk při kultivaci in vitro Snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst počtu buněk) Kontaktní inhibice při dosažení konfluence Před dosažením plató fáze pasážování (naředění na takové množství, aby kultura opět rostla exponenciálně)

23 Uchovávání buněk (kryoprezervace) Možnost dlouhodobého uchovávání v hlubokomrazícím boxu (-80 C) nebo v parách kapalného dusíku (-196 C) Přidání kryoprotektiv (DMSO, glycerol) zabrání poškození krystaly vody při zmražování buněk Záloha při kontaminaci, načasování pokusů

24 Sterilizace Odstranění mikroorganismů z prostředí, ve kterém se pracuje s buněčnými kulturami Zásadní krok při kontaminaci buněčných kultur: destrukce buněk, pomalý růst, změna chování, přenos kontaminace na další buněčné kultury, Dodržování GLP-přesné a opakovatelné výsledky

25 Metody sterilizace Autoklávování UV záření 70% EtOH Ethylenoxid Plazma V praxi často kombinace metod Používání jednorázových sterilních prostředků

26 Kontaminace buněčných kultur Bakterie (přidávání antibiotik do kultivačních médií) viditelné v mikroskopu Mykoplasmata intracelulární parazité (nezjistitelné při mikroskopické kontrole), testování na přítomnost mykoplasmat Plísně, kvasinky (přídavek antimykotik) mikroskopie Viry vzácně, obtížná detekce

27 Opatření při kontaminaci Zpomalení proliferace, změna vlastností buněk Likvidace kultury Asanace laboratoře a inkubátoru Příprava nových kultivačních médií Obnovení kultury ze zmražené zálohy

28 Požadavky: Biokompatibilita 2. Scaffoldy Biodegradabilita (rychlost degradace úměrná rychlosti formování tkáně) Mechanická podpora Porézní struktura umožňující usazení buněk, jejich růst a migraci 3D struktura

29

30 Scaffoldy Důležitý výběr vhodného materiálu (syntetický/přírodní), způsob výroby Snaha o napodobení přirozeného prostředí buněk v organismu

31 Materiály Syntetické: kyselina polyglykolová (PGA),kyselina polymléčná (PLA), a jejich kopolymery (PLGA), polykaprolakton (PCL) Biologické: Přírodní polymery: kolagen, fibrin, chitosan, alginát, glykosaminoglykany (GAGs), kyselina hyaluronová (HA) Acelulární tkáňové scaffoldy: ECM

32 A) Syntetické materiály Mechanická pevnost, odolnost Možnost modifikace tvaru a stupně degradace Hydrofobní povrch špatná adheze buněk

33 Polyestery Esterové vazby odbourávány hydrolýzou finální produkty mohou vyvolat zánětlivou reakci (vznikají kyselé produkty) PGA Hydrofilní struktura hydrolýza ve vodném prostředí za vzniku kyseliny glykolové Rychlá degradace možnost vzniku zánětu (kyselé produkty rozpadu)

34 PLA Hydrofobnější struktura pomalejší degradace Při rozpadu vzniká kyselina mléčná

35 PCL Nejpomalejší degradace, použití na dlouhodobější implantáty Degradací vzniká kyselina kapronová PCL microfibers (drawing) PCL micro/nanofibers (electrospinning)

36

37 B) Přírodní materiály Snadná buněčná adheze Přirozené pro lidský organismus nevyvolávají imunitní odpověď Rozpad na netoxické produkty, které jsou z těla přirozenou cestou vyloučeny Nedostatečná mechanická pevnost

38

39 Kolagen typ I Hlavní složka pojivové tkáně člověka zajišťující mechanickou podporu a flexibilitu tkáně (kůže, kosti) Fylogeneticky stálá sekvence aminokyselin a helikální struktura nevyvolává imunologickou odezvu organismu

40

41 GAGs Lineární polysacharidy Při vazbě na bílkoviny tvoří proteoglykany základní součást ECM Př.: kyselina hyaluronová (HA), chondroitin sulfát, dermatan sulfát, keratan sulfát, heparan sulfát, heparin Nejčastěji využívána HA snadná chemická modifikace, náhrada chrupavky

42

43 Chitosan Deacetylovaný derivát chitinu Celulóza Polysacharid tvořený glukózovými jednotkami Využití derivátů: acetylcelulóza, karboxymethylcelulóza

44 Decelularizace Způsob výroby scaffoldu Odstranění buněk z tkání zisk ECM Několik možných mechanismů: Fyzikální metody (zamražení, sonikace, tlak) Chemické metody (zásadité/kyselé prostředí, detergenty: Triton X-100, SDS, hypertonické/hypotonické prostředí) Enzymatické metody (trypsin, endo-, exonukleasy)

45

46 Extracelulární matrix (ECM) Mezibuněčná hmota Složena z proteinů (kolagen, elastin) a glykosaminglykanů (heparan sulfát, chondroitin sulfát, kyselina hyaluronová) a glykoproteinů (laminin, fibronektin) Fce: uchycení buněk, zajištění mezibuněčné komunikace, pružnost tkáně, podíl na diferenciaci buněk a vývoji embrya Zdroj: decelularizované tkáně

47

48 Osazení scaffoldu a následná kultivace Napodobování přirozených podmínek v organismu Přísun kyslíku a živin, vhodné ph, teplota a vlhkost, osmotický tlak Možnost přidání růstových faktorů, hormonů, specifických živin Využití bioreaktorů

49 Bioreaktory Udržování konstantních podmínek přísun živin, odvod zplodin metabolismu, kyslík, ph Fyzikální stilmulace tkáně diferenciace Dlouhodobá kultivace 3-4 měsíce Různé uspořádání dle požadovaného typu kultivace: spinner flask, rotating vessels

50

51 Implantace Vnesení scaffoldu osázeného buňkami do těla pacienta!zánětlivá reakce,imunologická reakce hostitele! Postupná degradace scaffoldu a obnovení nebo nahrazení ztracené funkce tkáně (biodegradabilní materiál nahrazen ECM produkovanou buňkami)

52 Regenerativní medicína Využití kmenových buněk pro léčbu onemocnění kardiovaskulárního a nervového systému, léčbu diabetu, jaterních onemocnění, nemocí kostí, kloubů, Zdroje kmenových buněk: kostní dřeň, embrya Postup: izolace kmenových buněk, vývoj ve specializované buněčné typy, implantace do poškozených orgánů Využití: Alzheimerova nemoc, Parkinsonova choroba, mrtvice, roztroušení skleróza,

53

54

55

56 Aplikace Alternativa k transplantacím 1. Vytvoření funkční tkáně mimo tělo pro pozdější implantaci-náhrada poraněné tkáně, např. kožní kryty pro léčbu popálenin 2. Implantace buněčného substrátu, který vyvolá regeneraci tkáně v organismu (využití růstových faktorů), např. podpora regenerace kostní tkáně 3. Vytvoření funkční tkáně za využití kmenových buněk, např. kosti, svalstvo, chrupavka, játra

57 Tkáňové inženýrství vybraných tkání 1. Chrupavka 2. Kost 3. Cévy 4. Srdeční chlopně 5. Kryty ran

58 1. Chrupavka

59 1. Chrupavka Omezená regenerační kapacita (nízká dostupnost chondrocytů-ukotveny v ECM kloubního povrchu, absence progenitorových buněk, avaskulární tkáň) Izolace autologních chondrocytů/bmsc (bone marrow stromal cells=buňky kostní dřeně) + polymerní 3D scaffold (PLA, PGA, PCL, kolagen) kultivace v bioreaktoru implantace

60 Chung C., Burdick J.A. Engineering cartilage tissue. Advanced Drug delivery Reviews, 2008.

61

62 2. Kost Využití: osteogenesis imprerfecta (mutace v genu pro kolagen typu I), osteoporoza (řídnutí kostí) Scaffold: mechanická pevnost, ideální velikost pórů, tvrdost, 3D struktura, PCL/HA+β-TCP (kyselina hyaluronová+β-trikalcium fosfát) Izolace mesenchymálních progenitorových buněk z kostní dřeně (BMSCs)- diferenciace osteoblasty/osteocyty-produkce mineralizované ECM (hydroxyapatit) a kolagenu

63 Criteria Biocompatibility Biodegradability Mechanical properties Function Ability to perform its function in the host tissue without eliciting any immune response Tunable rate of degradation to match growth of new bone tissue as scaffold gets replaced by new bone Sufficient mechanical strength to provide temporary support to the defect region and withstand in vivo loading forces Microarchitecture Osteoinductivity Porosity Surface properties Interconnected scaffold structures to uniformly distribute stresses throughout scaffold Osteoinductive properties to recruit and differentiate osteoprogenitors to the defect region Large surface area: volume and pore size to allow for tissue in-growth, neovascularisation, mass transport and osteogenesis Appropriate chemical and topographical properties for influencing cellular adhesion, proliferation and differentiation Liu Y. et al. Review: Development of clinically relevant scaffolds for vascularised bone tissue engineering. Biotechnology Advances, 2012.

64 ttp://

65 3. Cévy Limitováno možný vznikem trombů, chronického zánětu, rejekcí nebo špatnými mechanickými vlastnostmi Endotelové buňky, buňky hladkého svalstva (zajišťují vasoaktivitu cév a mechanickou pevnost při působení tlaku v oběhovém systému), cytokiny a růstové faktory, biodegradabilní polymery

66

67 1. Tunica intima Vnitřní vrstva tvořená endotelovými buňkami (EC=endothelial cells) Bazální membrána (kolagenní vlákna) Vnitřní elastická lamina

68 2. Tunica media Tvořena pojivovou a svalovou tkání Hladkosvalové buňky (SMC=smooth muscle cells) vazokonstrikce x dilatace Elastin, Kolagen Ohraničena vnitřní a vnější elastickou laminou

69 3. Tunica adventitia Kolagen, elastin; fibroblasty Obsahuje nervy, cévy (vasa vasorum)

70 Knitted polyester collagen-coated graft Heparin-bonded eptfe graft

71 U cév s malým průměrem (<6mm) nelze tyto náhrady využít Electrospinning PCL/kolagen Ju Y.M. et al. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials, 2010.

72 4. Srdeční chlopně Umělé srdeční chlopně-nebezpečí trombembolismu (celoživotně podávání antikoagulancií) Bioprotézy (např. transplantace prasečí chlopně): nevýhody-kalcifikace, změny struktury výhody-netrombogenní, neinfekční, delší životnost, přežívání buněk možnost růstu, regenerace, remodelace (využití především u dětských pacientů)

73 Přirozená struktura srdeční chlopně Proces tkáňového inženýrství srdeční chlopně Weber B., Hoerstrup S.P. Tissue Engineering of Heart Valves. Comprehensive Biomaterials, 2011.

74 5. Kůže Proces hojení ran: 1.reepitelizace 2.remodelace granulační tkáně 3.tvorba jizvy Epidermis schopna regenerace Dermis regenerace pouze v malé míře náhrada tkáně jizvou, která postrádá elasticitu a pevnost škáry Kožní náhrady zakrytí rány, stimulace regenerace dermis

75

76 Apligraf (Graftskin) Spodní vrstva tvořena kolagenem a lidskými fibroblasty (kožní buňky), které produkují ECM Horní vrstva tvořena lidskými keratinocyty, které dávají vzniknout epidermis Neobsahuje cévy, vlasové folikuly, melanocyty, potní žlázy Léčba diabetických vředů

77

78

79 Etické problémy Transplantace autologní štěpy, allogenní, xenogenní Umělé implantáty Tkáňové inženýrství Rozhodnutí o nejlepší možné léčbě Rozhodující faktory: stav pacienta, věk zvážení přínosu/risku

80 Morální principy 1. Nezávislost možnost svobodné volby 2. Prospěšnost 3. Spravedlnost a rovnoprávnost

81 Legislativa v ČR Transaplantační zákon č.285/2002 Sb. Zákon o lidských tkáních a buňkách č.296/2008 Sb. Kontrola: SÚKL Předpokládaný souhlas Národní registr osob odmítající dárcovství orgánů