Vyšetření endometriálních NK buněk průtokovou cytometrií. RNDr. Ivana Burešová (Setkání uživatelů Beckman Coulter - květen 2016)

Transkript

1 Vyšetření endometriálních NK buněk průtokovou cytometrií RNDr. Ivana Burešová (Setkání uživatelů Beckman Coulter - květen 2016)

2 NK buňky Popsány v 80. letech 20. století na základě studií spontánní anti-tumorové aktivity ve slezině myši Mají společný prekurzor s T-lymfocyty, ale nemají TCR Rozpoznávání vlastního od cizího pomocí repertoáru aktivačních a inhibičních receptorů Aktivační CD16 (FcγRIII), ad. Inhibiční receptory pro HLA I. třídy Stojí na pomezí nespecifické (cytotoxická aktivita) a specifické složky imunity (produkce cytokinů) Popisuje se 2 5 subpopulací (některé se objevují jen za specifických klinických podmínek např. při HIV infekci)

3 Subpopulace NK buněk v periferní krvi 90% - CD56dim, obvykle CD16+ vysoká cytotoxická aktivita produkují málo cytokinů 10% - CD56bright slabá cytotoxická aktivita produkují hodně cytokinů Exprimují odlišný repertoár receptorů pro cytokiny Původně byl za liniový znak NK buněk považován CD57 oligosacharid se zbytky sulfatované kys. glukuronové, bývá vázán na různé povrchové peptidy nebo lipoproteiny nyní marker určitého maturačního / funkčního stavu buňky přítomen také na subpopulaci CD3+8+ cytotoxických T-lymfocytů, které se objevují v souvislosti s chronickou antigenní stimulací podíl CD57+ T-lymfocytů i CD57+ NK buněk v cirkulaci přirozeně narůstá s věkem Lopez-Verges (2011) hypotéza: CD57+ NK buňky jsou paměťové buňky

4 Endometriální (děložní) NK buňky Endometrium děložní sliznice; sloupcový epitel, prostoupený tubulárními děložními žlázami; růst ovlivňován progesteronem (ten ovlivňuje i aktivitu NK buněk) Imunitní buňky v endometriu T-lymfocyty, makrofágy, NK buňky Fenotyp téměř výlučně CD56bright16-; zřejmě zcela unikátní subpopulace NK buněk jejich expresní profil se významně liší od expresního profilu obou periferních subpopulací (Koopman, 2003) jejich zastoupení roste během menstruačního cyklu s nejvyšším podílem v době časného těhotenství (70-80% v době implementace - zřejmě se podílejí na navození lokální imunosuprese a na vývoji trofoblastu (zevní vrstvy blastocysty) pokud nedojde k otěhotnění, asi 2 dny před začátkem menstruace začínají jevit známky nastupující buněčné smrti CD57+ NK buňky jsou zastoupeny jen málo; vyšší počty jsou považovány za abnormální

5 NK buňky a poruchy plodnosti Studie NK buněk v periferní krvi: podíly i absolutní počty; všech nebo aktivovaných CD69+ Studie endometriálních NK buněk hl. imunohistochemicky; podíly CD56+ i CD57+ buněk Metaanalýza (Seshadri, Sunkara, 2014): Potvrdili statisticky významně vyšší absolutní počet periferních NK buněk u neplodných a plodných žen (v % rozdíl nepotvrdili) Potvrdili statisticky významně vyšší podíl i absolutní počet periferních (ale ne endometriálních) NK buněk u žen s opakovanými potraty ve srovnání s kontrolami Neprokázali vliv NK buněk a jejich cytotoxické aktivity na úspěšnost IVF Závěr: je potřeba další výzkum a další data

6 Zadání od lékařů Kliniky reprodukční medicíny stanovit zastoupení CD57+ NK buněk ve vzorku endometria, později rozšířený o požadavek specifikovat blíže fenotyp těchto NK buněk Vzorek byl odebírán do 10 ml sterilního fyziologického roztoku Homogenizace vzorku v celoskleněném homogenizátoru Filtrace, redukce supernatantu Test vitality vzorku (+PI) Detekce NK buněk: 1) CD45PB / CD3F CD(16+56)+PE / CD57 AF647 2) PB PO FITC PE PC5.5 APC AF750 CD45 CD14 CD16 CD57 CD3 CD56 CD19 Inkubace 30min při 4 C, promytí, analýza

7 Test vitality vzorku detekce populace živých buněk, eliminace falešné pozitivity, dané autofluorescencí mrtvých buněk

8 Analýza 7-barevným protokolem 1) Live gate 2) CD45+ bb 3) eliminace dubletů 4) CD45+ 5) NK x T 6) CD16 x CD56 7) CD57 x CD56

9 Statistické vyhodnocení Do léta 2015 analyzováno celkem 61 vzorků od 60 žen s různými poruchami plodnosti žádné CD45+ buňky 3 (4,9%) velmi málo CD45+ buněk 15 (24,6%) dostatek CD45+ buněk pro další vyhodnocení 43 (70,5%) 4-barevný protokol 16 (26,2%) 7-barevný protokol 27 (44,3%) Počet načtených CD45+ buněk: med (min;max) = 395 ( )

10 Zastoupení jednotlivých populací počet vzorků v souboru med (min max) (% z CD45+nebo CD45+14-) B-lymfocyty (CD ) 27 2,6 (0 28,6) T-lymfocyty (CD3+) 43 50,8 (17,6 84,4) NK buňky (3-(16+56)+/3-19-) 43 41,9 (12,3 80,5) 72,2% 34,0% 21,3% 59,9%

11 CD56+ a CD57+ T-lymfocyty počet vzorků v souboru med (min max) (% z CD45+nebo CD45+14-) CD56+ T-lymfocyty 25 5,2 (1,4 29,0) CD57+ T-lymfocyty 43 14,4 (0,0 33,5)

12 CD56bright, CD56dim a CD57+ NK buňky počet vzorků v souboru med (min max) (% z CD45+/ CD45+14-) med (min max) (% z NK buněk) CD56bright NK buňky 15 28,5 (9,1 76,8) 85 (60,9 98,2) CD56dim16+/- NK buňky 15 3,8 (0,5 9,5) 10,5 (1,9 57,0) CD57+ NK buňky 43 1,3 (0 10,6)

13 CD57+ na CD56+ populacích buněk med (min max) CD57+CD56bright NK buňky 0,0 (0,0 0,7) CD57+CD56dim16+/- NK buňky 33,3 (5,6 55,6) CD57+ T-lymfocyty 18,2 (0,0 71,4)

14 Závěr Zadání částečně splněno vypracován protokol, který je dostatečně jednoduchý a přitom poskytuje se slušnou mírou úspěšnosti statisticky hodnotitelné výsledky Výhoda mnohobarevné průtokové cytometrie umožňuje studovat jednotlivé fenotypové znaky ve vzájemných souvislostech Prokázalo se, že hledat v endometriu CD57+ NK buňky je nesplnitelný úkol Korelace jiných fenotypových nálezů s klinikou? sběr vzorků pokračuje.

15 Děkuji za pozornost a firmě Beckman Coulter za pozvání