Stanovení cytokinů v nitrooční tekutině pomocí multiplexové xmap analýzy

Transkript

1 Stanovení cytokinů v nitrooční tekutině pomocí multiplexové xmap analýzy Sobotová M. 1, Hecová L. 1, Vrzalová J. 2, Rusňák Š. 1, Říčařová R. 1, Topolčan O Oční klinika FN a LF UK Plzeň přednosta: doc. MUDr. Říčařová Renata, CSc., FEBO 2. Oddělení nukleární medicíny, Imunoanalytická laboratoř, FN a LF UK Plzeň přednosta: prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc.

2 Stanovení cytokinů v nitrooční tekutině pomocí multiplexové xmap analýzy Studie č. I - pacienti s komplikacemi proliferativní diabetické retinopatie (PDR) Studie č. II - pacienti s odchlípením sítnice s přítomnou proliferativní vitreoretinopatií (PVR)

3 Proliferativní diabetická retinopatie studie č. I Nejčastější příčinou slepoty pacientů v produktivním věku (oslepnou až 2% diabetiků) Hlavním projevem neovaskularizace sítnice a zrakového nervu

4 Proliferativní diabetická retinopatie Hypoxie stimuluje tvorbu pro-angiogenních růstových faktorů a cytokinů Novotvořené cévy jsou fragilní a nezajišťují dostatečné krevní zásobení sítnice Komplikace PDR - krvácení do sklivce - trakční odchlípení sítnice - neovaskulární glaukom

5 Diagnostika a monitorace proliferativní diabetické retinopatie Biomikroskopické vyšetření očního pozadí na štěrbinové lampě Fluorescenční angiografie

6 Diagnostika a monitorace proliferativní diabetické retinopatie Závažnost hypoxie sítnice - lze určit na základě koncentrací biomarkerů v nitrooční tekutině

7 Cíl studie č.i Stanovení pro-angiogenních, anti-angiogenních, prozánětlivých a neurotropních faktorů v nitrooční tekutině pacientů v různých stádiích PDR pomocí multiplexové xmap analýzy

8 Soubor pacientů - studie č.i 62 očí 56 pacientů (33 mužů a 23 žen ve věku let) léčených pro komplikace PDR v letech skupina: 41 očí 37 pacientů s PDR bez nutnosti opakované chirurgické intervence 2. skupina: 11 očí 9 pacientů s recidivujícím krvácením do sklivce

9 Soubor pacientů - studie č.i 3. skupina: 10 očí 10 pacientů s neovaskulárním glaukomem refrakterním na léčbu Kontrolní skupina (skupina 0): 50 očí 50 pacientů před operací senilní katarakty bez jiné oční patologie

10 Metodika - studie č. I Aspirace 0,05ml nitrooční tekutiny z přední komory oka za aseptických kautel před plánovanou nitrooční operací pro komplikace PDR a před operací šedého zákalu Bezprostředně po odběru vzorek zmražen na - 70 C

11 xmap Multiplexová analýza Metoda kombinující průtokovou cytometrii a imunoanalýzu Umožňuje stanovit až 96 analytů ve vzorcích o velmi malém objemu

12 Metodika - studie č. I Pro-angiogenní cytokiny Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), Epidermální růstový faktor (EGF), Fibroblast growth factor 2 (FGF 2), Platelet derived growth factor (PDGF) AA, PDGF AA / AB, Interleukin 8 (IL-8) Anti-angiogenní cytokiny y interferon inducible protein (IP-10), Transforming growth factor beta (TGFβ)

13 Metodika - studie č. I Prozánětlivé cytokiny Interleukin 6 (IL-6), Monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), Tumor necrosis factor alpha (TNFa), RANTES Neurotropní cytokiny - Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Ciliary neurotrophic factor (CNTF)

14 Výsledky - studie č.i Výsledky zpracovány pomocí Kruskal- Wallis a Mann-Whitney testu Hladina statistické významnosti p < 0,0001 Hraniční hladina významnosti p = 0,05-0,0001

15 Výsledky - studie č.i BDNF (pg/ml) CNTF (pg/ml) EGF (pg/ml) IL-6 (pg/ml) IL-8 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) MCP-1 (pg/ml) PDGF AA (pg/ml) TGF β1 (pg/ml) VEGF (pg/ml) Skupina Median 5-95 P Median 5-95 P Median 5-95 P Median 5-95 P

16 Výsledky studie č. I - skupina č. 1 vs. kontrolní skupina 0 Skupina Statistická významnost p < VEGF (pg/ml) PDGF AA (pg/ml) IL-8 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) 0 1 Mann-Whitney test Median Median p < p < p < p < IL-6 (pg/ml) p <0.0001

17 Výsledky studie č. I- skupina č. 1 vs. kontrolní skupina 0

18 Výsledky studie č. I skupina č. 3 vs. skupina č.1 Skupina Statistická významnost p < Mann-Whitney test IL-6 (pg/ml) TGF β1 (pg/ml) VEGF (pg/ml) Median Median p = p = p =

19 Výsledky studie č. I Mezi skupinou č. 1 a skupinou č. 2 nebyly zaznamenány statisticky signifikantní rozdíly V jednotlivých skupinách nebyly zaznamenány signifikantní rozdíly v koncentracích BDNF, CNTF, EGF, MCP-1 Koncentrace PDGF AA/AB, FGF-2, IL-10, TNF α a RANTES byly ve všech skupinách pod limitem detekovatelnosti

20 Souhrn - studie č. I U pacientů s PDR byla prokázána vyšší koncentrace pro-angiogenních, antiangiogenních a prozánětlivých biomarkerů oproti kontrolní skupině (IL-6, IL-8, IP-10, PDGF AA, VEGF, TGF β1)

21 Souhrn studie č. I U pacientů s refrakterním neovaskulárním glaukomem byla prokázána vyšší koncentrace IL-6, VEGF a TGF β1 v porovnání s ostatními pacienty s PDR Lze předpokládat, že koncentrace těchto 3 faktorů koreluje se závažností PDR

22 Odchlípení sítnice s proliferativní vitreoretinopatií studie č. II Defektem v sítnici proniká tekutina, která způsobí elevaci sítnice Léčba pouze chirurgická, pokud není včas zahájena, dojde k trvalé ztrátě zraku

23 Odchlípení sítnice s proliferativní vitreoretinopatií Proliferativní vitreoretinopatie - proliferací gliálních buněk nebo buněk retinálního pigmentového epitelu dochází na povrchu sítnice k tvorbě membrán, které kontrahují sítnici

24 Proliferativní vitreoretinopatie Je hlavní příčinou neúspěchu operace odchlípené sítnice Může být přítomna před oční operací či vzniknout po operaci Předpokládá se, že přítomnost a aktivita PVR u odchlípené sítnice je ovlivněna koncentrací prozánětlivých cytokinů a růstových faktorů

25 Cíl studie č. II Stanovení pro-angiogenních, anti-angiogenních, prozánětlivých a neurotropních faktorů v nitrooční tekutině pacientů s odchlípenou sítnicí s různým stupněm závažnosti proliferativní vitreoretinopatie pomocí multiplexové xmap analýzy

26 Soubor pacientů - studie č. II Skupina č. 1 (celkový soubor) - 27 očí 26 pacientů s odchlípením sítnice operovaných v letech Skupina č očí s odchlípením sítnice s proliferativní vitreoretinopatií stádia C a D

27 Soubor pacientů - studie č. II Skupina č očí s odchlípením sítnice s proliferativní vitreoretinopatií nižšího stádia (A,B) Kontrolní skupina 31 očí 31 pacientů před operací šedého zákalu

28 Metodika - studie č. II Aspirace 0,05ml nitrooční tekutiny z přední komory oka za aseptických kautel před nitrooční operací odchlípené sítnice a před operací šedého zákalu Bezprostředně po odběru vzorek zmražen na - 70 C Vzorky byly zpracovány xmap multiplexovou analýzou

29 Metodika - studie č. II Analyzované faktory: - VEGF, EGF, FGF 2, PDGF AA, IL-8, IP-10, TGF β1, IL-6, MCP-1, CNTF, BDNF, IL-10

30 Výsledky - studie č. II Výsledky zpracovány pomocí Kruskal- Wallis a Wilcoxonova testu Hladina statistické významnosti p < 0,05

31 Výsledky - studie č. II Cytokin Kontrolní skupina (0) Skupina č.1 Skupina č.2 Skupina č.3 neparametrická ANOVA (p faktor) EGF x x 0,0021 EGF x x 0,4139 FGF2 x x 0,0006 FGF2 x x 0,2321 IL-6 x x 0,0001 IL-6 x x 0,6657 IL-8 x x 0,0001 IL-8 x x 0,5471 IL-10 x x 0,3041 IL-10 x x 0,3063 IP-10 x x 0,0001 IP-10 x x 0,1142 MCP-1 x x 0,0001 MCP-1 x x 0,7905 PDGF AA x x 0,3526 PDGF AA x x 1,0000 VEGF x x 0,1453 VEGF x x 0,0151 BDNF x x 0,2019 BDNF x x 0,6775 CNTF x x 0,0314 CNTF x x 0,4818 TGF B1 x x 0,0085 TGF B1 x x 0,6908

32 Výsledky - studie č. II Kontrolní skupina Skupina č. 2 Skupina č. 3

33 Statisticky byla prokázána závislost výše uvedených faktorů i na věku pacienta, pouze hladina MCP-1 byla na věku nezávislá. Lze předpokládat, že právě tento faktor je vhodný ke stanovení rizika rozvoje PVR Souhrn - studie č. II U pacientů s PVR byla prokázána signifikantně vyšší koncentrace MCP-1, IP-10, IL-8, IL-6, FGF 2, EGF, TGF β1 a CNTF oproti kontrolní skupině

34 Souhrn - studie č. II Mezi pacienty s PVR a kotnrolní skupinou nebyl zjištěn signifikantní rozdíl v koncentracích IL-10, PDGF AA, BDNF U pacientů s PVR vyššího stádia je signifikantně vyšší pouze koncentrace VEGF v porovnání s pacienty s PVR nižšího stádia

35 Závěr Stanovení koncentrace biomarkerů v nitrooční tekutině je významné pro management léčby některých očních onemocnění - umožňuje lepší stratifikaci pacientů a tím vhodnější načasování terapie i volbu terapeutického postupu

36 Závěr Stanovení koncentrace nitroočních cytokinů umožňuje efektivnější monitoraci průběhu onemocnění pacientů s PDR Multiplexová analýza se jeví jako vhodná metoda ke stanovení koncentrací velkého množství analytů ve vzorku o velmi malém objemu (10-50ul)

37 Děkuji za pozornost