TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTU

Transkript

1 TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTU Název pilotního projektu: VYUŽITÍ KYSELINY PEROCTOVÉ V TECHNOLOGII CHOVU KAPRA OBECNÉHO (CYPRINUS CARPIO L.) Registrační číslo pilotního projektu: CZ.1.25/3.4./

2 Příjemce dotace: Název nebo obchodní jméno: Rybářství Třeboň a.s. Adresa: Rybářská 81, Třeboň IČ: Registrační číslo pp: CZ.1.25/3.4./ Název pilotního projektu: VYUŽITÍ KYSELINY PEROCTOVÉ V TECHNOLOGII CHOVU KAPRA OBECNÉHO (CYPRINUS CARPIO L.) Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna příjemce dotace zastupovat: Ing. Josef Malecha, Vědecký subjekt: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, Vodňany IČ: Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna vědecký subjekt zastupovat: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. Zpracovatel technické zprávy pilotního projektu: Název nebo obchodní jméno: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod Adresa: Zátiší 728/II, Vodňany IČ: Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, Jména a příjmení osob, které zpracovaly technickou zprávu: MVDr. Eliška Zusková, Ph.D. Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna zpracovatele technické zprávy zastupovat: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. 2

3 Souhlas s publikací technické zprávy: Souhlasím se zveřejněním této technické zprávy pilotního projektu v rámci opatření 3.4. Pilotní projekty z Operačního programu Rybářství na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a s využíváním výsledků této technické zprávy všemi subjekty z odvětví rybářství. Podpis osoby oprávněné zastupovat: 1. Příjemce dotace: Ing. Josef Malecha 2. Partnera projektu (vědecký subjekt): prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. 3. Zpracovatele technické zprávy: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc. 3

4 Obsah: 1. CÍL Co je cílem pilotního projektu V čem tkví inovativnost testované technologie Proč je nutná inovace, která je předmětem testování Ú METODIKA A VÝSLEDKY ZÁVĚR PŘÍLOHY

5 1. Cíl 1.1. Co je cílem pilotního projektu Cílem projektu je začlenit inovativní technologii preventivně - terapeutických opatření do chovu kapra obecného. Navržené inovativní technologie mají snížit ztráty vzniklé napadením ryb a jiker patogenními činiteli, mezi které řadíme plísně, bakterie, parazity a viry, a tím zvýšit efektivitu chovného procesu. Technologie musí splňovat parametry dlouhodobé udržitelnosti spolu s minimálním zatížením vodního prostředí a ryb. V případě úspěšné realizace záměru projektu budou nové technologie aplikovatelné pro všechny chovy, které se každoročně potýkají se zvýšenými ztrátami ryb způsobenými vybranými infekčními agens. Technologie tedy může sloužit jako modelová při řešení obdobných problémů spojených se zvýšenými ztrátami ryb z infekčních důvodů V čem tkví inovativnost testované technologie Inovativnost projektu spočívá v ověření univerzálně platných postupů, které budou lépe chránit jikry, juvenilní, remontní, generační a tržní ryby před působením patogenních agens. Takto inovované chovatelské postupy mají za cíl vytvořit stabilní preventivně terapeutickou technologii odchovu kapra obecného. Pilotním projektem ověřená technologie může následně sloužit jako modelová pro další chovy Proč je nutná inovace, která je předmětem testování Dostupná léčiva pro ryby mají často nejasné složení a nedefinované nebo neúplné aplikační schéma, které je v praxi těžko využitelné. V důsledku zavedení preventivních léčebných postupů s kyselinou peroctovou dojde ke snížení ekologického zatížení životního prostředí zejména následnou aplikací antibiotik a léčiv, která se z prostředí a organismů odbourávají dlouhou dobu. Dále předpokládáme snížení ekonomických nákladů vydaných za dosud užívaná terapeutika, která mnohdy nemají proti danému patogennímu agens ani ověřenou účinnost. Zavedením testované inovativní technologie dojde k poklesu ztrát zejména u mladších věkových kategorií ryb, a tím následně ke zvýšení stávající produkce 5

6 kapra obecného. Zároveň ověřená technologie pilotním projektem může následně sloužit jako modelová při řešení obdobných problémů v jiných odchovnách. Zavedením systému s důslednější prevencí dojde k zlepšení podmínek pro odchov a produkci kapra obecného. 6

7 2. Úvod V rámci pilotního projektu byla testována technologie chovu kapra obecného s využitím postupu založeného na preventivní aplikaci kyseliny peroctové do vodního prostředí za účelem snížení ztrát jiker a ryb v průběhu chovného procesu. Z dosavadních výsledků se kyselina peroctová jeví jako vhodný preventivně terapeutický prostředek pro ošetření jiker a ryb v boji proti ektoparazitům, bakteriím a plísním. Technologie byla přizpůsobena konkrétním podmínkám daného chovného zařízení s možnou aplikovatelností v dalších podobně zaměřených odchovnách ryb. Sudova, E; Straus, DL; Wienke, A; Meinelt, T. 21. Evaluation of continuous 4-day exposure to peracetic acid as a treatment for Ichthyophthirius multifiliis. PARASITOLOGY RESEARCH 16 (2): Meinelt, T; Matzke, S; Stuber, A; Pietrock, M; Wienke, A; Mitchell, AJ; Straus, DL. 29. Toxicity of peracetic acid (PAA) to tomonts of Ichthyophthirius multifiliis. DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS 86 (1): Verner-Jeffreys, DW; Joiner, CL; Bagwell, NJ; Reese, RA; Husby, A; Dixon, PF. 29. Development of bactericidal and virucidal testing standards for aquaculture disinfectants. AQUACULTURE 286 (3-4): Meinelt, T; Staaks, J; Staaks, G; Stueber, A; Braunig, I. 27. Anti-parasitic effects of peracetic acid (PAA) to free infective stages (Theronts) of the white spot disease, Ichthyophthirius multifiliis in vitro. DEUTSCHE TIERARZTLICHE WOCHENSCHRIFT 114 (1): Yi, Yang-Lei; Lu, Cheng; Hu, Xue-Gang; et al. 212: Antiprotozoal activity of medicinal plants against Ichthyophthirius multifiliis in goldfish (Carassius auratus) PARASITOLOGY RESEARCH, 111 (4), Marchand, Pierre-Andre; Thuy-My Phan; Straus, David L.; et al. 212: Reduction of in vitro growth in Flavobacterium columnare and Saprolegnia parasitica by products containing AQUACULTURE RESEARCH, 43 (12), Zusková, E., Máchová, J., Velíšek, J., Gela, D., 211. Možnosti využití kyseliny peroctové v rybářské praxi. FROV JU Vodňany, Edice Metodik, č. 19, 26 s. 7

8 3. Metodika a výsledky V laboratorních podmínkách výzkumného subjektu FROV VÚRH Vodňany byly provedeny následující testy: 1) testy toxicity Metodika: Byly provedeny testy akutní toxicity na vodních organismech (Cyprinus carpio) standartní a modifikovaná verze (použití larválního stadia kapra obecného). Dále byl proveden modifikovaný embryolarvální test na kapru obecném. Jako testovaná látka byl použit přípravek Persteril 36%, který obsahuje kyselinu peroctovou (CH3 CO3 H), peroxid vodíku (H2 O2 ) a kys. octovou (CH3 CO2 H). Testy byly prováděny dle směrnic OECD v laboratoři akreditované Českým institutem pro akreditaci o.p.s. pro testy akutní toxicity na vodních organismech. Metodicky bylo postupováno podle standardního operačního postupu, který vychází z norem: ČSN EN ISO Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby - OECD 23 ČSN EN ISO 1289 ( ) - Jakost vod - Stanovení toxicity pro embryonální a larvální stadia sladkovodních ryb - OECD 21 (modifikce viz níže) Podmínky modifikovaného embryolarválního testu teplota vody 18-2 C, nasycení vody kyslíkem 65-98%. Jikry byly po dobu 4 dnů vystaveny koncentraci odpovídající 1, 2 a 3mg/l KPO. V dalším průběhu byla již vývojová stadia ponechána na čisté vodě. Test probíhal 34 dní. V průběhu testu (den 9, 19, 25, 31 a 34) byly embrya a larvy odebírány a fixovány ve formalínu za účelem přesného zkoumání fáze ontogenetického vývoje a popisu růstových a morfologických změn. Výsledky: Na podkladě výsledků modifikovaného embryolarválního testu nebyl u žádné z testovaných koncentrací zaznamenán negativní vliv KPO na líhnivost a životaschopnost embryí. Sledované parametry ontogeneze byly u všech skupin srovnatelné s kontrolou. Výsledky testů akutní toxicity jsou uvedeny v tabulce 11. Na podkladě provedených testů a z hlediska speciálních rizik lze Persteril dle zákona č. 356/23 Sb., o chemických látkách a přípravcích ve znění pozdějších předpisů a jeho prováděcí vyhlášky č. 389/28 Sb. označit větou R51: toxický pro vodní organismy 1 mg.l-1 < LC5 (EC5, ErC5) 1 mg.l-1. 8

9 Z výsledku testů vyplívá, že larvy kapra jsou vůči persterilu vysoce citlivé a aplikovaná koncentrace k tomuto vývojovému stadiu by neměla překročit 1 mg/l KPO (tj. 2,5 mg/l Persterilu). Persteril má nízký terapeutický index vyjadřující měřítko bezpečnosti léčiva je to poměr dávky léčebného přípravku, která vyvolává léčebný účinek, k dávce způsobující úhyn. Nízký terapeutický index Persterilu tedy znamená, že práh toxicity je blízko účinné léčebné dávce a při nedůsledné aplikaci zde hrozí riziko předávkování. Z těchto důvodů je třeba dbát na zvýšenou opatrnost při práci s léčivem a před každou aplikací Persterilu se raději poradit s odborníkem. Při aplikaci KPO je také nutné přihlédnout k možné přítomnosti zooplanktonu, který je vůči této látce nejcitlivější v období přechodu larev na přirozenou potravu tedy aplikaci KPO v terapeutických koncentracích nedoporučujeme. Tab.1: Výsledky provedených testů toxicity (doplněné i o další důležité organismy testované v předchozích letech) Název testu Použitý organismus Výsledek (mg/l Persterilu) Inhibiční test Desmodesmus subspicatus 72hIC5 = 4 Akutní imobilizační test Daphnia magna Straus 48hEC5 = 2 Test akutní toxicity Poecilia reticulata 96hLC5 = 7 Test akutní toxicity Cyprinus carpio 96hLC5 = 4 Test akutní toxicity larvy Cyprinus carpio 48hLC5 = 2,9 Příloha 1: Protokol testu toxicity k provedeným testům toxicity, fotodokumentace a grafické znázornění výsledků embryolarválního testu toxicity. 2) testy účinnosti KPO na jikrách kapra obecného Metodika: Pokus na jikrách probíhal v povýtěrovém období. Do čtyř kolébek o objemu vody 5 l bylo nasazeno vždy 5 skupin jiker v plastových kelímcích s otevřenou horní částí (nasazené jikry nebyly zpočátku z důvodů prevence manipulačního poškození přesně počítány, až při vyhodnocování byly výsledné přeživší a odumřelé počty jiker pro účely porovnání převedeny na procenta). Do kolébek byla aplikována KPO v den 1 a den 3, v koncentracích uvedených podle následujícího schématu: kolébka 1: kontrola (bez aplikace KPO) 9

10 kolébka 2: aplikace 1 mg/l KPO kolébka 3: aplikace 2 mg/l KPO kolébka 4: aplikace 3 mg/l KPO Během testu byla denně měřena teplota vody, která se pohybovala v rozmezí 12,5-16,5 C. Kolébky byly dostatečně vzduchovány. Každý druhý den byla obměňována polovina lázně (25l vody). V průběhu dní 6, 7 a 8 byly odstraňovány a počítány odumřelé jikry. Na závěr testu v den 9 byli spočítáni vykulení jedinci. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny analýzou variance (ANOVA) a multiple range testem (Statgraphics v. 5.). Výsledky: Statisticky významné rozdíly (P<.1) byly zaznamenány po aplikaci 3 mg/l KPO jak v počtu živých jiker, tak i v počtu vykulených jedinců (tabulka 2). Na konci testu se po dvakrát provedené aplikaci 3 mg/l KPO (den 1 a 3) snížil počet odumřelých jiker o 32%. Z výsledků vyplývá, že aplikace KPO v koncentraci 3 mg/l statisticky významně snižuje napadení jiker plísní. Tato použitá koncentrace se na podkladě testů toxicity jeví jako bezpečná pro aplikaci k jikrám zvýšenou opatrnost při aplikaci je však třeba dát na přirozený zooplankton. Tab.2: Mortalita a % vykulených jedinců v jednotlivých koncentracích SKUPINA MORTALITA ± SD (%) VYKULENÍ JEDINCI (%) kolébka 1 (kontrola) kolébka 2 (1mg/l KPO) kolébka 3 (2mg/l KPO) kolébka 4 (3mg/l KPO) 7,4 ± 4,1 2,5 91,6 ± 6,6 1,2 95 ± 4,7 2,8 38,7± 7,3 17 Příloha 2: Fotodokumentace 3) testy vyhodnocování vlivu KPO na plůdku kapra obecného (šupinaté a lysé formy) pomocí hematologických a biochemických ukazatelů a na podkladě histopatologického vyšetření kůže Metodika: Celkem 18 šupináčů (průměrná hmotnost - 244±58g) a 18 lysců (průměrná hmotnost - 114±29g) bylo rozděleno do šesti skupin po 6ti rybách a umístěno do 1l akvárií (3 akvária lysci a 3 akvária šupináči). Ryby byly jeden den ponechány na čisté 1

11 vodě, v průběhu dalších třech dnů byla vždy bezprostředně po výměně poloviny objemu vody do pokusných akvárií (skupiny S1, S2, L1, L2) aplikována kyselina peroctová (ve formě 36% Persterilu) dle následujícího schématu: skupina KS (kontrola šupináč): mg/l KPO skupina S1 (šupináč): 1 mg/l skupina S2 (šupináč): 2 mg/l skupina KL (kontrola lysec): mg/l KPO skupina L1 (lysec): 1 mg/l skupina L2 (lysec): 2 mg/l V průběhu testu byla denně (před výměnou vody) odebrána voda z akvárií pro stanovení vybraných hydrochemických ukazatelů kvality vody (CHSKMn, ph a NH4 +). Po 3 dnech aplikace byla rybám z ocasní cévy odebrána krev a ryby byly následně usmrceny. Dále byl vždy třem rybám z každé skupiny odebrán kus kůže se svalovinou, který byl bezprostředně po odběru fixován ve formalínu a odeslán na histopatologické vyšetření na VFU Brno. Odebraná krev byla heparinizována a dále použita na stanovení vybraných biochemických a hematologických ukazatelů. Biochemický profil krve byl stanoven z krevní plazmy získané odstředěním krve na biochemickém analyzátoru VETTEST 88 (IDEXX Laboratories Inc. U.S.A.) firmy Medisoft. Přístroj pracuje na principu suché chemické a kolorimetrické analýzy. Vyhodnocení probíhá na selektivních testovacích discích (Multi laier film slides, Kodak), laserovým čtením bar kódů. Stanoveny byly následující parametry: glukóza (GLU), celkové bílkoviny (TP), albuminy (ALB), celkové globuliny (GLOB), alanin aminotransferáza (ALT), kreatinkináza (CK), laktát dehydrogenáza (LDH), vápník (Ca2 +), hořčík (Mg2 +), anorganický fosfát (PHOS). Hematologické rozbory počet erytrocytů (RBC), koncentrace hemoglobinu (Hb), hematokrit (PCV), střední barevná koncentrace (MCHC), hemoglobin erytrocytu (MCH) a střední objem erytrocytu (MCV) - byly prováděny podle Jednotných metod hematologického vyšetřování ryb (Svobodová et al., 1991). Výsledky byly vyhodnoceny a porovnány statistickým programem STATISTICA (verze 8. pro Windows, StatSoft) za použití dvoucestného ANOVA testu a byly zde vyhodnoceny statisticky významné rozdíly na hranici významnosti (P<,5 a P<,1) 11

12 Výsledky: Po aplikaci KPO u šupinaté formy kapra obecného došlo ve skupině S2 k statisticky významnému poklesu hematokritu (P<,5). Další měřené hematologické a biochemické parametry se u šupinaté formy kapra nelišily. U kapra lysce došlo ke změnám pouze u některých biochemických ukazatelů. Po aplikaci KPO se snížila aktivita laktátdehydrogenázy a lehce se změnilo množství celkových bílkovin a hladiny iontů vápníku a hořčíku v plazmě. Změnu aktivity LDH lze přičítat spíše menšímu množství naměřených jedinců, kde se ve skupině KL a L1 podařilo naměřit jen 4 plazmy ze 6ti. Hydrochemické ukazatele vody se u žádné z testovaných skupin statisticky významně nelišily. Histologickým vyšetřením byla po aplikaci obou koncentrací KPO u lysé i šupinaté formy zjištěna myodystrofie v individuálně různém rozsahu a zmnožení pohárkových buněk v kůži. Zjištěné patologické změny jsou mírné a dá se předpokládat, že po ukončení léčby se změněné struktury navrátí do fyziologického stavu. Na podkladě změn se lysá forma kapra jeví jako citlivější k aplikaci KPO. Veškeré zjištěné změny hematologických a biochemických ukazatelů se však stále pohybovaly ve fyziologickém rozmezí a lze tedy konstatovat, že testované aplikační schéma KPO nemá výraznější negativní vliv na zdravotní stav žádné z testovaných forem kapra obecného. Příloha 3: Výsledková tabulka a grafy změn hematologických a biochemických ukazatelů Technologie preventivního dávkování KPO byla v provozních podmínkách Třeboňského rybářství testována na 3 vývojových kategoriích ryb (jikry, plůdek, remontní ryby). 1) Testování KPO na jikrách kapra obecného Metodika: Jikry kapra obecného byly umístěny do 1ti inkubačních lahví 2 řady po pěti lahvích. U pokusných jiker (1 celá řada) byla k jikrám 2x denně aplikována KPO v koncentraci 2 mg/l po dobu 3 dnů (do vykulení). Kontrolní skupiny byly ponechány na čisté vodě. Koncentrace KPO pro jikry byla zvolena na podkladě testů provedených v laboratorních podmínkách výzkumného subjektu FROV, VÚRH Vodňany přihlédnuto bylo k teplotě vody 2 C. Na konci pokusu byla hodnocena míra oplozenosti jiker v jednotlivých skupinách. Test byl proveden na jikrách lysé formy kapra obecného (M2 x M72) a na jikrách formy šupinaté (Tš x Tš) 12

13 Výsledky: Míra oplozenosti jiker byla posuzována na podkladě manuálního odstraňování uhynulých jiker (objem odstraněných jiker/objemu nasazených) z aplikované a kontrolní skupiny a následného procentuálního zhodnocení. Tab.3: Přehled účinnosti testovaných antimykotik % odstraněných jiker kontrola pokus (M2 x M72) 12% 5% (Tš x Tš) 14% 8% Koupele jiker v kyselině peroctové nebyly náročné. Jikry dobře snášely KPO, a tudíž nebylo nutné zasahovat do procesu inkubace. V pokusné skupině byl pozorován větší počet zdravých jiker, přesto i zde docházelo k mírným ztrátám několik chomáčů zaplísněných jiker. Embryo z ošetřených jiker vykazovalo vysokou kvalitu bez známek malformací. Na podkladě výsledků se kyselina peroctová jeví jako vhodný prostředek k ošetřování jiker kapra obecného. Příloha 4: Fotodokumentace 2) Testování KPO na plůdku kapra obecného se zaměřením na monitoring kvality vody Metodika: Pokus probíhal v 6ti akváriích s objemem vody 6 litrů, kam bylo umístěno vždy 5 ks kapra K2 o průměrné hmotnosti 392g. Voda do akvárií byla dovezena z chovného zařízení Mokřiny běžně používaná pro odchov jiker. Každé akvárium bylo dostatečně provzdušňováno. V průběhu čtyřdenního testu byla do pokusných akvárií denně aplikována KPO v koncentraci 1 mg/l, a to 1x (skupina 1) a 2x (skupina 2) denně. Kontrolní skupiny (K1 a K2) byly ponechány bez aplikace KPO. Každý den před aplikací KPO byla odebrána voda pro stanovení následujících parametrů: amoniak, dusitany, CHSK Mn, BSK5. Výsledky: Neprokázal se žádný výrazný nebo jednoznačný efekt aplikace KPO na nejsledovanější hydrochemické parametry vody. Došlo zde k mírnému zvýšení CHSKMn ve všech aplikovaných pokusných akváriích, což je důsledek vnosu organické látky (kyseliny peroctové) do nádrže. O rychlém rozkladu a minimálnímu zatížení prostředí po 13

14 aplikaci KPO však svědčí fakt, že ve skupině 2 (oproti skupině 1) nedošlo k výrazně vyššímu navýšení z důvodů dvoufázové aplikace. Ze všech skupin se poněkud vymyká K1, kde pravděpodobně prostřednictvích došlo vzduchovacího k zanesení zařízení bakterií po schopných předchozím testu, nitrifikace kde byla (zřejmě zapojena recirkulace) - byl zde celou dobu pokusu nižší amoniak a nejvyšší dusitany a vysoká hodnota BSK5. Z důvodů kvalitní reprodukce testu tuto paralelní skupinu v některých grafech neuvádíme viz příloha 5. 3) Testování KPO na tržních rybách kapra obecného Metodika: Testování probíhalo opakovaně 3x v období červen - září 212. V období červenčervenec probíhal test na kv lysec, v srpnu na kv šupináč a v září na K3 lysec. Každý test trval 14 dní. Dospělé ryby, vážící 17±42g, byly po odlovu rozděleny do 2 žlabů (rozměry 2,2 x 6 x 1 m) a aklimatizovány po dobu jednoho týdne. Před aplikací bylo 5 ryb z každé skupiny parazitologicky vyšetřeno a byl zhodnocen jejich zdravotní stav. Druhý týden testu byla k pokusné skupině 2 x denně aplikována KPO v koncentraci 1 mg/l. Po dobu aplikace byl minimálně na 2 hodiny zastaven přítok vody do systému, aby se zde udržela aplikovaná koncentrace KPO. V průběhu testu pokusu byly odstraňovány odumřelé kusy. Na konci testu byla zhodnocena mortalita v kontrolní a pokusné skupině a byla zhodnocena parazitární prevalence u obou skupin. Výsledky: Pokus 1 - kv lysec Mortalita v obou skupinách dosahovala 1%. Teplota vody byla 21,5 C. Vylehčení ryb po pokusu 17,5%. U pokusných a kontrolních ryb bylo u některých jedinců patrné mírné zaplísnění zejména v místech mechanického poškození po manipulaci po vytažení z vody nebyla zaplísněná místa patrná. Po sedmidenní aplikaci KPO nebyly již u pokusné skupiny viditelné klasické plísňové nárosty, ale na některých místech byla jasně ohraničená červená ložiska předpokládáme, že tato ložiska zůstala na místech předchozího napadení plísní. Parazitologické vyšetření je uvedeno v tabulce 4. Pokus 2 kv šupináč Mortalita u kontrolní skupiny dosáhla 25%, u pokusné skupiny 5%. Teplota vody byla 23,5 C. Vylehčení ryb po pokusu 19,5%. Parazitologické vyšetření je uvedeno v tab

15 JIHOČESKÁ UNIVERZITAV ČESKÝCH Pokus 3 K3 lysec Mortalita u kontrolní skupiny dosáhla 12%, u pokusné skupiny 4%. Teplota vody byla 19 C. Vylehčení ryb po pokusu 8%. Parazitologické vyšetření je uvedeno v tab. 4. Tab. 4: Parazitologické vyšetření kůže a žaber před aplikací a po aplikaci KPO pokus Pokus 1 kv lysec skupina před aplikací kontrola 3ks Dactylogyrus spp ++ pokus Pokus 2 kv šupináč Pokus 3 K3 lysec 4ks Trichodina spp. ++ po aplikaci 3ks Dactylogyrus spp. + 3ks Trichodina ++ 4ks Dactylogyrus spp + 4ks Gyrodactylus ssp ks Gyrodactylus spp. ++ 2ks Diplozoon paradoxum + 1ks Diplozoon paradoxum + pokus 2ks Trichodina spp. + - kontrola 2ks Gyrodactylus spp. ++ kontrola pokus 4ks Trichodina spp. + 3ks Gyrodactylus spp. + 3ks Trichodina + 1ks Gyrodactylus spp. + Z výsledků je patrné, že aplikace KPO ve dvou testech významně snížila mortalitu ošetřených ryb (graf 1). Vliv aplikace taktéž znatelně snížil parazitární prevalenci. Graf 1: Grafické znázornění mortality u kontrolních a pokusných skupin Příloha 6: Fotodokumentace 15

16 4) Testování KPO na tržních rybách kapra obecného v povánočním období (prosinec 212) Metodika: V povánočním období byly kapři z prodeje vráceny na sádky a po dobu 1 týdne byla k pokusným rybám aplikována KPO v koncentraci 1 mg/l. Kontrolní ryby byly ponechány bez aplikované KPO. Po dobu aplikace byl minimálně na 2 hodiny zastaven přítok vody do sádky, aby se zde udržela aplikovaná koncentrace KPO. Před a po aplikaci byl posouzen zdravotní stav ryb. Výsledky: Mortalita v obou skupinách dosahovala 6%. Teplota vody byla 4 C. Hmotnost ryb 248±64g Na počátku testu bylo u pokusných a kontrolních ryb patrné poškození povrchu kůže v různém stupni (dáno manipulací ryb). Po týdenní aplikaci bylo u kontrolní skupiny viditelné zaplísnění, avšak fotografické vyhodnocení pomocí po vytažení z vody nebyla zaplísněná místa pro softwaru dobře identifikovatelná. Po sedmidenní aplikaci KPO k pokusné skupině byla na rybách viditelná ohraničená ložiska bez plísňových nárostů - narušení povrchu kůže však bylo stále patrné. Pro kvalitnější vyhodnocení by bylo zapotřebí tento test prodloužit alespoň o měsíc a aplikaci vyhodnotit na podkladě rozdílné mortality. Neméně zajímavé by bylo další sledování změn na kůži po jak dlouhé době od aplikace dojde k opětovnému zaplísnění nebo vyhojení ran. Příloha 7: Fotodokumentace 16

17 4. Závěr Závěrečné zhodnocení aplikace KPO k jednotlivým u kapra obecného lze shrnout takto: 1) Aplikace KPO k jikrám se osvědčila jako vhodná ke snížení ztrát způsobených zejména plísněmi rodu Saprolegnia. Při aplikaci je vždy nutné zohlednit hydrochemické parametry vody (zejména teplotu), na které jsou jikry inkubovány a podle toho upravit dávku KPO. Obecně lze říci, že čím je voda teplejší, tím účinnější bude aplikovaná koncentrace KPO při vyšších teplotách je tedy pro ošetření jiker zapotřebí nižší koncentrace KPO (do 2 mg/l KPO). Dále se prokázala závislost KPO na organickém znečištění vody při vyšším organickém zatížení je vhodné zvýšit aplikované dávky KPO (z důvodů jejich rychlé degradace) nebo lépe (z bezpečnostních důvodů) nižší doporučenou koncentraci KPO opakovat v kratších intervalech.. 2) Aplikace KPO k plůdku kapra šupináče a lysce poukázala na vyšší citlivost lysé formy kapra obecného ke kyselině peroctové v tomto případě půjde zřejmě o snazší narušení hlenové vrstvy kožního povrchu oproti rezistentnějšímu hlenovito - šupinatému povrchu kůže. Tato hypotéza by pro přesnější definování probíhajících procesů potřebovala provedení dalších pokusů s následnými podrobnějšími histologickými analýzami. 3) Aplikace KPO k tržním rybám je velice účinné preventivní opatření vhodné ke snížení celé škály parazitárních onemocnění u ryb. Rovněž se v testech průměrně o polovinu snížila mortalita ryb, která bývá způsobena infekcemi smíšenými (bakterie, parazité, viry, plísně) uplatňujícími se zejména při silném oslabení organismu. Této preventivně-aplikační technologie lze využít ve všech chovech ryb, kde se v určitém období pravidelně potýkají se zvýšenými ztrátami ryb v důsledku kombinovaných infekcí. V rámci parazitární účinnosti lze KPO použít zejména na parazity nevytvářející rezistentnější vývojové formy, jako jsou vajíčka a cysty. Zde je pak nutné aplikaci podpořit agresivnější terapií. Obecně lze říci, že preventivní aplikací KPO lze celou řadu onemocnění potlačit nebo minimálně zpomalit jejich rychlý průběh a poskytnout tak rybářům cenný čas k nastavení další strategie zlepšení zdravotního stavu ryb. 17

18 5. Přílohy Protokol k provedenému testu toxicity Tabulka průběhu testu toxicity na kapru obecném Koncentrace persterilu 4% (konc. KPO) Mortalita do 24 hodin Mortalita Mortalita 48 hodin 72 hodin 1 (,4) 2 (,8) 3 (1,2) Mortalita+ 96 hodin Celková mortalita (%) 4 (1,6) (2,) (2,8)

19 JIHOČESKÁ UNIVERZITAV ČESKÝCH Grafy mortality, růstu a hmotnosti kapra obecného v průběhu embryolarválního testu Fotodokumentace 19

20 Příloha 2 Aplikace KPO do kolébek s jikrami kapra obecného uložených v plastových nádobách Příloha 3 Výsledková tabulka naměřených hodnot biochemických a hematologických ukazatelů šupinatá forma kapra PCV Hb Ery MCV MCH MCHC TP ALB GLOB Ca PHOS Mg GLU ALT CK LDH l/l g/l T/l fl pg l/l g/l g/l g/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l μkat/l μkat/l μkat/l KS,27 ±,3a 62,96 ± 8,2a 1,27 ±,38a 225,35 ± 48,35a 52,8 ± 1,44a,23±,2a 23,33 ± 3,61a 1, ± 1,1a 22,17 ± 2,48a 2,2 ±,13a 1,69 ±,27a,88 ±,29a 4,95 ± 1,26a,21 ±,1a 27,93± 5,84a 7,42 ± 2,55a S1,26±,2ab 61,35 ± 6,95a 1,34 ±,15a 198,26 ± 2,99a 46,26± 5,46a,23 ±,1a 23,33 ± 2,34a 1,33 ± 1,3a 22, ± 1,41a 2,16 ±,11a 1,64 ±,11a,84 ±,4a 6,84 ± 1,33a,19 ±,11a 25,27 ± 3,31a 8,1 ± 5,38a 2 S2,22 ±,4b 52,82 ± 6,13a 1,9 ±,16a 199,86 ± 33,42a 49,39 ± 9,44a,25 ±,4a 25,33 ± 5,5a 2,33 ± 2,34a 23, ± 2,76a 2,32 ±,18a 1,52 ±,21a,9 ±,7a 5,9 ± 1,53a,29 ±,49a 28,2 ± 1,81a 5,67 ± 4,15a P <,5

21 JIHOČESKÁ UNIVERZITAV ČESKÝCH Výsledková tabulka naměřených hodnot biochemických a hematologických ukazatelů lysá forma kapra PCV Hb Ery MCV MCH MCHC TP ALB GLOB Ca PHOS Mg GLU ALT CK LDH l/l g/l T/l fl pg l/l g/l g/l g/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l μkat/l μkat/l μkat/l KL,29 ±,3a 67,26 ± 8,8a 1,22 ±,36a 266,68 ± 16,72a 58,69 ± 15,37a,23±,3a 2,67 ± 2,5ab,33 ± 1,52a 2,33 ± 2,16a 2,18 ±,16ab 1,81 ±,33a,93 ±,9a 5,99 ± 1,51a,35 ±,33a 27,69± 4,4a 15,67 ± 5,74a L1,29±,2a 66,7 ± 6,28a 1,31 ±,35a 231,74 ± 54,21a 52,41± 1,27a,23 ±,1a 17,5 ± 2,74a, ±,a 17,5 ± 2,74a 2, ±,4a 1,66 ±,16a,79 ±,5b 5,2 ± 1,26a,99 ± 1,96a 27,5 ± 2,83a 12,41 ± 6,75b L2,3 ±,5a 69,47 ± 8,42a 1,22 ±,2a 242,33 ± 44,79a 58,2 ± 6,88a,23 ±,2a 22,4 ± 3,58b 1,4 ± 1,52a 21,± 2,12a 2,32 ±,29b 2,21 ±,82a,93 ±,12a 5,65 ±,54a 1,11 ± 2,17a 25, ± 2,12a 6,62 ± 2,66ab P <,5 P <,5 P <,5 P <,5 Grafické zpracování nejvýznamnějších změn hematologických a biochemických ukazatelů 21

22 Příloha 4 Aplikace KPO k jikrám kapra obecného 22

23 JIHOČESKÁ UNIVERZITAV ČESKÝCH Příloha 5 Grafy sledovaných hydrochemických parametrů AMONIAK BSK5 DUSITANY CHSKMn 23

24 Příloha 6 Fotodokumentace testu na kv lysec Fotodokumentace testu na kv šupináč 24

25 Fotodokumentace testu na K3 lysec 25

26 Kontrola zdravotního stavu ryb Měření kyslíku a teploty 26

27 Příloha 7 Fotodokumentace Zdravotní prohlídka ryb před pokusem Pokusné a kontrolní sádky 27