Změny zánětlivých ukazatelů ve sputu pacientů se sezónní alergickou rýmou a intermitentním astmatem v závislosti na pylové sezóně

Transkript

1 Změny zánětlivých ukazatelů ve sputu pacientů se sezónní alergickou rýmou a intermitentním astmatem v závislosti na pylové sezóně Changes in inflammatory markers in induced sputum of patients with allergic rhinitis and bronchial asthma in relation to exposure to pollen season Ivana Malkusová 1, Petr Panzner 1, Vladimír Hraško 1, Miroslav Malý 2 Ústav imunologie a alergologie FN a LF UK Plzeň 1 Státní zdravotní ústav, Praha 2 Souhrn: Při expozici pylovým alergenům byl u polinotiků bez příznaků astmatu prokázán eozinofilní zánět v dolních dýchacích cestách. Monitorace alergického zánětu v průduškách je možná díky mikroskopickému vyšetření a stanovení ECP ve sputu. Vyšetřováním parametrů indukovaného sputa může být detekována přítomnost alergického zánětu v průduškách i u lehkých stupňů astmatu včetně asymptomatických pacientů. Klíčová slova: indukované sputum, alergický zánět, časná diagnostika, pylová sezóna Summary Changes in inflammatory markers in induced sputum of patients with allergic rhinitis and bronchial asthma in relation to exposure to pollen allergens were detected. Eosinophilic inflammation in lower airways of patients with polinosis without asthma symptoms during the exposure to pollen allergens were established. Monitoring of allergic inflammation in bronchies is possible thanks to evaluation of microscopic stainig and measurements of ECP levels in sputum. The parameters in induced sputum are altered also in mild asthma or even in asymptomatic patients. Key words: induced sputum, allergic inflammation, early diagnostic, pollen season Úvod Prevalence alergické rýmy je v České republice uváděna kolem 12,5, trpí jí 80 pacientů s astmatem. Prevalence astmatu se pohybuje kolem 8, pro astma je léčeno pacientů s alergickou rýmou. Intermitentní sezónní astma se projevuje pouze v souvislosti se sezónním výskytem vyvolávající příčiny - vzdušných alergenů (pylů, spór plísní), mimo sezónu jsou nemocní bez příznaků. U perzistujícího astmatu dochází k sezónnímu zhoršování. Na chronickém zánětu dýchacích cest u astmatu se podílejí lymfocyty (Th2) produkující řadu cytokinů (např. IL-4, IL-5, IL-10, IL-13), eozinofily, neutrofily, makrofágy a epitelové buňky. U polinotiků a astmatiků laboratorní známky zánětu dolních dýchacích cest často předcházejí příznakům onemocnění. Přítomnost alergického zánětu v dolních dýchacích cestách u pacientů s projevy pouze v nose a nazofaryngu byla již popsána v několika studiích a potvrzuje koncept jednotných dýchacích cest. V letech jsme se na našem pracovišti zabývali detekcí alergického zánětu u těchto pacientů pomocí vyšetřování buněčných i humorálních parametrů indukovaného sputa. Sledováním změn v počtu buněk (eozinofilů, makrofágů, neutrofilů) a humorálních markerů (ECP, cytokinů) v indukovaném sputu získaném před, během a po skončení pylové sezóny jsme se snažili ověřit hypotézu, že eozinofilní zánět dolních dýchacích cest je přítomný nejen ve sputu pacientů s astmatem, ale i u pacientů se sezónní alergickou rýmou bez symptomů astmatu. Předpokládali jsme, že eozinofilní zánět v průduškách trvá v menší intenzitě i mimo pylovou sezónu. U pacientů s intermitentním astmatem jsme očekávali změny v počtu leukocytů, zejména zvýšený počet eozinofilů a vyšší hladiny ECP, IL-4, IL-5 a IL-13, nižší hladiny IL-10. Podobné, ale méně vyjádřené změny jsme předpokládali u pacientů s alergickou rýmou. 96

2 Materiál, metody Byly vyšetřeny tyto skupiny osob: Skupina K: jedinci s negativním kožním prick testem na běžné inhalační alergeny, bez příznaků alergické rýmy nebo astmatu. Skupina : pacienti s pozitivním kožním prick testem (edém/erytém 3/5 mm) komerčně dodávanými testy (Alyostal, Stallergenes) na jarní pyly, pyl trav nebo plevelů a/nebo s pozitivitou specifických IgE protilátek na pylové alergeny (Immulite, 0,7 IU/ml), s projevy alergické rýmy a konjunktivitidy během minulé pylové sezóny, bez známek astmatu (kašel, dušnost apod.). Latentní alergie (pozitivita kožních prick testů) na další vzdušné alergeny nebyla zohledněna. Skupina : pacienti s alergickou rýmou (diagnostická kritéria stejná jako u předchozí skupiny) a sezónním astmatem, dosud neléčení inhalačními kortikosteroidy. Diagnóza astmatu byla stanovena na podkladě funkčních testů ne starších než 1 rok: pozitivitou bronchodilatačního testu se vzestupem FEV1 12 po aplikaci krátkodobého β2 mimetika nebo kolísáním FEV1 o 15 v průběhu dispenzarizace za poslední 3 roky. Pacienti a zdraví dobrovolníci byli vyšetřeni 6 8 týdnů před pylovou sezónou, během sezóny a 6 8 týdnů po jejím skončení. Všichni byli nekuřáci nebo exkuřáci (nejméně posledních 6 měsíců), indukce sputa byla vždy prováděna mimo respirační infekt. Klinický stav byl hodnocen lékařem (bylo provedeno fyzikální vyšetření, dotazníkovou formou posouzen charakter a tíže symptomů, zjištěno období a délka trvání obtíží, současná terapie). Léčba antihistaminiky a kromony v době vyšetření nebyla omezena, pacienti, jejichž stav vyžadoval léčbu inhalačními kortikosteroidy, nebyli do projektu zařazeni. Specifická imunoterapie nebyla zohledněna. K indukci sputa byla použita standardní metodika podle Pizzichini (17). Po úvodním podání 200 μg salbutamolu byla indukována produkce sputa postupnou inhalací 3, 4 a 5 roztoku NaCl, vždy v 7min. intervalech, pomocí ultrazvukového nebulizátoru (DeVilbiss 2000) s výdejem kolem 1 ml/min. Křivka průtok/objem byla měřena spirometrem (ZAN) před indukcí a po jednotlivých intervalech. Sputum bylo ihned zpracováno podle standardní metodiky (Pin, Gibson) (5, 16). K dalšímu zpracování byla použita viditelně viskózní část sputa. Zpracování selektovaného sputa je mírně časově náročnější, ale přesnost buněčných počtů bývá vyšší, výhodou je menší kontaminace dlaždicovými buňkami. K dosažení solubilizace vybrané hutné části sputa bylo přidáváno čtyřnásobné množství váhy čerstvě připraveného 0,1 DTT (Sputolysin, Calbiochem, San Diego), který štěpí disulfidické můstky v makromolekulách mucinu. Další solubilizaci napomáhá naředění pomocí PBS. To bylo přidáváno po 15 min. ve čtyřnásobném množství a homogenizovaný vzorek byl přefiltrován přes nylonové sítko s otvory o průměru 48 μm. Ve všech získaných vzorcích sputa byla hodnocena buněčnost a životnost buněk. Připravené cytospiny (cytocentrifuga Cytospin 4, Shandon, Anglie) byly po fixaci a obarvení Hemacolorem Rapid (metanol 5 sec., eosin 3 sec., thiasin 6 sec.) a po opláchnutí pufrem o ph 7,2 použity ke stanovení diferenciálního rozpočtu buněk. Cytospiny fixované aceton/metanolem byly použity pro imunocytochemické vyšetření. Použitím DAKO protilátek byl technikou APAAP (alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase) zjišťován počet eozinofilů (detekcí exprese znaku EG2 po označení protilátkou proti MBP v ředění 1:30), počet neutrofilů (značených protilátkou proti neutrofilní elastáze v ředění 1:100) a makrofágů (označených protilátkou proti znaku CD68 v ředění 1:50). Koncentrace ECP v supernatantu byla měřena chemiluminiscenční metodou pomocí analyzátoru Immulite, DPC. Hladiny IL-4, IL-5, IL-10 a IL-13 v supernatantu byly stanovovány pomocí ELISA BioSource, International, USA), senzitivita pro IL-4 byla od 0,27 pg/ml, pro IL-5 od 4 pg/ml, pro IL-10 od 0,2 pg/ml a pro IL-13 od 0,5 pg/ml. Byla sledována dynamika změn ve výsledcích (před, v a po pylové sezóně) v jednotlivých skupinách a rozdíly mezi skupinami v daném čase. Výsledky Celkem bylo vyšetřeno 113 probandů: 38 pacientů ze skupiny polinotiků s intermitentním astmatem (), 52 pacientů se sezónní alergickou rýmou bez symptomů astmatu () a 23 zdravých kontrol (K). Z celkového počtu 288 provedených vyšetření bylo 210 vzorků hodnotitelných. Všechny 3 hodnotitelné údaje (výsledky před sezónou, v sezóně a po sezóně) byly k dispozici u 19 pacientů ze skupiny, 33 z a 18 ze skupiny K (celkem 70 osob, tj. 61,9 ) (tab. 1). Za úspěšnou byla považována indukce, při níž byl získán materiál, ve kterém bylo více než 50 živých buněk, kontaminace dlaždicovými epiteliemi nepřesahovala 20 a byl hodnotitelný alespoň jednou z metod (klasickým barvením Hemacolor nebo imunocytochemicky). Procento úspěšnosti indukce sputa se v našem souboru pohybovalo ve shodě s literárními údaji: 72,9 z celkového počtu provedených vyšetření. Antihistaminiky nebo topickými kortikosteroidy (nosní spray) bylo v době vyšetření léčeno 9 osob (23,7 ) ze skupiny a 20 osob (38,5 ) ze skupiny. Celková antihistaminika užívalo v době indukce v letní pylové sezóně 21 osob (55,3 ) ze skupiny a 29 osob (55,8 ) ze skupiny. Zpracování dat bylo primárně založeno na analýze rozptylu pro opakovaná pozorování, přičemž některé veličiny (např. ECP) byly pro účely vyhodnocení (aby se jejich rozložení přiblížilo normálnímu) logaritmovány. Při porovnání průměrů spojitých veličin ve dvou skupinách byl použit Studentův t-test a Mann-Whitneyův neparametrický test. Vzájemná vazba veličin byla analyzována pomocí korelačních (Spearmanův korelační koeficient) a regresních (Poissonova regrese) metod. 97

3 Tab. 1: Charakteristika souboru Průduškové astma () Alergická rhinitis () Kontroly (K) Celkem Počet hodnocených (n) Muži/ženy 6/13 18/15 10/8 34/36 Věk (± sd) 32,3 ± 8,4 38,8 ± 10,8 43,3 ± 11,4 Funkční parametry Zastoupení buněčných elementů Ve vývoji průměrných hodnot FEV1 nebyly v rámci skupin statisticky významné rozdíly, rozdíly mezi skupinou a K byly na hranici statistické významnosti (p=60). (Obr. 1) Humorální znaky ve sputu (cytokiny, ECP) Hladiny IL-4, IL-5, IL-10 a IL-13 byly ve všech měřených vzorcích až na výjimky pod detekovatelnou hranicí. Nejvyšší hodnoty ECP byly ve skupině polinotiků () při vyšetření v pylové sezóně. Hodnoty ECP byly ve skupině v pylové sezóně statisticky významně vyšší v porovnání s hodnotami mimo sezónu (p=07). (Obr. 2) Počet eozinofilů, neutrofilů a makrofágů ve vzorcích indukovaného sputa byl hodnocen klasickým barvením (Hemacolor) a imunocytochemicky. Oběma metodami nebyly v počtu makrofágů i neutrofilů prokázány statisticky významné rozdíly ani mezi skupinami, ani v rámci skupin. (Obr. 3 6) V počtu eozinofilů hodnocených klasickým barvením byly prokázány statisticky významné rozdíly v rámci skupiny - v pylové sezóně (vyšetření č. 2) byly hodnoty vyšší v porovnání s měřením po sezóně (vyš. č. 3) (p=10). Při porovnání skupin byly zjištěny statisticky významně vyšší hodnoty u skupiny v porovnání se skupinou K (před: p=03, v sezóně: p<01), v pylové sezóně vyšší i u skupiny v porovnání s (p=13). (Obr. 7) náležitých hodnot Obr. 1: Průměrné hodnoty FEV1 před indukcí (aritmetický průměr a 95 interval spolehlivosti) 98

4 Při hodnocení počtu eozinofilů detekovaných imunocytochemicky byly nalezeny statisticky významné rozdíly v rámci skupiny - v pylové sezóně (vyš. 2) byly hodnoty vyšší v porovnání s měřením před sezónou (vyš. 1) (p= 53) a po sezóně (vyš. 3) (p=10). Rozdíly v rámci skupiny nebyly v důsledku velké variability statisticky významné. Ve všech třech dobách měření byly zjištěny statisticky významně vyšší hodnoty u skupiny v porovnání se skupinou K (před: p=79, v sezóně: p=03, po: p=03), v pylové sezóně vyšší i u skupiny v porovnání s K (p= 02). (Obr. 8) Ve skupinách a byl zjišťován vztah mezi počtem eozinofilů a průměrnými hodnotami FEV1, závislost nebyla prokázána. Diskuse Přestože indukce sputa je poměrně bezpečnou a relativně jednoduchou metodou, je velmi důležité, aby lékař, sestra i laborant provádějící toto vyšetření dokonale ovládali metodiku a dodržovali standardizovaný postup ng/ml Obr. 2: Hladiny ECP (ng/ml) ve sputu (geometrické průměry a 95 interval spolehlivosti) Obr. 3: Procento makrofágů (aritmetické průměry, 95 interval spolehlivosti) ve sputu u vyšetřovaných skupin pacientů v jednotlivých obdobích měření. Barvení Hemacolorem 99

5 Obr. 4: Procento makrofágů (aritmetické průměry, 95 interval spolehlivosti) ve sputu u vyšetřovaných skupin pacientů v jednotlivých obdobích měření. Imunocytochemická detekce (ICC) Obr. 5: Procento neutrofilů (aritmetické průměry, 95 interval spolehlivosti) ve sputu u vyšetřovaných skupin pacientů v jednotlivých obdobích měření. Barvení Hemacolorem. Získání pacientů, kteří byli zařazeni do hodnoceného souboru, bylo limitováno dvěma základními faktory: ochotou přijít opakovaně na vyšetření a úspěšností provedené indukce. Tyto podmínky splnilo 61,9 probandů. Při inhalaci hypertonického roztoku NaCl (3, 4 a 5) užívaného k indukci sputa může dojít k bronchokonstrikci. U žádného z pacientů v našem souboru nebyla výchozí hodnota FEV1 nižší než 90 n.h.. Výchozí hodnoty FEV1 byly podle očekávání nejvyšší u kontrolní skupiny, nejnižší ve skupině polinotiků se sezónním astmatem bez ohledu na časový vývoj. Hodnoty FEV1 korelovaly s diagnózou lehkého intermitentního astmatu. Tomu odpovídá nízké zastoupení eozinofilních leukocytů ve sputu () jak polinotiků s intermitentním astmatem (skupina ), tak polinotiků bez symptomů astmatu (skupina ) (11, 12). Někteří autoři (16) prezentují signifikantní korelaci mezi počtem eozinofilů ve sputu a stupněm bronchiální obstrukce, jiní (9) korelaci mezi počtem eozinofilů ve sputu a stupněm BHR neprokázali. Počet eozinofilů získaných klasickým barvením (Hemacolor) a detekovaných imunocytochemicky se do 100

6 Obr. 6: Procento neutrofilů (aritmetické průměry, 95 interval spolehlivosti) ve sputu u vyšetřovaných skupin pacientů v jednotlivých obdobích měření. Imunocytochemická detekce (ICC) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Obr. 7: Procento eozinofilů (aritmetické průměry, 95 interval spolehlivosti) ve sputu u vyšetřovaných skupin pacientů v jednotlivých obdobích měření. Barvení Hemacolorem určité míry liší. Imunocytochemická detekce je založena na antigenních markerech, klasické barvení (Hemacolor) na morfologii a barvení buňky. Přes určité rozdíly ve výsledcích způsobených jinými metodologickými přístupy jsou obě metody ve výsledném vyznění velmi podobné. Při porovnání hodnotitelnosti diferenciálního rozpočtu buněk sputa klasickým barvením (Hemacolor) a imunocytochemickou detekcí (ICC) bylo 89 vzorků posouzeno oběma metodami shodně. Z daných výsledků je zřejmé, že obě metody jsou srovnatelné. Počet eozinofilů ve sputu je obvykle velmi nízký, u zdravých dětí maximálně 2,5 (4). Ke zvýšení počtu eozinofilů ve sputu dochází u atopiků vlivem kontaktu s alergeny, koresponduje s klinickou závažností a exacerbacemi astmatu, klesá při léčbě kortikoidy (8). Odhaduje se, že více než 80 astmatiků, kteří dosud nepoužívali kortikoidy, a více než 50 těch, kteří jsou léčeni inhalačními kortikoidy, mohou mít normální hladiny eozinofilů ve sputu (15). Eozinofily ve sputu jsou považovány za nejvhodnější ukazatel zánětu dýchacích cest. U pacientů s alergickou rýmou, se symptomy postižení dol- 101

7 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Obr. 8: Procento eozinofilů (aritmetické průměry, 95 interval spolehlivosti) ve sputu u vyšetřovaných skupin pacientů v jednotlivých obdobích měření. Imunocytochemická detekce (ICC) ních dýchacích cest a s lehkým astmatem dochází během letní pylové sezóny ke zvýšení počtu eozinofilů ve sputu (19). Během pylové sezóny byl u pacientů s alergickou rýmou bez astmatu prokázán vyšší počet eozinofilů (7, 18). U pacientů s rýmou je eozinofilní infiltrace méně výrazná než u pacientů s lehkých astmatem (1). Subklinické zánětlivé změny v dolních dýchacích cestách korelují s nespecifickou bronchiální hyperreaktivitou u pacientů s alergickou rýmou i při absenci klinických příznaků astmatu (19). Souhlasně s předchozími pracemi byl v našem souboru prokázán vývoj v čase (v závislosti na pylové sezóně) i rozdíl mezi skupinami. Eozinofilní kationický protein (ECP) - marker aktivovaných eozinofilů odráží degranulaci, nemusí nezbytně korelovat s počtem eozinofilů ve sputu (6). Jiní autoři (14, 10, 2) potvrzují mírnou korelaci mezi hladinou ECP a počtem eozinofilů. Zvýšená hladina ECP a počtu eozinofilů ve sputu byla prokázána 24 hod po expozici alergenům (3) u pacientů s lehkým astmatem. Mimo pylovou sezónu nebyl prokázán rozdíl v ECP mezi pacienty s alergickou rýmou a kontrolní skupinou, naopak během pylové sezóny došlo u atopiků k signifikantnímu zvýšení (13). V našem souboru pacientů byl ve skupině () prokázán u průměrných hodnot ECP vývoj v čase, hodnoty při vyšetření během pylové sezóny byly významně vyšší v porovnání s hodnotami mimo sezónu. Závěr Mikroskopické vyšetření a stanovení ECP ve sputu jsou metody vhodné ke sledování alergického zánětu v průduškách. Byl prokázán vývoj v čase (v závislosti na expozici pylovým alergenům) i rozdíl mezi skupinami. Statisticky významné zvýšení ECP a počtu eozinofilů během pylové sezóny u polinotiků bez symptomů astmatu svědčí pro přítomnost eozinofilního zánětu v dolních dýchacích cestách. Vyšetřením parametrů indukovaného sputa může být detekována přítomnost alergického zánětu v průduškách i u lehkých stupňů astmatu včetně asymptomatických pacientů. Podporováno grantem IGA NI a VZ MSM Literatura: 1. Alvarez MJ, Olaguibel JM, Garcia BE, Rodriguez A, Tabar AI, Urbiola E: Airway inflammation in asthma and perennial allergic rhinitis. Relationship with nonspecific bronchial responsiveness and maximal airway narrowing. Allergy /Denmark/, 2000; 55: Bacci E, Cianchetti S, Ruocco L: Comparison between eosinophilic markers in induced sputum and blood in asthmatic patients. Clin Exp Allergy, 1998; 28: Barck Ch, Lundahl J, Halldén G, Bylin G: Total eosinophilic cationic protein levels in induced sputum as a marker of changes in eosinophilic inflammation in a patient with allergic astma. Annals of Allergy, Astma and Immunology; Jul 2005; 95, 1; p Cai Y, Carty K, Henry RL, Gibson PG: Persistence of sputum eosinophilia in children with controlled asthma when compared with healthy children. Eur Respir J., Apr. 1998, 11 /4/, Djukanovic R, Sterk PJ, Fahy JV, Hargreave FE: Standardised methodology of sputum induction and processing. Eur Respir J 2002; 20: Suppl Fahy JV, Liu J, Wong H, Boushey HA: Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. Am Rev Respir Dis. 1993; 147:

8 7. Foresi A, Leone C, Pelucchi A, Mastropasqua B, Chetta A, D Ippolito R., Marazziny L, Oliviery D, Giovanni SS: Eosinophils, mast cells, and basophils in induced sputum from patients with seasonal allergic rhinitis and perennial asthma: relationship to methacholine reponsiveness. J Allergy Clin Immunol., 1997; 100: Gibson PG, Bortila MZ, Fakes K, Simpson J, Henry RL: Pattern of airway inflammation and its determinants in children with acute severe asthma. Ped Pulmonol, 1999; 28: Gibson PG, Simpson JL, Hankin R, Powel H, Henry RL: Relationship between induced sputum eosinophils and the clinical pattern of childhood asthma. Torax, 2003; 58: Gibson PG, Woolley KL, Carty K: Induced sputum oesinophil cationic protein (ECP) measurement in asthma and chronic obstructive airway disease (COPD). Clin Exp Allergy. 1998; 28: Chlumský J: Význam monitorování zánětu u pacientů s bronchiálním astmatem. Alergie, suppl.1, Chlumský J, Pokorná H: Buněčné parametry indukovaného sputa jako neinvazivní znak zánětu dýchacích cest u pacientů s astmatem: absence korelace mezi maximálním poklesem FEV1 a PEF po inhalaci hypertonického roztoku NaCl a zastoupením eozinofilních leukocytů v indukovaném sputu. Alergie 2, Di Lorenzo G, Mansueto P, Melluso M, Candore G, Colombo A, Pellitteri E, Drago A, Potestio M, Caruso C: Allergic rhinitis to grass pollen: Measurement of inflammatory mediators of mast cell and eosinophils in native nasal fluid lavage and in serum out of and during pollen season. J Allerg Clin Immunol 1997; 100, 6, Metso T, Rytila P, Peterson C: Granulocyte markers in induced sputum in patiens with respiratory disorders and healthy persons obtained by two sputum-processing methods. Respir Med. 2001; 95: Pavord ID: Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. Eur Respir J 2002; 20 (Suppl): S Pin I, Gibson PG, Kolendowicz R, Borgis-Gabardo A,. Denburg JA, Hargreave FE, Dolovich J: Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax 1992, 47, Pizzichini E, Pizzichini MM, Efthimiadis A: Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and viability of cell and fluid-phase measurements. Am. J Respir Crit Care Med 1996; 154: Polosa R, Ciamarra I, Mangano G, Prosperini G, Pistorio MP, Vancheri C, Crimi N: Bronchial hyperresponsiveness and airway inflammation markers in nonasthmatics with allergic rhinitis. Eur Respir J 2000; 15: Tatar M, Petriskova J, Zucha J, Pecova R, Hutka Z, Raffajova J, Brozmanova M: Induced sputum eosinophils, bronchial reactivity, and cough sensitivity in subjects with allergic rhinitis. J Physiol and Pharmacol 2005; 56, Supp. 4, MUDr. Ivana Malkusová Ústav imunologie a alergologie FN a LF UK Plzeň Alej Svobody 80, Plzeň 103