SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

Transkript

1 PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucí této práce Mgr. Kláře Hilscherové, Ph.D. za cenné rady a za vytvoření zázemí a zajištění prostředků na materiál potřebný k práci, na kterém se podíleli také Doc. Mgr. Luděk Bláha, Ph.D. a vedení pracoviště RECETOX. Dále děkuji pracovníkům Čistírny odpadních vod Modřice, Brno (Brněnské vodárny a kanalizace, a.s.), jejíž vedení nám ochotně poskytlo vzorky vody i výsledky svých analýz kontroly kvality odpadní vody. Ráda bych poděkovala Ing. Pavle Špičákové a Ing. Martinu Kubátovi z laboratoří kontroly kvality vody na Čistírně odpadních vod Modřice, Brno, kteří se spolupodíleli na optimalizaci metod a svým přátelům a spolužákům z pracoviště RECETOX, Mgr.Veronice Jálové, RNDr. Michalovi Bittnerovi Ph.D., Mgr. Tereze Šídlové, Mgr. Jiřímu Novákovi, Mgr. Martinu Beníškovi a RNDr. Veronice Paškové za pomoc s in vitro biotesty nebo se zpracováním dat

2 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AEQ androgenní ekvivalent(y) AR androgenní receptor(y) ČOV čistírna/y odpadních vod DCM dichlormethan DHT dihydrotestosteron DMSO dimethylsulfoxid ED endokrinní disrupce EDC endokrinní disruptor(y) EEQ estrogenní ekvivalent(y) ER estrogenní receptor(y) ERE estrogen-responsivní element(y) EtOH ethanol E1 estron E2 17β-estradiol E3 estriol EE2 ethinylestradiol GF filtry filtry ze sklovitého vlákna (Glass Fiber filters) HCH hexachlorhexan IC25 koncentrace, která způsobuje 25% cytotoxicitu LLE...extrakce pomocí kapalin odlišné polarity (Liquid Liquid Extraction) LOD limit detekce LOEC nejnižší koncentrace, při které byl naměřen významný účinek (Lowest Observable Effective Concentration) M molární MeOH methanol NOEC nejvyšší koncentrace, kdy nebyl pozorován žádný významný účinek (No Observable Effective Concentration) NSM nejnižší stanovitelné množství PAH polycyklické aromatické uhlovodíky (také PAU) PBS fyziologický roztok používaný pro práci s buněčnými kulturami jako pufr (Phosphate Buffered Saline) PCB polychlorované biphenyly p,p -DDE p,p -dichlordiphenyldichlorethen p,p -DDT p,p -dichlordifenyltrichlorethan SDB styrendivinylbenzen SPE extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction) T testosteron - 2 -

3 OBSAH 1. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Úvod Přirozená funkce androgenů a estrogenů Endokrinní disruptory Endokrinní potenciál látek Známé účinky endokrinní disrupce Přehled metodik hodnocení vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech Příprava a zpracování vzorků odpadní vody In vitro testy používané pro hodnocení xenoestrogenity, xenoandrogenity, antiestrogenity a antiandrogenity vzorků vody MATERIÁL A METODY Příprava vzorků pro test výtěžnosti navržené metody Původní metodika zpracování vzorků odpadní vody z ČOV Modřice, Brno, pro testování v in vitro testech Optimalizované zpracování vzorků odpadní vody z ČOV Modřice, Brno pro testování v in vitro testech In vitro testy (YAS, MVLN) Testování xenoandrogenity - YAS test Testování xenoestrogenity - MVLN test Vyhodnocení, analýza dat Analýza dat cytotoxicity vzorků Výpočet limitu detekce in vitro testů Výpočet relativního xenoandrgenního potenciálu odpadní vody Výpočet relativního xenoestrogenního potenciálu odpadní vody Výpočet efektivity odstranění xenoandrogenních a xenoestrogenních látek

4 4. VÝSLEDKY Výtěžnost navržené metody zpracování vzorků odpadní vody Optimalizace postupu přípravy vzorků odpadní vody pro testování v in vitro testech Výsledky in vitro testů Cytotoxicita surové a odtokové odpadní vody Xenoandrogenita surové a odtokové odpadní vody Antiandrogenita surové a odtokové odpadní vody Xenoestrogenita surové a odtokové odpadní vody Vzorky filtrů použitých pro surovou a odtokovou vodu a dvou vzorků tuhých částic ze surové odpadní vody Porovnání dostupných in vitro testů (YAS a MVLN) Optimalizovaný postup přípravy vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech DISKUSE Výsledky in vitro testů Cytotoxicita Xenoandrogenita a antiandrogenita Xenoestrogenita Srovnání výsledků in vitro testů a chemické analýzy kvality odpadní vody Výtěžnost použité metody ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA PŘÍLOHA

5 ABSTRAKT Xenoestrogenní a xenoandrogenní látky mají schopnost interagovat s endokrinním systémem exponovaných organismů a mohou tak negativně působit na jejich celkovou homeostázu, reprodukční a behaviorální funkce. Hlavními známými zdroji těchto látek jsou čistírny odpadních vod (ČOV). Řada zahraničních studií prokázala pomocí in vitro testů přítomnost xenoestrogenních a xenoandrogenních látek v odpadních vodách v environmentálně významných koncentracích. Pokud je autorce známo, v České republice dosud neproběhla žádná studie zabývající se hodnocením endokrinního potenciálu vod pomocí in vitro testů. V diplomové práci byla navržena, optimalizována a validována metoda hodnocení xenoestrogenity a xenoandrogenity odpadních vod pomocí dvou in vitro testů. Nejméně jednou měsíčně byly odebírány, zpracovány a testovány směsné vzorky odpadní vody z ČOV Modřice v Brně po dobu celého roku, aby mohla být sledována sezónní variabilita těchto látek. Na přítoku do ČOV byla naměřena xenoestrogenita od 5 do 147 ng EEQ/l a xenoandrogenita od 17 do 205 ng AEQ/l. Ve vodě na výtoku z ČOV byla detekována xenoestrogenita od 0,01 do 4 ng EEQ/l. Xenoandrogenita ve vodě na výtoku z ČOV nepřekračovala nejnižší stanovitelné množství xenoandrogenních látek, které se pohybovalo od 1 do 4 ng AEQ/l. Efektivita odstranění xenoestrogenních látek byla 81 až více než 99 % a fektivita odstranění xenoestrogenů 96 až více než 99 %. I přesto, že drtivá většina xenoestrogenních látek byla v procesu čištění vody na ČOV Modřice, Brno odstraněna, vliv koncentrací těchto látek naměřených v odtoku z ČOV na vodní organismy by mohl být při chronické expozici významný. Během testování ED potenciálu vzorků vyšel najevo velký význam parametru cytotoxicity vzorků. Cytotoxicita odpadních vod byla určujícím faktorem pro stanovování specifických účinků biologickými metodami a je pravděpodobné, že může hrát také významnou roli v reálných podmínkách životního prostředí. Vzhledem k tomu, že ČOV v Brně Modřicích je jednou z největších a nejnovějších ČOV v České republice, bylo by dobré charakterizovat cytotoxicitu a přítomnost xenoestrogenních a xenoandrogenních látek na dalších ČOV, kde lze očekávat nižší efektivitu odstranění sledovaných látek

6 ABSTRAKT Xenoestrogens and xenoandrogens have recently emerged as environmental contaminants of concern due to their ability to cause hormone-like effects and interfere with normal functioning of the endocrine system in an exposed organism. Waste water treatment plants (WWTP) are known to be the main sources of these compounds. Using in vitro bioassays numerous foreign studies have determined these compounds are present in the waste waters at concentrations that could potentially be of concern. Up to author s knowledge, there has been no research into this issue in the Czech Republic. In these diploma theses new methods for evaluation of ED potential of waters were optimise and validated. Two in vitro bioassays were used to determine the level of xenoestrogens and xenoandrogens in influent and effluent of waste water from a modern Municipal WWTP in Brno Modřice. Composed samples were taken monthly during whole year so that seasonal variations can be studied. Significant levels of both xenoestrogenic and xenoandrogenic activity were determined in waste water influent. The concentrations of xenoestrogens varied from 5 to 147 ng EEQ/l. The detected concentrations of xenoandrogens were from 17 to 205 ng AQE/l. The efficiency of xenoestrogenic compounds degradation varied from 81 to over 99 % and the xenoestrogenic activity in effluent was 0,01 to 4 ng EEQ/l. No xenoandrogenic activity was detected in effluent samples up to the detection limit from 1 to 4 ng AEQ/l. Efficiency of degradation of xenoandrogenic compounds was 96 to more than 99 %. Despite the great efficiency of degradation the potential of measured concentrations of xenoestrogens in effluent to cause effect on aquatic biota remains a question. During research the parameter of waste water cytotoxicity has been shown to be extremely important for evaluation of endocrine potential and the results suggest that it could play an important role in aquatic ecosystems. Since WWTP in Brno Modřice is one of the most efficient WWTPs in the Czech Republic further research should be done to evaluate situation in other waste waters in the Czech Republic

7 1. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Hlavními cíli diplomové práce byly příprava a optimalizace metody zpracování vzorků odpadní vody pro následné zhodnocení xenoandrogenní a xenoestrogenní aktivity pomocí in vitro testů a samotné provedení a vyhodnocení těchto testů. Dílčí cíle: 1. Vypracování úvodu do problematiky endokrinní disrupce ve vodách 2. Vypracování literárního přehledu metodik hodnocení xenoestrogenního a xenoandrogenního potenciálu vzorků odpadních vod pomocí v in vitro testů 3. Návrh metody zpracování vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech 4. Odběry vzorků odpadních vod ve spolupráci s ČOV Brno Modřice 5. Zpracování vzorků vod, jejich extrakce a příprava pro testování 6. Charakterizace přítomnosti látek s xenoandrogenní a xenoestrogenní aktivitou v celoročně odebíraných vzorcích 7. Využití a srovnání základních parametrů dostupných in vitro metod (limit detekce, EC50, rychlost a citlivost odpovědi) pro hodnocení xenoandrogenního a xenoestrogenního potenciálu 8. Vypracování optimalizovaného postupu přípravy vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Úvod Endokrinní disrupce (ED) se stala v posledních desetiletích velmi zkoumaným problémem poté, co byla v životním prostředí po celém světě pozorována řada změn reprodukčních orgánů měkkýšů, ryb, aligátorů a jiných živočichů. Tyto změny byly později dány do souvislosti s hormonálními poruchami způsobenými exogenními antropogenními chemickými látkami (např. Sumpter & Johnson 2005). ED je termín označující narušení hormonální rovnováhy organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou homeostázu, reprodukční a behaviorální funkce. V roce 2007 Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC) v úvodu své publikace uvádí: ED byla pozorována ve vodním prostředí u savců, ptáků, plazů, ryb a měkkýšů v Evropě, Severní Americe a na jiných místech. ( ) Po celém světě existují důkazy reálné expozice látkami způsobujícími ED, která ovlivňuje volně žijící organismy a může být určující pro jejich kontinuální existenci v rámci ekosystémů. (Vethaak et al. 2007). Význam ED pro udržitelnost ekosystémů v globálním měřítku je dnes horkým tématem moderní biologie a environmentálních věd. Počet zaznamenaných případů ED se stále zvyšuje a objevují se i nové případy ED ve větších vzdálenostech od dosud známých zdrojů endokrinních disruptorů (Jobling et al. 2002). Většina vědeckých studií ED byla orientována na vodní ekosystémy, protože vodní organismy jsou pravděpodobně nejvíce exponovány látkami způsobujícími ED. Je to také tím, že vodní ekosystémy jsou často konečnými rezervoáry mnoha kontaminantů z odpadních vod, atmosférické depozice i jiných zdrojů. Navíc se zde vyvíjejí vajíčka a embrya mnoha vodních - 7 -

8 organismů, což znamená, že citlivá stádia vývoje těchto organismů jsou přímo exponována (Vethaak et al. 2007). Organismy v reálném prostředí nejsou exponovány jednotlivými látkami nýbrž jejich směsí. Hodnocení ED potenciálu reálných vzorků na základě znalostí jednotlivých endokrinních disruptorů (EDC) nemusí být přesné. Může docházet k nadhodnocení zanedbáním vlivu látek s antagonistickým účinkem nebo naopak k podhodnocení vlivem synergického působení látek ve směsích či díky neznalosti všech přítomných EDC (Leusch et al. 2005, Sumpter & Johnson 2005) Přirozená funkce androgenů a estrogenů Estrogeny a androgeny jsou steroidní látky a jsou součástí řídícího a integračního systému, který zajišťuje koordinaci tělesných funkcí mnohobuněčných živočichů endokrinního systému. Základním mechanismem řízení je tu chemorecepční schopnost buněk, neboli schopnost buněk reagovat na chemické podněty z okolí. Schopnost chemorecepce měly už fylogeneticky nejstarší jednobuněčné organismy. Tato schopnost se vznikem mnohobuněčnosti neztrácí, naopak zůstává nadále obecnou řečí buněk, způsobem, kterým buňky komunikují se svým okolím, jakým přijímají a vysílají informace. Chemické stimuly ze vzdálených či sousedních tkání zasahují do vnitřního stavu buněk: aktivizují enzymový aparát nebo spouštějí expresi konkrétních genů a určují tak, co bude buňka syntetizovat, jak se bude měnit, jaký bude celý její osud. Řadu látek, mezi než patří také steroidy, využívají k látkové komunikaci jak obratlovci, tak bezobratlí nebo dokonce jednobuněční, bakterie, řasy a rostliny. Steroidní látky pronikají buněčnými membránami k cytoplazmatickým receptorům, se kterými tvoří komplexy pronikající do jádra. Zde indukují transkripci a tedy i proteosyntézu enzymů nebo strukturálních bílkovin, které už bezprostředně vyvolávají buněčnou odpověď (Vácha et al. 2004). Zatímco u obratlovců se hormonální systém všech taxonů téměř neliší, u bezobratlých je tomu jinak. U bezobratlých prudce vzrůstá složitost endokrinního systému počínaje žahavci (Cnidaria) přes ploštěnce (Plathelmintes), kteří mají k dispozici ještě malý počet neurohormonů řídících především morfogenetické procesy: vývoj, růst, regeneraci a funkci gonád. Složitější systémy endokrinního řízení (např. vývoje vajíček, osmoregulace, srdečního výkonu atd.) nalezneme u fylogeneticky výše postavených bezobratlých, kteří mají vyvinutější systém cirkulace hemolymfy a tedy i vyšší účinnost dopravy hormonů. S nejdokonalejším hormonálním řízením se setkáváme u korýšů a hmyzu. Oběma skupinám je společné svlékání staré kutikuly, které je pod hormonálním řízením. Pozoruhodná je také endokrinní regulace měkkýšů, protože většina měkkýšů jsou hermafroditi a řízení samčí i samičí reprodukce musí probíhat paralelně, případně se hormonálně přepíná z jedné fáze do druhé (Vácha et al. 2004). Je známo, že korýši, měkkýši i hmyz využívají steroidní látky k hormonální regulaci, ale mechanismy tohoto řízení jsou prozkoumány minimálně nebo vůbec (Čížková 2007, Sumpter & Johnson 2005, Vácha et al. 2004). U obratlovců jsou androgeny a estrogeny základní pohlavní hormony a ovlivňují tvorbu pohlavních buněk, vývoj pohlavních orgánů, rozvoj typického pohlavního chování vedoucího ke kopulaci. Ovlivňují také vývoj oplozeného vajíčka, růst embrya a usměrňování procesů souvisejících s péčí o mláďata. U každého pohlaví nalezneme jak samčí, tak samičí hormony, ale v jiném poměru

9 Androgeny jsou samčí pohlavní hormony, z nichž nejdůležitější je testosteron, který je produkován Leydigovými buňkami varlat. Testosteron společně s dalšími androgeny z kůry nadledvin zajišťuje rozvoj samčích pohlavních orgánů a udržuje jejich funkční aktivitu. Ovlivňuje vývoj sekundárních pohlavních znaků (např. ochlupení u člověka, svatební opeření ptáků, tvorba paroží atp.). Androgeny dále řídí spermatogenezi, ovlivňují samčí pohlavní chování, stimulují růst svalové tkáně, neboť zvyšují proteosyntézu a zintenzivňují růst a sekreci přídatných pohlavních žláz. Estrogeny jsou samičí pohlavní hormony a jsou produkovány ve vaječnících. Patří mezi ně estradiol (E2), estron (E1) a estriol (E3). Estrogeny vyvolávají růst a vývoj samičích pohlavních orgánů a podmiňují typické sexuální chování. Dále podporují růst tkání souvisejících s rozmnožováním a ovlivňují vývoj sekundárních pohlavních znaků. U savců např. vyvolávají tvorbu mléčných kanálků v mléčné žláze, podporují výstavbu děložní sliznice a působí i na děložní svaly tím, že zvyšují jejich stahy a citlivost vůči působení hormonu oxytocinu (Vácha et al. 2004). Známým příkladem hormonálního řízení estrogenů je produkce fosfolipoglykoprotienu vitellogeninu (VTG), který je hlavním prekurzorem proteinů vaječného žloutku produkovanému samicemi vejcorodých obratlovců a některých bezobratlých. U ryb probíhá syntéza VTG v hepatopankreatu a je indukována estradiolem. Hladina VTG je přímo závislá na hladině estrogenů a proto je tato látka použitelná jako biomarker estrogenní aktivity Endokrinní disruptory Endokrinní disruptory jsou definovány jako exogenní látky nebo směsi látek, které mění jednu nebo více funkcí endokrinního systému a následně mohou vést ke škodlivým účinkům na celý organismus nebo na jeho potomstvo nebo na (sub)populace (IPCS/OECD 1998). Vzhledem k extrémně nízkým koncentracím přirozených hormonů v tělních tekutinách a k jejich nepatrným změnám, které postačují k regulaci funkcí důležitých orgánů, mohou některé EDC působit již v minimálních koncentracích. EDC narušují fungování systému s vnitřní sekrecí minimálně třemi možnými způsoby: 1) Napodobují působení přirozeně produkovaných hormonů, váží se na hormonální receptory jako agonisté. Toxicita se projeví nadměrnými fyziologickými projevy daného hormonu, např. hyperestrogenismem (např. ethinylestradiol, estradiol, nonylfenol). 2) Blokují v buňkách receptory hormonů (kompeticí nebo inhibicí), čímž zamezují působení běžných hormonů, chovají se jako antagonisté přirozených hormonů (např. tamoxifen, p,p -dichlordiphenyldichlorethen (p,p -DDE)). 3) Ovlivňují syntézu, transport, metabolismus nebo vylučování hormonů, čímž mění koncentrace přirozených hormonů. Může jít o látky reagující s enzymy, které syntetizují nebo degradují hormony; látky reagující s druhými posly, blokující přestup hormonů přes membránu, látky tvořící DNA adukty v místech zodpovědných za syntézu hormonů atp. EDC mohou být jak látky přírodní (např. steroidní hormony vylučované savci), tak antropogenní (např. alkyfenoly, tributylcín)

10 Některé EDC se ve vodním prostředí váží na sedimenty a mohou být perzistentní, jiné jsou polárnější, tedy ve vodě lépe rozpustné a zpravidla snáze degradovatelné. Navzdory poměrně dobré degradovatelnosti polárních EDC jsou tyto látky kontinuálně přítomny ve vodách pod výpustěmi z mnohých ČOV a jinde. Je to dáno jejich trvalým přísunem a jev se označuje jako pseudoperzistence. Některé EDC mohou navíc vznikat jako produkty degradace jiných látek bez ED potenciálu. Do dnešní doby byla největší pozornost věnována právě těm EDC, které narušují endokrinní působení steroidních hormonů estrogenů a androgenů, které se významnou měrou podílejí na reprodukčních a vývojových procesech a mají vliv na chování organismů. Některé exogenní látky mohou narušit i thyreoidní dráhy, které také hrají roli v procesu vývoje a nebo dráhy kortikoidní, které řídí především metabolismus a chování organismu při stresu. Existují důkazy, že EDC mohou ovlivňovat imunitní systém a vykazovat neurotoxicitu, ale mechanismus této disrupce není dosud znám (European Commission 2007). Seznam EDC je stále rozšiřován a doplňován o nové poznatky. V současné době je zvláštní pozornost věnována EDC produkovaným v nízkých objemech. Podrobný výčet informací o dosud známých EDC lze dohledat např. v databázi Europa commission-environment volně přístupné na internetových stránkách: Endokrinní potenciál látek Porovnáním intenzity (xeno)estrogenních účinků jednotlivých EDC se standardem lze vyjádřit jejich estrogenní potenciál. Pro určení (xeno)estrogenního potenciálu je jako standard používán 17β-estradiol (E2). V literatuře lze nalézt hodnoty (xeno)estrogenního potenciálu vybraných látek stanovené různými metodami. Koncentrace estrogenních látek ve vodách se často vyjadřuje relativním ED potenciálem směsi v tzv. estradiolových (estrogenních) ekvivalentech (EEQ). Hodnota EEQ vzorku tedy vyjadřuje, jaká koncentrace E2 by způsobila stejný (xeno)estrogenní účinek, který byl způsoben látkami v dané směsi. Hodnota EEQ se vypočítá jako suma koncentrací jednotlivých látek estrogenního charakteru násobených jejich estrogenním potenciálem, nebo jako podíl hodnot EC50 17β-estradiolu a vzorku (Kujálová et al. 2007). Podobně lze vyjádřit androgenní potenciál látek vztažený k standardu testosteronu (T), případně dihydrotestosteronu (DHT) v jednotkách testosteronového ekvivalentu (TEQ). Vzhledem k tomu, že zkratka TEQ je často používána k vyjádření toxicity dioxinového typu, bude v diplomové práci nahrazena zkratkou AEQ podle androgenního ekvivalentu. EDC s vysokým ED potenciálem působí již ve velmi nízkých koncentracích. EDC s nízkým ED potenciálem vykazují stejné účinky až při mnohonásobně vyšších koncentracích, ale k ED mohou přispívat případnou vysokou koncentrací v environmentální směsi nebo interakcemi s jinými látkami. Např. EC50 indukce vaječného proteinu vitellogeninu v samcích ryb byla u syntetického steroidu ethinylestradiolu zjištěna 0,95-1,8 ng/l, zatímco u bisphenolu A ng/l (Thrope et al. 2003, Sumpter & Johnson 2005). Dle současných poznatků se ED potenciál dané látky téměř neliší pro všechny obratlovce, ale je pravděpodobné, že se liší u různých skupin bezobratlých, kteří si nejsou zdaleka tak blízce

11 příbuzní jako obratlovci a kteří dosud zůstávají velmi málo probádanou skupinou (Sumpter & Johnson 2005) Známé účinky endokrinní disrupce Hlavními projevy endokrinní disrupce u bezobratlých jsou narušení reprodukce, plodnosti, poruchy růstu a maturace, zvětšení nebo zmenšení gonád, narušení sexuálního dimorfizmu a dalších hormonálně řízených procesů jako např. diapauzy. Prvním případem, u kterého byl dokázán projev endokrinní disrupce byl vznik tzv. imposexu u samic předožábrých plžů. Imposex je proces indukovaný xenoandrogenními látkami, při kterém dochází ke tvorbě samčích pohlavních znaků u samic a který vede ke sterilitě. U samic předožábrých plžů byl imposex způsobený chronickou expozicí organocínům používaným k nátěrům lodí. U těchto necílových organismů (asi 200 druhů plžů) byla pozorována tvorba penisu a chámovodu (Strobenet al. 1992). V souvislosti s xenoandrogenní nebo xenoestrogenní aktivitou EDC se u bezobratlých často hovoří také o narušení sexuálního dimorfismu označovaného jako intersex. Jde o jedince mající samčí i samičí pohlavní znaky. V České republice jsou projevy intersexu známé např. u populace raka bahenního (Pontastacus leptodactylus) na Karvinsku (Mazurová et al. 2007). Narušení endokrinních funkcí u bezobratlých může vést ke kolapsu celých populací (Vethaak et al. 2007). Role těchto populací je přitom pro vodní ekosystém nenahraditelná, ať už se jedná o drobné členovce, kteří se jako součást zooplanktonu živí řasami a sinicemi, měkkýše, kteří spásají řasy a makrofyta a tím zamezují masovému zarůstání toků, nebo o různé bentické organismy spotřebovávající značné množství organické hmoty na dně toků. Zvýšený rozklad organické hmoty pak vede k větší spotřebě kyslíku, což může mít vliv na vymírání celé řady vodních organismů včetně ryb. O narušení hormonálního systému obratlovců obvykle svědčí změny poměrů pohlaví, zvýšený výskyt intersexu, neobvyklý vývoj ovarií, poruchy vývoje gonád nebo zvýšená hladina vaječného proteinu vitelogeninu v dospívajících samcích. Byl pozorován hemipenis a minipenis (označení dvou stádií růstu penisu u samic) u aligátorů z jezera Apopka na Floridě. Jezero bylo kontaminováno řadou pesticidů a průmyslových látek z městských aglomerací včetně DDT, které pravděpodobně spolu s dalšími látkami způsobovalo částečnou přeměnu samčích gonád v samičí (Milnes et al. 2002). Řada studií účinků ED probíhá na rybách. Stále častěji je zjišťována feminizace ryb pod výpustěmi z ČOV způsobená xenoestrogenními látkami nebo maskulinizace ryb pod výpustěmi z papíren (např. Vethaak et al. 2007, Jobling et al. 2002). Známá je také maskulinizace ryb pod farmami živočišné výroby nebo narušení skořápek rybožravých ptáků vlivem DDT (např. Vethaak et al. 2007)

12 2.6. Přehled metodik hodnocení vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech Zvyšující se množství případů ED vedlo ke snaze nalézt rychlé, citlivé a specifické metody hodnocení relativního ED potenciálu komplexních vzorků z životního prostředí ať už pro testování vody či jiných matric. Ukázalo se, že vhodnou metodou jsou in vitro testy do té doby používané především pro testování xenoandrogenních a xenoestrogenních receptorových mechanismů působení jednotlivých látek (Kinnberg 2003) Příprava a zpracování vzorků odpadní vody Odebrání vzorku a skladování do doby dalšího zpracování Hodnocení vzorků z reálného prostředí začíná odběrem vzorků, který je velmi důležitý pro správnost provedení celého testu. Vzhledem k proměnlivosti složení a nehomogenitě vody zejména u vod odpadních jsou vhodné směsné vzorky odebírané po dostatečně dlouhou dobu. Za ideální je pokládán 24h směsný vzorek, odebíraný nejméně každé 2 hodiny. Objemy jednotlivých odběrů se přitom liší úměrně k velikosti průtoku. V terénních podmínkách odběr vzorků záleží na možnostech vzorkovacího zařízení. Jednorázové vzorky nejsou pro hodnocení xenoestrogenity/xenoandrogenity reálných směsí látek ve vodách příliš vhodné. Ve většině publikovaných studií byly používány 24h směsné vzorky vody o objemu 1 až 25 l. Vysoké objemy 25 l byly odebírány pouze v případě studií, které hodnotily kromě relativního ED potenciálu vzorků i další parametry (např. Nakada et al. 2004, Svenson & Allard 2004, Leusch et al. 2005). Voogt et al. (2006) v rozsáhlé studii účinnosti odbourávání xenoestrogenních látek v různých holandských ČOV podle možností odběrového zařízení používali směsné 24h vzorky, jejichž jednotlivé části byly odebírány proporčně k průtoku nebo náhodné vzorky vody odebrané každých 30 min po dobu 3 h tak, aby vznikl směsný vzorek. Murk et al. (2002) vzorkovali odpadní vody každých 30 min po dobu 7 hodin. Objem vzorků byl 1 nebo 2 l. Rutishauser et al. (2004) používali mimo jiné třídenní směsné vzorky. Jin et al. (2008) používali pro hodnocení xenoestrogenity směsné vzorky složené pouze ze dvou jednorázových odběrů, a to ráno a brzo odpoledne o objemu 1 l. Jejich studie však byla zaměřená na sledování sezónních variací xenoestrogenních látek v odpadních vodách, nikoliv na měření hladin EDC jako takových. Zvláštní pozornost je věnována materiálu, který přijde do styku se vzorkem. Ve všech studiích citovaných v diplomové práci byly pro odběr vzorků použity skleněné láhve. V případě použití plastů by mohlo dojít k uvolnění některých látek např. ftalátů a alkylfenolů, které vykazují xenoestrogenní aktivitu (Voogt et al. 2006). Uzávěry lahví jsou používány skleněné nebo teflonové. Lahve nesmějí být znečištěny organickými látkami, je možné je před použitím vymýt rozpouštědlem (Kinnberg 2003). Nakada et al. (2004) vymývali vzorkovací nádoby před použitím MeOH, Rutishauser et al. (2004) pomocí acetonu. Vzorky byly dále zpracovány nejčastěji do 48 h po odběru, do té doby je možné jejich skladování při 4 C. Při skladování vzorků déle než jeden týden může docházet k degradaci estradiolu (E2) a estriolu (E1) (Kinnberg 2003)

13 Ve studiích srovnání efektivity 3 různých in vitro testů, Murk et al. (2002) skladovali vzorky vody při 4 C maximálně 10 dní. Kvůli snížení mikrobiální degradace látek bylo ph vzorků upraveno pomocí 4M HCl na 3. Stejným způsobem bylo upraveno ph ve studii sezónní variability xenoestrogenního potenciálu látek na ČOV v čínském městě Wuhan. Vzorky byly při 4 C skladovány maximálně 1 týden (Jin et al. 2008). Filtrace Filtrace vzorků odpadní vody je většinou nutná, protože pevné částice by jinak ucpaly extrakční kolony/disky používané v následných krocích zpracování vzorků. Ve všech citovaných studiích byly používány filtry ze sklovitého vlákna (GF z anglického Glass fiber) s póry od 0,45 do 1,2 µm. Voogt et al. (2006) a Murk et al. (2002) používali dvojitou filtraci přes filtry nejdříve o porositě 1,2 µm, poté 0,45 µm. V několika případech byly použité filtry analyzovány pro ujištění, že se na nich spolu s tuhými částicemi nezachytává podíl xenoestrogenních látek. Nakada et al. (2004) zmrazili a vysušili filtry po filtraci 20 l vody na odtoku z ČOV a dále je zpracovali extrakcí v Soxhletově extraktoru (12 h, MeOH:Aceton (12:88), 10-15min/cyklus). Extrakt byl odpařen na vakuové odparce na požadovaný objem a testován pomocí YES in vitro testu. Xenoestrogenita nebyla naměřena u žádného z testovaných vzorků. Jedna studie zmiňuje ztrátu alkylfenolů zachycením na filtrech, nicméně uvádí, že je možné alkylfenoly snadno extrahovat spolu s elucí SPE kolony. Použité filtry mohou být před elucí jednoduše vloženy do kolony (obr. 3 na str. 48) a přelity rozpouštědlem (Mol et al. 2000). Xenoandrogenita částic zachycených na filtrech při zpracování odpadní vody nebyla v citovaných článcích testována, ale frakcionace vzorků ukazuje přítomnost xenoandrogenů ve fázích se stejnou nebo vyšší polaritou než jaká je fáze obsahující dihydrotestosteron (DHT). DHT je při tom přítomný pouze v rozpuštěné formě (Svenson & Allard 2004). Extrakce tuhou fází (SPE) Přestože při snížení ph mohou být uvolněny některé konjugáty steroidních metabolitů přítomných ve vzorcích vody (Kinnberg 2003), bývá nejčastěji extrahována voda bez úpravy ph. Někteří autoři přidávaly do vzorků max. 0,5 % (objemových procent) MeOH, dle doporučení výrobce pro některé SPE kolony/disky. Např. Rutishauser et al. (2004) přidávali do vzorků 5 ml/l MeOH a upravovali ph na 3 pomocí 16% HCl. Při SPE jsou používány kolony nebo disky obsahující sorbent, na který se váže příslušné spektrum látek uváděné výrobcem. Po převedení vzorku přes kolonu nebo disk jsou látky eluovány organickým rozpouštědlem. Pro analýzu povrchových vod byly nejčastěji používány kolony/disky označované jako C18 se sorbentem Octadecylsilica, pro analýzu odpadních vod kolony/disky se sorbentem styrendivinylbenzenem (SDB) komerčně označovaných také jako ENV+, HLB nebo

14 SBD-XC (Obr. 1). Extrakce pomocí SDB kolon/disků je rychlejší a kolona/disk může na rozdíl od C18 kolon/disků během extrakce vyschnout. Navíc se SDB kolony méně ucpávají, což je důležité zejména při extrakci odpadních vod na přítoku do ČOV. Jedna studie srovnávající účinnost extrakce pomocí C18 a SDB sorbentů uvádí nedostatečný záchyt estriolu (E3) pomocí SDB, jiné studie ukazují stejné výsledky při použití obou typů sorbentů. Kolony označované jako XAD-2 se ukázaly pro extrakci vodních vzorků pro testování xenoestrogenity jako nevhodné (Kinnberg 2003). Obr. 1: C18 kolona (vlevo), C18 disk a SDB kolona Eluce C18 kolon/disků je prováděna MeOH, pro SDB kolony/disky mohou být použita různá rozpouštědla. Murk et al. (2002) např. používali dimethylsulfoxid (DMSO), Thomas et al. (2004) používali MeOH a dichlormethan, Jin et al. (2008) a Ying et al. (2008) použili ethyl acetát, Rutishauser et al. (2004) a Svenson & Allard (2004) aceton, dle návodu u konkrétních kolon. Objem rozpouštědla použitého pro eluci se liší podle objemu vzorku. Minimálně bylo použito 5 ml MeOH. Vzorky jsou dále zakoncentrovány pomocí evakuované odparky nebo pod dusíkem nebo vzduchem podle objemu vzorku a dostupného vybavení. Nejčastěji byly vzorky odfoukány dusíkem do sucha a rekonstituovány ve vhodném rozpouštědle pro in vitro test (MeOH, DMSO, atp.). Skladování extraktů do doby analýzy Připravené extrakty byly ve všech citovaných studiích uchovávány v -18 C. Baronti et al. (2000) provedli studii stability vzorků vody z řek zpracovaných filtrací a eluovaných v MeOH. Při uchování vzorků při -18 C nebyl pozorován žádný významný úbytek látek s xenoestrogenními účinky po dobu dvou měsíců

15 In vitro testy používané pro hodnocení xenoestrogenity, xenoandrogenity, antiestrogenity a antiandrogenity vzorků vody Pro vysvětlení principu fungování in vitro testů je třeba uvést základní molekulární mechanismy interakcí androgenních respektive estrogenních látek, vnitrobuněčných steroidních receptorů a specifických úseků DNA. Androgenní resp. estrogenní účinky jsou zprostředkovány androgenními/estrogenními receptory (AR/ER), což jsou vnitrobuněčné jaderné receptory. Inaktivní AR/ER jsou vázány v komplexech s dalšími proteiny (chaperony, heat shock proteiny). Po navázání androgenní/estrogenní molekuly na AR/ER dochází ke konformačním změnám, k uvolnění vazeb AR/ER se zmíněnými proteiny, k aktivaci AR/ER a k dimerizaci receptoru. Výsledný dimer vykazuje vysokou afinitu ke specifickým úsekům DNA označovaným jako hormon responsive elements (HREs respektive androgen responsive elements (AREs)/ estrogen responsive elements (EREs)), které jsou umístěny v regulační oblasti určitých genů v jádře buňky. Navázání dimeru na HRE vede k transkripci cílových genů a následné translaci mrna, po které vzniká výsledný protein hrající důležitou roli pro fyziologii a funkčnost buňky (Kinnberg 2003, Jacobs 2001). Androgeny/estrogeny proto hrají klíčovou roli v syntéze proteinů ovlivňujících funkčnost a fyziologii buněk, zejména buněk souvisejících s reprodukcí nebo reprodukčním chováním organismů. Většina známých in vitro testů používaných pro hodnocení xenoandrogenního a xenoestrogenního potenciálu vody spadá do jedné ze tří kategorií: 1) Měření afinity látek vůči ER/AR, tzv. ER/AR binding assay 2) Testy odpovědi reporterového genu, tzv. Reporter gene assays 3) Testy buněčné proliferace, které měří vzrůstající počet buněk během exponenciální fáze proliferace, tzv. Cell proliferation assays (Tab. 1). 1) Měření afinity látek vůči ER/AR, tzv. ER/AR binding assay Tyto testy byly hojně využívány při zkoumání interakcí ER/AR s ligandy. Metoda může být provedena pomocí izolovaných vnitrobuněčných nebo jaderných receptorů libovolných tkání savců nebo i jiných obratlovců. Většina ER binding assays kvantifikuje schopnost kompetice testované látky s radioaktivně značeným 17β-estradiolem při vazbě na ER (Kinnberg 2003). Pro AR binding assays se jako ligand používá syntetický androgen methyltrienolone (Brown 2007, Murk et al. 2002). Metoda sleduje vazbu látek na ER/AR, ale neumožňuje rozlišení agonistického a antagonistického působení. Navíc není prokázáno, že samotná vazba na ER/AR implikuje ovlivnění genové transkripce. Některé studie potvrzují, že vysoká koncentrace kompetitivních ligandů může vyústit v nekompetitivní zaměňování. Detekční limit této metody je nižší než u testů odpovědi reporterového genu. Poslední nevýhodou je možné nadhodnocení xenoestrogenity nebo xenoandrogenity, neboť v testu není zahrnut přestup látek buněčnou membránou (Kinnberg 2003). Navzdory zmiňovaným nevýhodám, je tato metoda poměrně rychlá (Tab. 1) a objevují se její vylepšení (např. Leusch et al. 2006)

16 2) Testy odpovědi reporterového genu tzv. Reporter gene assays Tyto testy jsou založeny na schopnosti látek stimulovat ER-dependentní nebo AR-dependentní transkripční aktivitu. Exprese reporterového genu je výsledkem kaskády dějů začínajících aktivací ER/AR navázáním ligandu. V testu se používají geneticky modifikované buňky savců nebo kvasinkové buňky upravené transfekcí (umělým přenosem) DNA, která obsahuje genetickou informaci pro ER/AR funkčně spojené s ERE/ARE a DNA reporterového genu (Kinnberg 2003). Používané buněčné linie s endogenním ER/AR jsou například: - T47D buňky (lidské buňky zhoubného nádoru mléčných žláz prsu používané v systému ER/AR-CALUX ( ER/AR-mediated chemical activated luciferase gene expression )). - MCF-7 buňky a od nich odvozené MVLN buňky (lidské buňky zhoubného nádoru prsu) - Kvasinkové YAS nebo YES buňky připravené stabilní transfekcí genů pro AR nebo ER (Tab. 1). Jako reporterový gen v lidských nádorových buňkách je obvykle používán gen enzymu luciferázy a v kvasinkových buňkách tradičně gen enzymu β-galaktosidázy. Dnes se častěji používají kvasinkové kultury s reporterovým genem luciferázy (Michelini et al. 2005, Murk et al. 2002). Reporterový gen může být introdukován do buněk pouze dočasně (transientní transfekce) nebo trvale vytvořením nové buněčné linie (stabilní transfekce). Bez ohledu na to jestli jsou buňky transfekovány dočasně nebo trvale, interagují testované látky, které vstoupily do buněk, s ER/AR, který mohou aktivovat. Aktivovaný ER/AR se váže s rozpustnými buněčnými faktory a výsledný komplex se váže s HRE na reporterový plazmid. Tato vazba iniciuje expresi reporterového genu a následnou produkci enzymu. Nově syntetizovaný enzym umožňuje metabolickou reakci, při které vzniká měřitelný produkt (Kinnberg 2003). Při studiu agonistů (xenoestrogenity/xenoandrogenity) jsou buňky exponovány testovanými vzorky a indukce reporterového genu, jejímž výsledkem je měřitelný produkt, je použita pro hodnocení odpovědi. Pro ohodnocení relativního xenoestrogenního potenciálu směsi bývá indukce vyvolaná směsí srovnána s indukcí 17β-estradiolu, pro xenoandrogenitu s indukcí testosteronu nebo dihydrotestosteronu. Pokud naměřená data umožňují výpočet EC50 testované směsi, může být její relativní ED potenciál vyhodnocen srovnáním s EC50 17β-estradiolu (podrobný výpočet viz kapitola ), resp. testosteronu nebo dihydrotestosteronu (Kujalová et al. 2007, Kinnberg 2003). Při studiu antagonistů jsou buňky exponovány kromě vzorků zároveň referenčním estrogenem/androgenem (obvykle 17β-estradiolem/testosteronem nebo dihydrotestosteronem). Kontrolní buňky jsou exponovány pouze referenčním estrogenem/androgenem s přídavkem rozpouštědla tak, aby jeho množství bylo pro všechny buňky stejné. Odlišná indukce reporterového genu buněk exponovaných měřenými látkami s referenčním estrogenem/androgenem a exponovaných pouze referenčním estrogenem/androgenem umožňuje sledování možné antiestrogenity/antiandrogenity (Kinnberg 2003)

17 Další způsob hodnocení ED potenciálu látek pomocí in vitro testů je využití buněčných kultur, u kterých dochází k iniciaci luminiscence vazbou ligandů k více druhům receptorů. Příkladem je buněčná kultura MDA-kb2. U této buněčné kultury dochází k iniciaci luminiscence vazbou ligandů jak k androgennímu tak ke glukokortikoidnímu receptoru (GR). Pro rozlišení iniciace luminiscence indukované vazbou ligandu k AR a k GR je k látce přidáván antiandrogen hydroxyflutamid, který blokuje AR-dependentní transkripční reakce, ale ne GR-dependentní (Wilson et al. 2002). 3) Testy buněčné proliferace, které měří vzrůstající počet buněk během exponenciální fáze proliferace, tzv. Cell proliferation assays. Jsou používány linie MCF-7 buněk (lidské buňky pozdních fází metastatických nádorů prsních žláz žen). Nejznámějším testem je tzv. E-screen, ve kterém je měřena proliferace buněk indukovaná xenoestrogenními látkami a založená na následujících předpokladech: - Faktory v lidském séru inhibují proliferaci MCF-7 buněk. - (Xeno)estrogeny indukují buněčnou proliferaci tím, že negují inhibiční efekt séra. Řada autorů však poukazuje na nízkou specifitu testu vůči (xeno)estrogenům. MCF-7 buňky mohou proliferovat vlivem mitogenů, cytokinů, růstových faktorů, živin a různých hormonů. V kontrastu s nadhodnocením ED potenciálu látek v důsledku nízké specifity proliferace buněk může docházet také k podhodnocení vlivem zpomalení proliferace cytostatiky, cytotoxickými látkami nebo obecně inhibičními faktory (Kinnberg 2003)

18 Tab. 1: Srovnání důležitých parametrů jednotlivých in vitro testů (dle Kinnberg 2003, doplněno o data ze studií: Tollefsen et al. 2007, Leusch et al. 2006, Blankvoort et al. 2005, Bonefeld-Jorgensen et al. 2005, Michelini et al. 2005, Sonneveld et al. 2005, Bayen et al. 2004, Thomas et al. 2004, Svenson & Allard 2004, Murk et al. 2002, Wilson et al. 2002). Typ testu Měření afinity látek vůči ER/AR Testy odpovědi reporterového genu Test proliferace buněk Název testu Buněčná kultura Nároky na laboratorní vybavení Náročnost údržby buněčné kultury ER/AR binding Laboratoř vybavená pro manipulaci s radioaktivním materiálem ER/AR CALUX T47D MVLN MVLN Chymeric receptor MCF-7 HeLa HGELN Sterilní prostředí Relativně náročná MDA- -kb2 YES YAS MDA-kb2 Saccheromyces cerevisiae (Sterilní prostředí) Relativně jednoduchá E-screen MCF-7 Sterilní prostředí Relativně náročná Miniaturizace Ne Ano Ano Ano Relativně Relativně vysoké Relativně vysoké nízké Náklady Detekce antagonistů Ne Ano V omezené míře Relativně vysoké Trvání testu [dny] ~6 Detekční limit [ng E2/l]* 272 0,1 0, ,27 EC50 [ng E2/l] ,6 1 5, ,03-8,7 Ano Detekční limit [ng DHT/l] nebo [ng T/l]* EC50 [ng DHT/l] nebo [ng T/l] 290 0,0036 0,1 0,05-0,5 0,13 >1 10 * Zde uvedený detekční limit nezahrnuje možnost zakoncentrování vzorku. Nejnižší stanovitelné množství daných látek se v testech liší pro jednotlivé vzorky a je dáno jednak zde uvedeným limitem detekce (nejnižší koncentrací E2/T odlišitelné od negativní kontroly), jednak citlivostí buněk vůči cytotoxicitě, respektive množstvím cytotoxických látek ve vzorcích. Vethaak et al. (2002) např. uvádí limit detekce po zakoncentrování vzorku povrchové vody pro ER-CALUX test 0,001 ng EEQ/l. Odpadní vody na přítoku do ČOV musejí být většinou naopak ředěny, neboť nezředěné vzorky jsou příliš cytotoxické, čímž se reálný detekční limit oproti limitu uvedenému v tabulce naopak zvyšuje. Z pohledu testování xenoestrogenity, xenoandrogenity, antiestrogenity a antiandrogenity vzorků vody z reálného prostředí se nejvýhodněji jeví testy odpovědi reporterového genu

19 tzv. Reporter gene assays. Výběr konkrétního testu pak záleží na konkrétních požadavcích studie a možnostech laboratoře. Testy se stabilně transfekovanými kvasinkovými kulturami jsou nejméně náročné na údržbu kultury a jsou méně finančně nákladné než ostatní testy. Dále neobsahují jiné než transfekované steroidní receptory a tím pádem nedochází k jejich interakcím. Rostou v médiích, která neobsahují steroidní hormony, čímž se nezvyšuje pozadí odpovědi. Nevýhodou může být přítomnost buněčné stěny, která u živočišných buněk chybí a může bránit vstupu některých EDC do buněk. Jinou nevýhodou jsou možné odlišnosti v mechanismech aktivního transportu, které by mohly ovlivnit aktivity některých látek (Kinnberg 2003). Nezanedbatelnou výhodou některých kvasinkových in vitro testů je délka provedení méně než jeden den. Některé látky, klasifikované jako estrogenní antagonisté se v kvasinkových testech chovaly jako agonisté (Kinnberg 2003). Testy s kvasinkovými kulturami jsou méně citlivé než testy se savčími buněčnými liniemi. Někteří autoři uvádějí, že menší citlivost kvasinek oproti savčím buňkám je vykompenzována jejich lepší odolností vůči cytotoxickým látkám. Jejich výhodou ale bezesporu je nenáročnost na sterilní podmínky ve srovnání se savčími buňkami obzvlášť u jednodenních testů. Využití in vitro testů pro hodnocení xenoandrogenního a xenoestrogenního potenciálu odpadních vod In vitro testy umožňují kvantitativní hodnocení ED potenciálu environmentálních směsí minimálně pro vodní obratlovce bez nutné znalosti chemického složení směsí a mechanismu interakcí jednotlivých látek (např. Sumpter & Johnson 2005). Na mnoha místech světa v blízkosti zdrojů EDC, jako jsou čistírny průmyslových a městských odpadních vod (ČOV), výpustě odpadní vody z chovů dobytka a drůbeže a výrobny papíru, probíhá nebo proběhlo hodnocení relativního ED potenciálu vody pomocí in vitro testů (např. Ying et al. 2008, Vethaak et al. 2007, Leusch et al. 2006, Voogt et al. 2006, Snyder et al. 2001). Výsledky měření některých zahraničních studií jsou uvedeny v tabulce 13 na str. 56. Tato metoda je relativně finančně nenáročná v porovnání s chemickými analýzami. Jak již bylo řečeno, umožňuje hodnocení reálné směsi látek, aniž by byly zanedbány interakce jednotlivých látek, a umožňuje např. hodnocení efektivity odbourávání EDC jednotlivými čistírnami odpadních vod, sledování sezónní variability hladin EDC, výběr reprezentativních vzorků vhodných k dalším chemickým analýzám atd. (např. Sonneveld et al. 2005, Rutishauser et al. 2004, Svenson & Allard 2004). Porovnání dat z in vitro testů s daty z chemických analýz, laboratorních experimentů s živočichy a z in situ studií napomáhá interpretovat poznatky o ED (Kinnberg 2003, Sumpter & Johnson 2005). In vitro testy jsou používány k hodnocení potenciálních rizik ED v životním prostředí a významně přispěly k identifikaci jednotlivých EDC (např. Blankvoort et al. 2005, Leusch 2004, Thomas et al. 2004). Pokud je autorce známo, v České republice dosud neproběhla žádná studie zabývající se hodnocením relativního ED potenciálu odpadní ani povrchové vody pomocí in vitro testů. Studie Čížkové (2007) prokázala statisticky významné účinky EDC na bentických bezobratlých, kteří byly 4 a 8 týdnů chováni na sedimentech odebraných pod ČOV Modřice, Brno. Cílem této diplomové práce proto bylo vytvoření přehledu možných metodik

20 zpracování vzorků odpadní vody pro analýzy v in vitro testech a samotné zpracování a otestování xenoandrogenity a xenoestrogenity ve vzorcích odpadní vody na přítoku a pod výpustí z Čistírny odpadních vod Modřice, Brno. Testování vzorků odpadní vody probíhalo po dobu jednoho roku, vždy nejméně jedenkrát měsíčně souběžně s chemickými analýzami kvality vody prováděnými dlouhodobě laboratořemi ČOV Modřice, Brno. Výsledky měření budou také využity k porovnání s chemickými analýzami odpadní vody prováděnými v rámci projektu Národní program výzkumu II Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy, jehož hlavním řešitelem je Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě. Čistírna odpadních vod v Modřicích, Brno, na jejímž přítoku a odtoku byly odpadní vody odebírány, slouží k čistění odpadních vod přiváděných systémem kanalizačních stok z města Brna a prostřednictvím soustavy čerpacích stanic i z širokého okolí. V současnosti jde o jednu z nejmodernějších ČOV v České republice, neboť kolaudace rozsáhlé rekonstrukce původní ČOV proběhla teprve v roce Proces čištění vody zde probíhá v mechanickém, biologickém i chemickém stupni čištění. Po mechanickém čištění následuje usazování v usazovacích nádržích, odkud je voda přečerpána do nádrží aktivačních, kde prochází biologickým čištěním nejprve v anaerobním (anaerobní defosforylace a denitrifikace) a později v aerobním prostředí. Pro odstranění zbytku biologicky neodbouraného fosforu se používá chemické srážení. Podrobný popis všech stupňů čištění s nákresy, fotografiemi i technickými parametry jednotlivých zařízení, lze najít na internetových stránkách Brněnských vodáren a kanalizací. ( 3. MATERIÁL A METODY Praktická část diplomové práce se skládala z osvojení metod in vitro testů, návrhu a optimalizace metody zpracování odpadní vody pro testování relativního ED potenciálu pomocí in vitro testů, otestování výtěžnosti navržené metody, samotného zpracování a otestování vzorků odpadní vody a vyhodnocení získaných dat. Práce byla realizována na základě dohody s ČOV Modřice, Brno, která nám po dobu jednoho roku ochotně poskytovala automaticky odebírané směsné vzorky odpadní vody. Vzorky byly odebírány vždy nejméně jedenkrát měsíčně, a to v době, kdy bylo ČOV Modřice, Brno prováděno rozšířené hodnocení kvality odpadní vody. Výsledky zmíněného hodnocení nám ČOV Modřice poskytla pro lepší charakterizaci vzorků. Voda na přítoku do ČOV je v diplomové práci označena také jako surová odpadní voda Příprava vzorků pro test výtěžnosti navržené metody Na základě literární rešerše byl navržen postup přípravy vzorků odpadní vody pro testování jejího relativního ED potenciálu pomocí YAS in vitro testu a pomocí MVLN in vitro testu. Cílem bylo připravit vzorky odpadních vod pro stanovení xenoandrogenity, antiandrogenity a xenoestrogenity pomocí in vitro testů. Navržený postup se skládal z odběru reprezentativních vzorků, filtrace a extrakce co nejširšího spektra látek a ze zakoncentrování vzorků na známý objem. Vedlejším cílem bylo zakoncentrování xenoandrogenních a xenoestrogenních látek ve vzorcích s nízkou koncentrací těchto látek (v odtokové vodě) pro jejich následné stanovení v in vitro testech. Před zahájením vlastního testování vzorků byla provedena zkouška

21 výtěžnosti navržené metody přidáním vnitřního standardu 17β-estradiolu a testosteronu známých koncentrací. Chemikálie a spotřební materiál - GF filtry (1 µm póry, Whatman, Schleider δ Sehnell) - 100% methanol - SPE kolonky C18 se sorbentem octadecylsilica Objem kolony: 3 ml Množství sorbentu: 0,5 g Značky kolon: Supelclean LC-18 Tubes nebo Applied Separations, Spe-edTM SPE Cartridges, Octadecyl C18/18% Množství vody na 1 kolonu: 0,5 l surové nebo odtokové vody - Těsnící zátky na SPE kolony - Teflonové hadičky pro převedení vzorku při SPE - Čisté 20ml skleněné uzavíratelné nádobky na eluci SPE kolon nebo disků, víčka, septa - Čisté 1,5ml skleněné vialky, víčka, septa Přístroje - Skleněná filtrační aparatura - Aparatura pro SPE (manifold s regulací tlaku, kohouty pro regulaci průtoku kolonami/disky) - Elektrická vývěva/pumpa - Tlaková dusíková bomba se střičkami - Pro urychlení zakoncentrování vzorků rotační vakuová odparka (není nezbytně nutná) Postup A) Přidání vnitřního standardu (17β-estradiolu a testosteronu) do vody - Do 2 l destilované vody ve třech opakováních přidat 0,5 ml 10000pM E2 a 0,5 ml 1µM T. - Nádoby s vodou by měly být skleněné, aby nedocházelo k vyluhování látek ze sběrných nádob. B) Předfiltrace a filtrace Filtrace je prováděna za účelem odstranění větších částic ve vzorcích odpadní vody, které by mohly ucpat SPE kolonu při pozdější extrakci. - Filtrace GF filtry (póry 1 µm) za použití vakua

22 C) SPE Široké spektrum organických látek ze vzorku se sorbuje na pevné fázi C18 kolony obsahující sorbent octadecylsilica. Následně jsou látky převedeny do malého množství rozpouštědla (methanolu). Kondicionace SPE kolony - Pro 0,5 l vody použít jednu C18 kolonu - Pokyny ke konkrétním typům kolon jsou uvedeny na příbalových letácích od výrobce. V případě použití SPE kolonky C18 o objemu 3 ml a množství sorbentu 0,5 g (značka kolon: Supelclean LC-18 Tubes nebo Applied Separations, Spe-edTM SPE Cartridges, Octadecyl C18/18%) postupovat takto: - Aktivace 5 ml 100% MeOH (bez použití podtlaku) - Ekvilibrace 5 ml vody (možno použít podtlak) Převedení vzorku - Vzorek převést za použití podtlaku (max. 10 mm Hg), průtok max. 15 ml/min (voda by měla z kolonky vykapávat, ne vytékat). - Po převedení vzorku sušit kolonu proudem vzduchu (cca 10 min). Eluce analytu - Eluci kolony provést 10 ml methanolu (možno použít podtlak cca 5 mm Hg). - Eluát v případě potřeby skladovat v -18 C. D) Zakoncentrování eluátu - Eluát (asi 40 ml MeOH každého vzorku o původním objemu 2 l) odpařit do cca 500 µl na rotační vakuové odparce (teplota lázně 45 C, tlak 200 mbar), převést do kalibrované vialky a zakoncentrovat pod dusíkem na konečný objem vzorku 0,5 ml. - Vzorky neodpařovat do sucha. - Vzorky ve vialkách před analýzou skladovat v -18 C Původní metodika zpracování vzorků odpadní vody z ČOV Modřice, Brno, pro testování v in vitro testech Po prokázání více jak 98% výtěžnosti pro obě modelové látky (17β-estradiol a testosteron) byly odebrány první vzorky odpadní vody na přítoku a na odtoku z ČOV Modřice, Brno, bylo provedeno jejich zpracování dle výše navržené metody a otestování xenoandrogenity a xenoestrogenity pomocí in vitro testů. Postup zpracování vzorků včetně spotřebního materiálu a přístrojového vybavení je shodný jako zpracování vzorků pro testy výtěžnosti, novou částí je pouze odběr vzorků odpadní vody:

23 - Směsné vzorky odebrat automatickým vzorkovačem každých 120 min po dobu 24 hodin, dle možností a technického vybavení ČOV Modřice, Brno. - Objem odebraného vzorku: 2 l surové vody a 2 l vody na odtoku - Vzorky zpracovat do 48 hodin, nejlépe tentýž den. - Vzorkovací nádoby by měly být skleněné se skleněnými nebo teflonovými zátkami, aby nedocházelo k vyluhování látek ze sběrných nádob. Vzorky surové vody i vody na odtoku z ČOV byly odebírány ve stejný den. Doba zdržení vody v ČOV Modřice, Brno, je zhruba 24 hodin. Pro kontrolu, zda je možné správně stanovit efektivitu odbourávání EDC pomocí vzorků surové vody a vzorků na odtoku odebraných tentýž den, byly pomocí in vitro testů měřeny dva mimořádné vzorky surové vody odebrané o 24 hodin dříve než vzorky vody na odtoku. Dva směsné vzorky surové vody (každý po 2 l) odebrané 9. a byly centrifugovány a jejich pevná část byla lyofilizována a extrahována na Soxhletově extraktoru (150 ml DCM, 40 min. extrakce, 20 min. vyplachování). Následně byly převedeny do MeOH a zakoncentrovány pod dusíkem na objem 0,5 ml. Takto zpracované vzorky jsou označeny jako pevná část surové odpadní vody Optimalizované zpracování vzorků odpadní vody z ČOV Modřice, Brno pro testování v in vitro testech Na základě výsledků prvních in vitro testů byl postup zpracování vzorků odpadní vody optimalizován. Změny zahrnovaly odběr nižšího objemu vzorků, zavedení předfiltrace pomocí sklovité vaty a filtrů s vyšší porositou (2,7 µm) a nahrazení původně navržených C18 kolon pro SPE za SDB kolony. Výtěžnost E2 nebo T nebyla pro SDB kolony ověřována obdobným způsobem jako u C18 kolon, neboť tak bylo učiněno několika studiemi, které se shodovaly ve výtěžnosti nad 98 %. Bylo ale odebráno dvakrát větší množství vzorku surové vody a vzorek byl rozdělen na dvě části. Oba díly byly zpracovány stejně pouze s tím rozdílem, že u jednoho probíhala SPE přes C18 kolonu, u druhého přes SDB kolonu. Chemikálie a spotřební materiál Na tomto místě jsou uvedeny pouze změny spotřebního materiálu nebo materiál navíc oproti chemikáliím a spotřebnímu materiálu popsanému výše: - Sklovitá vata. - GF filtry (2,7 µm póry) např. značka Filap s.r.o. ISO 9001 SCQ-6250, průměr 47 mm, Z=4. - C18 kolony nahrazeny za: SDB kolonu značky Waters Oasis, 20cc, 1 g sorbentu pro 1 l surové vody (nebo SDB kolonu značky Waters Oasis, 12cc, 0,5 g sorbetu pro 111 ml surové vody) a SDB kolona značky Waters Oasis, 12cc, 0,5 g sorbetu pro 1 l vody na odtoku

24 Přístroje - Stejné jako v kap Příprava vzorků pro test výtěžnosti navržené metody Postup A) Odběr vzorků - Postup je stejný jako v kap Původní metodika zpracování vzorků odpadní vody pro testování v in vitro testech. Liší se pouze množství vzorku. - Objem odebraného vzorku: 1 l surové vody a 1 l odtokové vody (při posledním odběru v dubnu 2008, 111 ml surové vody a 1 l odtokové vody). B) Předfiltrace a filtrace - Předfiltrace surové vody přes sklovitou vatu bez použití podtlaku. - Filtrace surové vody přes GF filtry (póry 2,7 µm) za použití vakua. - Filtrace surové vody a vody z odtoku přes GF filtry (póry 1 µm) za použití vakua. - Sklovitou vatu a filtry z jednotlivých vzorků nechat co nejvíc proschnout na filtrační aparatuře. Filtry a vatu ponechat převrstvené methanolem v kádince 10 min v ultrazvukové lázni. Poté přidat síran amonný na zadržení vody a přefiltrovat přes sklovitou vatu. Postup dvakrát opakovat. Zakoncentrovat na vakuové odparce (při 45 C a 200 mbar) a zkoncentrovat pod dusíkem na objem 0,5 ml. C) SPE Kondicionace SPE kolony - Pro 1 l surové vody použít SDB kolonu značky Waters Oasis, 20cc, 1g sorbentu (Pro vzorek 111 ml surové vody použít SDB kolonu značky Waters Oasis, 12cc, 0,5 g sorbentu). - Pro vzorek odtokové vody použít SDB kolonu značky Waters Oasis, 12cc, 0,5g sorbentu. - Pokyny ke konkrétním typům kolon jsou uvedeny na příbalových letácích od výrobce. V případě extrakce surové odpadní vody použít SDB kolonu značky Waters Oasis, 20cc, 1g sorbentu a postupovat takto: - Aktivace 10 ml 100% MeOH (bez použití podtlaku) - Ekvilibrace 10 ml vody (možno použít podtlak) V případě extrakce vody z odtoku použít SDB kolonu značky Waters Oasis, 12cc, 0,5 g sorbetu postupovat takto: - Aktivace 8 ml 100% MeOH (bez použití podtlaku) - Ekvilibrace 8 ml vody (možno použít podtlak)

25 Převedení vzorku - Vzorek převést za použití podtlaku (postačí cca 5 mm Hg), průtok cca 8 ml/min (voda by měla z kolonky vykapávat, ne vytékat). - Po převedení vzorku sušit kolonu proudem vzduchu (cca 15 min). Eluce analytu - Eluovat kolony 20cc, 1 g sorbentu provést 15 ml methanolu. Pokud rozpouštědlo nevykapává z kolony samovolně, je možné eluci urychlit krátkým použitím podtlaku (max. 5 mm Hg). - Eluci kolony 12cc, 0,5 g sorbentu provést 12 ml methanolu bez použití podtlaku. Eluci je možné urychlit krátkým použitím podtlaku (max. 5 mm Hg). - Eluát v případě potřeby skladovat v -18 C. D) Zakoncentrování eluátu - Pomocí vakuové odparky (teplota lázně 45 C, tlak 200 mbar) a odfoukání dusíkem zakoncentrovat vzorky surové vody o objemu 1 l na 1 ml, pokud bylo odebráno 111 ml surové vody, pak tento vzorek zakoncentrovat na 0,5 ml. Vzorky odtoku zakoncentrovat na konečný objem 0,5 ml In vitro testy (YAS, MVLN) Principem testů je měření luminiscence vyvolané odpovědí na základě iniciace transkripce reporterového genu způsobené vazbou (xeno)androgenní/(xeno)estrogenní látky k AR resp. ER. Standardně jsou používány testovací mikrodesky s 96 jamkami. Každá deska obsahuje minimálně rozpouštědlovou kontrolu branou jako pozadí, kalibrační řadu standardní látky (T nebo E2) a minimálně tři koncentrace každého vzorku, které nepřekročily 30% cytotoxicitu v testech cytotoxicity. Jako negativní kontrola, zda-li nejsou buňky příliš citlivé vůči rozpouštědlu slouží buňky bez přídavku rozpouštědla nebo jiných látek. Každá koncentrace je měřena ve třech opakováních. U všech vzorků byla nejprve zjišťována cytotoxicita pro buňky daného testu. Měření cytotoxicity je u YAS testu odlišné než u MVLN testu, jak bude popsáno níže v textu Testování xenoandrogenity - YAS test Vedle testu xenoandrogenity, vždy zároveň probíhal kontrolní kvasinkový test, aby byly odlišitelné změny v luciferázové aktivitě, které jsou způsobené cytotoxicitou. Pro měření androgenity byl používám kmen BMAAREluc/AR (AR). Cytotoxicita pro kvasinkové buňky je měřena jako pokles luminiscence buněčného kmenu luc=bma64luc (Michelini et al. 2005). Manipulace s médii a buňkami byla prováděna za sterilních podmínek v laminárním boxu

26 Chemikálie a spotřební materiál Všechen materiál musí být sterilní - Plastové Petriho misky o průměru 10cm - Klička pro přenos kvasinkových kultur - Špičky - Láhve na média - Sterilní zkumavky s víčky - Opakovací pipeta - 30 o C inkubátor s míchačkou pro inkubaci - Míchačka na mikrodestičky - Yeast nitrogen base w/o amino acids (BD DifcoTM) - Yeast synthetic drop-out mix w/o leu, his, ura, trp (Sigma) - Bakto-Agar (BD Difco) - Histidin (Sigma) - Adenin hemisufát (Sigma) - Leucin (Sigma) - Tryptofan (Sigma) - Glukóza - D-luciferin (Bio Thema) - Citrát trissodný - Kyselina citrónová - HCl nebo NaOH pro úpravu ph Přístroje - Třepačka - Spektrometr (Varian cary 50 Bio, UV visible spectrophotomet) - Luminometr s dispensory (Luminoskan Ascent, DLReady TM ) Postup A) Příprava médií Synthetic Minimal Medium (SD medium) - Rozpustit 6,7 g yeast nitrogen base w/o amino acids v 910 ml vody. Toto množství dodržet, pokud je síran amonný v basi obsažen. Pokud base neobsahuje síran amonný, tak ho tam 5 g/l přidat a přidat jen 1,7 g/l base bez síranu. - Sterilizovat v autoklávu. - Přidat sterilně glukózu a nezbytné aminokyseliny dle tabulky 2 Roztoky na doplnění média. Synthetic Complex Medium (SD medium) - Rozpustit 6,7 g yeast nitrogen base w/o amino acids v 910 ml vody. Toto množství dodržet, pokud je síran amonný v basi obsažen. Pokud base neobsahuje síran amonný, tak ho tam 5 g/l přidat a přidat jen 1,7 g/l base bez síranu

27 - Dále přidat 1,4 g/l yeast synthetic drop-out mix w/o leu, his, ura, trp. - Upravit ph na 5,6 pomocí HCl nebo NaOH. - Autoklávovat. - Přidat sterilně glukózu a nezbytné aminokyseliny dle tabulky 2 Roztoky na doplnění média. Tab. 2: Roztoky na doplnění média: Přídavky do Koncentrace roztoků Kmen média Zdroj uhlíku 50ml/l glukóza 40 %w/v (40g/100ml konečného objemu) AR, luc 100x koncentrované aminokyseliny 10ml/l histidin 2g/l AR, luc 10ml/l adenin 5g/l AR, luc 10ml/l leucin 10g/l AR, luc 10ml/l tryptofan 2g/l luc Zkratky kmenů: luc=bma64luc, AR=BMAAREluc/AR - Roztok glukózy připravený podle tabulky 2 sterilizovat v autoklávu. Roztoky aminokyselin sterilizovat přefiltrováním přes filtry o velikosti 0,22 µm. - Do média pro kontrolní kmen luc je navíc přidávána aminokyselina tryptofan, a to jak do minimálního tak do komplexního média. Všechny složky médií uchovávat při pokojové teplotě kromě tryptofanu (+ 4 o C). Luciferázový zásobní roztok (2x koncentrovaný) - Připravit pufr citrátu sodného (0,2 M, ph 5) smícháním 35 ml 0,2M kyseliny citrónové s 65 ml citrátu trissodného (0,2M). - Přidat D-luciferin do konečné koncentrace 2 mm, míchat pomocí magnetické míchačky dokud se nerozpustí. Luciferin je citlivý na světlo - musí být chráněný před světlem během přípravy. - Roztok rozdělit všechno po 5 ml (2xkoncentrované) a uchovávat při -20 o C. Příprava roztoku luciferinu (1x koncentrovaný) - Před měřením v luminometru smíchat 5 ml 2x konc. roztoku luciferinu s 5 ml destilované vody k získání 1x koncentrovaného roztoku (1mM) luciferinu. B) Příprava agarových ploten (20 g agar/l konečný objem) - 20 g/l bakteriálního agaru dát do láhve a přidat příslušné množství komplexního média bez cukru a aminokyselin. Naplnit láhev maximálně do poloviny celkového objemu agar během autoklávování bobtná. - Sterilizovat v autoklávu jako kapaliny. - Následující kroky musejí být provedeny za sterilních podmínek ve flow-boxu

28 - Po autoklávování počkat až láhev trochu vychladne, aby bylo možné ji vzít do rukou a rozdělit obsah na části podle toho, kolik agaru bude potřeba ihned. Zbytek agaru může být uchováván za pokojové teploty ve sterilních lahvích, které byly autoklávovány. Tento ztuhlý zásobní materiál může být roztaven v mikrovlnné troubě. - Přidat příslušný zdroj uhlíku a aminokyseliny (dle Tab. 2). - Nalít agar na sterilní plotny (asi 30 ml agarového roztoku na plotnu o průměru 10 cm) a nechat nezakryté ztuhnout. - Agarové plotny uchovávat při pokojové teplotě dnem vzhůru tzn. agarovou stranou nahoru. C) Zahájení kultivace z glycerolové zmrzlé kultury - Glycerolové zmrzlé kultury vydělat z mrazáku a udržovat je na ledu po celou dobu manipulace s nimi. - Za sterilních podmínek ve flow-boxu odejmout malou část buněk z povrchu zamrzlé kultury sterilní tyčkou. - Přenést toto malé množství kultury na agar, nanést jej ve 3 různých směrech přes plotnu. - Zbývající zmrzlou kulturu vrátit zpět do -70 o C. - Kultivovat agarové plotny dnem vzhůru ve 30 o C asi dva dny ve tmě - do velikosti kolonií zhruba 1 mm. - Naočkované agarové plotny uchováváme v -4 C po dobu maximálně tří týdnů. D) Nárůst kultur v roztoku příslušného média - zahájení pre-kultivace z agarové plotny - Pracovat ve flow-boxu a udržovat vše sterilní. - Odměřit 3 ml SD-minimálního média do sterilní zkumavky. - Sterilní tyčkou si vybrat samostatnou kvasinkovou kolonii na agarové plotně a přenést ji do tekutého média v baňce nebo zkumavce s víčkem. Víčko neutěsňovat úplně. - Buňky rozsuspendovat pomocí sterilní tyčky. - Inkubovat baňku ve 30 o C s mírným třepáním ve tmě. E) Testování vzorků Testování látek je prováděno v 96-jamkových kultivačních deskách, celý test od přichystání roztoku kvasinek o příslušné optické hustotě až po změření aktivity luciferázy trvá 5h. - Naočkované kvasinkové pre-kultury v minimálním médiu přes noc v tmavém prostředí za třepání ve 30 o C narostou. - Změřit OD 600nm (optická denzita) z dvacetkrát naředěné kultury - Důležité měření OD u kvasinek jsou lineární jen do hodnoty OD 600nm =0,3. Vyšší OD 600nm odezvy nejsou lineární, v tom případě je potřeba roztok pro měření více rozředit. - Z naměřených hodnot OD vypočítat rozředění v SD médiu o teplotě 30 o C pro celou desku popřípadě desky. Rozředění musí být takové, aby konečná hodnota OD 600nm kultury byla okolo 0,

29 - Takto připravené kultury dát zpátky třepat do inkubátoru při teplotě 30 o C do tmy na 2 hodiny k dosažení OD 600nm 0,6-0,7. - Pipetovat 100 µl kvasinkové kultury pomocí opakovací pipety na destičku do každé jamky (96x). - Přidat: I. 1 µl vzorku zředěného v MeOH. Finální koncentrace MeOH nesmí přesáhnout v jamce 2%. II. Negativní kontrolu (v případě testů cytotoxicity v 6-9 opakováních) 1 µl rozpouštědla/jamka. III. Pozitivní kontrolu testosteron, případně dihydrostosteron, nejméně v 6 různých koncentracích (v rozsahu 0,01; 0,1; 1; 10; 100 a 1000 nm) pro sestrojení kalibrační křivky (v případě testů cytotoxicity pozitivní kontrolu netestovat). - Přikrýt destičku páskou nebo víčkem a třepat 20 s na třepačce. - Inkubace při 30 o C ve tmě po dobu 2,5 h. - Po inkubaci využitím dispenzorů v luminometru vstřikovat 100 µl 1 mm roztoku luciferinu do každé jamky. - Měřit hned luminometrem odpověď vzorku je stálá pouze okolo 5-ti minut Testování xenoestrogenity - MVLN test Buněčná linie MVLN je odvozena od linie MCF-7. Jedná se o buňky lidského karcinomu prsu, které jsou stabilně transfekovány luciferázovým genem (Janosek et al. 2007, Demirpence et al. 1993). Tento gen je pod kontrolou estrogenního receptoru (ER). ER-specifická transkripční aktivita je přímo spojená se syntézou luciferázy, jejíž aktivita je stanovována luminiscenčně. Cytotoxicita pro buňky MVLN je měřena pomocí barviva neutrální červeně, které se váže na živé buňky. Vyhodnocení probíhá spektrofotometricky při vlnové délce 570 nm. Vzorky byly jak pro zjištění cytotoxicity, tak pro hodnocení xenoestrogenity testovány minimálně ve třech koncentracích. Pro výpočet xenoestrogenity byly zvoleny pouze takové koncentrace vzorků, které nepřekračovaly 30% cytotoxicitu. Chemikálie a spotřební materiál - Kultivační médium: DMEM F % FCS + 1% L-Glu (bez fenolové červeně) - Médium pro nasazení buněk: DMEM F % dialyzovaného a stripovaného FCS + 1% L-Glu - Expoziční médium: DMEM F12 (bez aditiv) - 96-jamkové desky, trypsin, MeOH - Sterilní i nesterilní PBS (ph 7,2; složení na 1 l: 8g NaCl, 0,2g KCl, 2,89g Na 2 HPO. 4 2H 2 O, 0,2g KH 2 PO 4 ) - Luciferázový kit (složení na jednu desku): 0,6 ml Steady Glo kitu (Biothema) + 2,4 ml lyzačního pufru + 3 ml chudého média (Dulbeccos s Modified Eagle s Medium Base, Sigmna) Složení lyzačního pufru na 100ml (ph 7,8): 121,14 mg 10mM TRIS (2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol); 30,8 mg 2nM dithiotheitolu a 76,08 mg 2nM EGTA (C 14 H 24 N 2 O 10 )

30 - Roztok neutrální červeně (sterilně přefiltriovaný (porozita 0,22 µm) roztok: 5 mg neutrální červeně (Sigma Aldrich) rozpuštěné v 10 ml expozičního média) - Lyzační roztok pro test s neutrální červení (25 ml vody, 25 ml ethanolu, 0,5 ml kyseliny octové) - 1M NaOH a 1M HCl na úpravy ph Přístroje - Třepačka - Luminometr (Luminoskan Ascent, DLReady TM ) - Spektrofotometr (PowerWawe, Biotek) Postup A) Pasážování buněk - Buňky kultivovat v médiu DMEM-F12 s přídavkem 10 % telecího hovězího séra (FBS) a 1 % L-Glutaminu. - Generační doba buněk je zhruba 30h. - Při celistvém pokrytí (100% konfluenci) dna kultivační lahve buňkami pasážovat buňky následovně: - Odsát médium. - Opláchnout 2x 1,5 ml PBS. - Rozsuspendovat buňky za použití trypsinu - 0,5 ml na malou láhev, 1 ml na velkou láhev. - Počkat zhruba 7 minut, buňky se snadno uvolní ode dna. - Rozsuspendovat proti vnitřnímu rohu či vnitřní hraně lahve. - Buňky v suspenzi jsou připraveny pro napipetování do jamek či převedení do nové lahve. - Buňky pasážovat v poměru zhruba 1/5 (při 100% konfluenci) a to každé 2-3 dny. B) Testování (xeno)estrogenní aktivity vzorků Testování vzorků bylo prováděno v 96-jamkových kultivačních deskách, celý test od nasazení buněk do jamek po změření aktivity luciferázy trvá 48h. Pro 24h inkubaci byly buňky nasazeny v DMEM-F % stripovaného/dialyzovaného FBS + 1 % L-Glutaminu. Toto médium bylo použito už pro resuspendaci buněk v lahvi. Stripování (ošetření séra aktivním uhlím) je nutné z důvodu odstranění interferujících látek (estrogenních hormonů) přirozeně obsažených v séru. Pro expozici testované látce bylo použito DMEM-F12. - Kultivované buňky linie MVLN nasadit do jamek 96-jamkové desky o koncentraci buněk/jamka pro 24h expozici (použití 100 µl média DMEM-F % strip./dial. FBS + 1 % L-Glut. na jamku). - Po 24hodinové inkubaci v termostatu (37 C, 5% CO 2 ) jsou buňky exponovány: I. testovanými extrakty vzorků

31 II. negativní kontrole - čisté rozpouštědlo III. pozitivní kontrole - 17ß-estradiol (E2) - nejméně 6 různých koncentrací (1,2; 3,7; 11,1; 33,3; 100 a 500 pm) pro sestrojení kalibrační křivky. Nejprve nadávkovat vzorek do média (čisté DMEM-F12) v poměru 1 µl vzorku/100 µl média, a poté nadávkovat 100 µl této směsi do jamky. Vzorek je tedy v jamce v koncentraci 0,5 % (200x naředěný). Po 24hodinové inkubaci (expozici) byla změřena aktivita indukované luciferázy v buňkách. Následující úkony není nutno provádět ve sterilním prostředí. - Expoziční směs z jamek odpipetovat, buňky opláchnout PBS a poté do každé jamky nadávkovat 100 µl luciferázového kitu. - Desku ponechat 15 minut třepat. - Při použití průhledných mikrojamkových desek pro kultivaci s následnou expozicí je nutno po 15minutovém třepání obsah všech jamek přepipetovat do bílých (neprůhledných) desek vhodných pro měření luminiscence. - Na luminometru změřit aktivitu indukované luciferázy. C) Testování cytotoxicity vzorků Expozice buněk je prováděna stejným způsobem jako při testování (xeno)estrogenní aktivity vzorků, ale buňky nejsou exponovány pozitivní kontrole a negativní (rozpouštědlová) kontrola je pipetována v 6-9 opakováních. - Po 24hodinové inkubaci (expozici) přidat do každé jamky 50 µl roztoku neutrální červeně. - Neutrální červeň přidat také do 5 jamek, které neobsahují buňky, ale pouze PBS pro zjištění pozaďových hodnot měření. - Buňky 60 min. inkubovat. - Po inkubaci odsát médium s neutrální červení z jamek a přidat do každé z nich 150 µl lyzačního pufru pro test s neutrální červení. - Desku nechat 15 min. třepat. - Zkontrolovat pod mikroskopem lyzi buněk. - Změřit absorbanci buněk při vlnové délce 570 nm Vyhodnocení, analýza dat Analýza dat cytotoxicity vzorků Naměřená odpověď buněk exponovaných vzorky byla procentuálně vztažena k odpovědi buněk exponovaných rozpouštědlem, která představovala 100% viabilitu (viabilita [%] = 100 % - cytotoxicita [%]). Výsledky testů cytotoxicity byly zpracovány v programu Statistica for Windows 7 (StatSoft, Tulsa, Oklahoma). Pro výpočty nejnižší naměřené koncentrace vykazující statisticky významně rozlišnou odpověď (LOEC) oproti rozpouštědlové kontrole byla použita analýza rozptylu - ANOVA. Po splnění Levenova testu homogenity rozptylu (p<0,05) byl použit LSD post hoc test (p<0,05)

32 Z lineární části křivky dávka-odpověď byla logaritmickou regresní rovnicí generovanou v programu MS Excel počítána 25% cytotoxicita vzorků (IC25). Hodnota spolehlivosti R 2 se u naprosté většiny vzorků pohybovala okolo 0,97-0, Výpočet limitu detekce in vitro testů Pojem limit detekce je v literatuře používán pro dvě odlišné hodnoty. Limit detekce daného testu je určen citlivostí buněk vůči xenoandrogenním respektive xenoestrogenním látkám, zatímco limit detekce pro konkrétní vzorek je určen jednak touto citlivostí a jednak cytotoxicitou vzorku. Z důvodů odlišení těchto dvou pojmů budu v diplomové práci používat název limit detekce (LOD) pro limit detekce daného testu, zatímco limit detekce pro konkrétní vzorek budu označovat jako nejnižší stanovitelné množství (NSM). Limit detekce daného testu byl stanoven jako LOEC křivek dávka-odpověď pro testosteron nebo 17β-estradiol (dále jen LOEC T nebo LOEC E2). Pro výpočet LOEC T nebo LOEC E2 byla použita stejná metoda jako v případě výpočtů LOEC u parametru cytotoxicity. Výpočet NSM v YAS testu: Expozice buněk testosteronem byla v YAS testu prováděna přidáním 1 µl roztoku T do jamky, které obsahovaly 100 µl média. To znamená, že pokud byla LOEC T 2,88 ng T/l, musel mít roztok T přidávaný do jamky stokrát vyšší koncentraci, tedy 288 ng T/l. Tato koncentrace roztoku byla podělena nejvyšší koncentrací vzorku, jejíž cytotoxicita nebyla vyšší než 30 %. Nejnižší stanovitelné množství AEQ: AEQ ng/l = LOEC T [ng T/l] x 100 / nejvyšší koncentrace vzorku, jehož cytotoxicita < 30 % [µl vody/100 µl média v jamce] Výpočet NSM v MVLN testu: Expozice buněk 17β-estradiolem (E2) byla v MVLN testu prováděna přidáním 1 µl roztoku E2 do jamky, která obsahovala 200 µl média. To znamená, že pokud byla LOEC E2 0,33 ng/l, musel mít roztok E2 přidávaný do jamky dvěstěkrát vyšší koncentraci, tedy 66,9 ng E2/l. Tato koncentrace roztoku byla podělena nejvyšší koncentrací vzorku, jejíž cytotoxicita nebyla vyšší než 30 %. Nejnižší stanovitelné množství EEQ: EEQ ng/l = LOEC E2 [ng E2/l] x 200 / nejvyšší koncentrace vzorku, jehož cytotoxicita < 30 % [µl vody/200 µl média v jamce] Výpočet relativního xenoandrogenního potenciálu odpadní vody Nejnižší stanovitelné množství xenoandrogenních látek bylo omezeno vysokou cytotoxicitou vzorků pro kvasinkové buňky, proto nemohla být u žádného vzorku stanovena křivka dávka-odpověď. Xenoandrogenní potenciál vzorků byl hodnocen na základě bodového odhadu

33 Pro měření xenoandrogenity byly testovány pouze takové koncentrace vzorků, které nepřesahovaly 30% cytotoxicitu. I tak byla cytotoxicita jednotlivých koncentrací vzorků zohledněna tzv. normalizací dat. Hodnota luminiscence vzorků byla vyjádřena jako procenta odpovědi vzhledem k maximální odpovědi buněk vůči T. Změřená odpověď (% odpovědi oproti max. odpovědi T) každé koncentrace vzorků byla vydělena viabilitou buněk naměřenou v testech cytotoxicity (viabilita = 1 - cytotoxicita). Z části křivky dávka-odpověď pro T byla v programu MS Excel logaritmickou regresí vypočítána koncentrace testosteronu, která vyvolala procentuálně stejnou odpověď, jako byla maximální dosažená odpověď vzorku. Zjištěná koncentrace T v jamce byla stokrát vynásobena, protože byla způsobena přidáním 1 µl roztoku T do 100 µl média, podobně jako byla luminiscence vzorku vyvolaná přidáním 1 µl vzorku do 100 µl média v jamce. Protože 1 µl vypočítané koncentrace T vyvolal stejnou odpověď jako 1 µl příslušného ekvivalentu vody, byla koncentrace T vydělena ekvivalentem vody vzorku, který způsobil maximální odpověď. Bodový odhad relativního xenoandrogenního potenciálu: AEQ mg/l = ECi pro T [ng T/l] x 100 / ECi vzorku po normalizaci [µl vody/100 µl média v jamce] Výpočet relativního xenoestrogenního potenciálu odpadní vody Pro měření xenoestrogenity byly opět testovány pouze takové koncentrace vzorků, které nepřesahovaly 30% cytotoxicitu. Luminiscence buněk exponovaných vzorky byla procentuálně vztažena k maximální odpovědi buněk na E2. Stejně jako při výpočtu xenoandrogenního potenciálu byla data normalizována vzhledem k cytotoxicitě. V programu MS Excel byla logaritmickou regresí vypočítána EC50 křivky dávka-odpověď 17β-estradiolu v jednotkách pm nebo ng E2/l přítomných v jamce a také EC50 křivky dávka-odpověď vzorků v jednotkách µl vody na jamku. Hodnota EEQ byla zjištěna jednoduchým podílem EC50 17β-estradiolu a EC50 vzorku. EC50 17β-estradiolu byla přitom dvěstěkrát vynásobena, protože roztok působící výslednou odpověď byl do média v jamkách přidáván v poměru 1:200 (E2:médium). Relativní xenoestrogenní potenciál: EEQ ng/l = EC50 pro E2 [ng E2/l] x 200 / EC50 vzorku po normalizaci [µl vody/200 µl média v jamce] U některých vzorků vody z odtoku nepřesahovala indukce luminiscence 25 % odpovědi E2 ani v nejvyšších měřených koncentracích (2000 µl vody/jamku, což odpovídá 10krát koncentrované vodě na odtoku z ČOV). U takovýchto vzorků byl obdobně jako při výpočtu xenoandrogenity z křivky dávka-odpověď pro E2 stanoven bodový odhad koncentrace E2, která vyvolala procentuálně stejnou odpověď jako byla maximální dosažená odpověď vzorku. Zjištěná koncentrace E2 v jamce byla 200krát vynásobena, protože byla způsobena přidáním 1 µl roztoku E2 do 200 µl média. Jeden µl vypočítané koncentrace roztoku E2 vyvolal stejnou odpověď jako 1 µl

34 vzorku příslušného ekvivalentu vody, proto byla koncentrace roztoku E2 vydělena tímto ekvivalentem vody. Bodový odhad relativního xenoestrogenního potenciálu: EEQ ng/l = ECi pro E2 [ng E2/l] x 200/ ECi po normalizaci vzorku [µl vody/200 µl média v jamce] Výpočet efektivity odstranění xenoandrogenních a xenoestrogenních látek Procenta odstranění látek s xenoandrogenním a xenoestrogenním potenciálem byla vypočítána jako 100 % mínus procentuální podíl těchto látek v odtokové vodě a na přítoku do ČOV. Procenta odstranění xenoandrogenních nebo xenoestrogenních látek = = 100% - ((množství xenoandrogenních nebo xenoestrogenních látek ve vodě na odtoku z ČOV / množství na přítoku) x 100%) 4. Výsledky 4.1. Výtěžnost navržené metody zpracování vzorků odpadní vody Výtěžnost metody zpracování vzorků odpadní vody pro T a E2 byla v obou případech nad 98 % (Graf 1, Graf 2). Tyto výsledky budou diskutovány. 140 % odpovědi vůči 10 nm T Kvas MeOH 0, Kontrola T [nm] X1 X2 X2 Vzorky výtěžnosti SPE Graf 1: Výtěžnost zpracování vzorků odpadní vody pro měření xenoandrogenního potenciálu pomocí YAS in vitro testu. Jako standardní látka byl použit 10nM testosteron. Chybové úsečky označují směrodatnou odchylku

35 180 % odpovědi vůči 50 pm E Buňky MeOH 1,2 3,7 11,1 33, Kontrola E2 [pm] X1 X2 Vzorky výtěžnosti metody Graf 2: Výtěžnost zpracování vzorků odpadní vody pro měření xenoestrogenního potenciálu pomocí MVLN in vitro testu. Jako vnitřní standard byl použit 50pM 17β-estradiol. Chybové úsečky označují směrodatnou odchylku (u vzorku X1 byla směrodatná odchylka menší než grafické rozlišení grafu) Optimalizace postupu přípravy vzorků odpadní vody pro testování v in vitro testech Filtrace vzorků přes GF 1 µm byla velmi pomalá, proto jsme se pokusili surovou vodu centrifugovat. Tato optimalizace metody se ale ukázala časově ještě náročnější, protože max. objem nádob v centrifuze byl 400 ml a objem odebraných vzorků surové vody byl 2 l. Navíc musela být vodná část vzorku filtrována i po centrifugaci. Na druhou stranu jsme získali zajímavý vzorek tuhých částic, který byl lyofilizován, extrahován na Soxhletově extraktoru a později testován YAS in vitro testem. SPE přes C18 kolony o objemu 3ml probíhala velmi pomalu (0,5 l vzorku/1 kolona cca 6 h). Na jeden vzorek vody o objemu 2 l byly navíc potřeba minimálně 4 kolony. Zakoupení větších kolon by nebylo finančně náročnější než použití 4 menších. Proto byly zakoupeny SDB kolony většího objemu (12 ml a 20 ml). Už první testy cytotoxicity ukázaly, že počáteční objem vzorku byl zbytečně velký, protože bylo nutné zpracované vzorky při testu opět mnohonásobně ředit, než bylo docíleno takové koncentrace, která by nepůsobila významnou cytotoxicitu. Proto byl objem odebraného vzorku vody snížen na 1 l a konečné zakoncentrování vzorků surové vody stanoveno na 1 ml, u vzorků vody z odtoku na 0,5 ml. V závěrečných měsících testování, kdy jsme měli dostatek dat, abychom si byli jistí, že pokryjeme veškeré měřitelné rozmezí koncentrací, jsme objem odebrané surové vody snížili na 111 ml přičemž konečný objem vzorku zůstal 1 ml

36 (netradiční objem 111 ml vody byl zvolen kvůli snadnému přepočítávání koncentrací z původního zakoncentrování vzorků) Výsledky in vitro testů Vzorky, které jsou kromě data odběru označeny názvem C18, byly extrahovány přes C18 kolony dle původně navrženého postupu zpracování vzorků odpadní vody. Ostatní vzorky byly extrahovány pomocí SDB kolon a byly zpracovány dle optimalizovaného postupu Cytotoxicita surové a odtokové odpadní vody Ve vzorcích odpadní vody byla pomocí obou in vitro testů pozorována velmi významná cytotoxicita, zejména ve vzorcích na přítoku do ČOV. Cytotoxicita se ukázala jako určující parametr pro možnost/nemožnost stanovení křivek dávka-odpověď v testech specifických účinků. V testech cytotoxicity měřených YAS i MVLN testem byly stanoveny křivky dávka-odpověď a byla vypočítána IC25. U vzorků surové odpadní vody způsobovaly 25% cytotoxicitu kvasinkových buněk v YAS testu koncentrace odpovídající 5 až 62 µl surové odpadní vody na 100 µl média (Tab. 3, Graf 3). U buněk v MVLN testu způsobovaly 25% cytotoxicitu koncentrace odpovídající 4 až 119 µl surové odpadní vody na 100 µl média (Tab. 3). Ekvivalent 100 µl vody na 100 µl média odpovídá hladinám látek v reálné vodě, takže 25% cytotoxicitu u některých vzorků způsobovala už 25x ředěná surová voda. U vzorků vody z odtoku z ČOV se 25% cytotoxicita (IC25) měřená YAS testem pohybovala v rozmezí od ekvivalentu 64 µl odtokové vody na 100 µl média až po velmi vysoké koncentrace okolo ekvivalentu 1000 µl vody na 100 µl média, při kterých stále nebyla 25% cytotoxicita měřitelná (Tab. 4, Graf 3). V MVLN testu se 25% cytotoxicita nevyskytovala v žádné z měřených koncentrací vzorků odtokové vody a to ani při takových koncentracích, které by odpovídaly ekvivalentu 1000 µl odpadní vody na 100 µl média (Tab. 4). V reálné vodě tudíž žádná měřitelná cytotoxicita na odtoku nebyla. Jediné vzorky vody z odtoku, u kterých byla v MVLN testu zaznamenána mírná cytotoxicita jsou z měsíce května 2007, kdy se ČOV Modřice, Brno potýkala s vymřením některých mikroorganismů v aktivační nádrži (viz diskuse) a z prosince, kdy mohla být zvýšena zátěž ČOV v důsledku předvánoční zvýšené aktivity průmyslových podniků (Tab. 4). Při optimalizaci metody zpracování odpadní vody pro testování relativního ED potenciálu v in vitro testech byly C18 kolony nahrazeny SDB kolonami. Jak již bylo řečeno, bylo odebráno dvakrát větší množství vzorku surové vody z a vzorek byl rozdělen na dvě části. Oba díly byly zpracovány stejně pouze s tím rozdílem, že u jednoho probíhala SPE přes C18 kolonu, u druhého přes SDB kolonu. Extrakt z SDB kolon byl výrazně cytotoxičtější (Tab. 3)

37 Tab. 3: Cytotoxicita vzorků surové odpadní vody z ČOV Modřice, Brno, pro YAS a pro MVLN in vitro test (ekvivalent 100 µl vody na 100 µl média odpovídá hladinám látek v reálné vodě). Datum odběru Počasí den před odběrem YAS [µl H 2 O/100µl media] MVLN [µl H 2 O/100µl media] Vzorek LOEC IC25 LOEC IC Zataženo Surová (C18) Zataženo Surová (C18) Polojasno Surová (C18) Polojasno Surová Polojasno Surová Polojasno Surová Jasno Surová Polojasno Surová Jasno Surová Oblačno Surová Oblačno Surová Oblačno Surová Slabý déšť Surová Oblačno Surová 8 28 NOEC Oblačno Surová 8 22 NOEC 12 >12* NOEC - Cytotoxický účinek odlišitelný od rozpouštědlové kontroly (hladina významnosti 0,05) nebyl zaznamenán ani v nejvyšších exponovaných koncentracích, proto jsou namísto LOEC uvedeny nejvyšší koncentrace vzorků, při kterých se žádný statisticky významný účinek nevyskytoval. * Nebyla naměřena IC25, nejvyšší měřená koncentrace 12 µl vody/100µl média odpovídala IC Viabilita % MeOH Surová Odtok MeOH Surová Odtok Surová Odtok MeOH Luc Ekvivalent vody na jamku [µl] Graf 3: Ukázka rozdílů v YAS testem naměřené cytotoxicitě surové a odtokové odpadní vody z ČOV Modřice, Brno (ekvivalent vody 100 µl na jamku odpovídá koncentraci látek v reálné vodě). Luc označuje kvasinkové buňky v čistém médiu, MeOH označuje rozpuštědlovou kontrolu. Chybové úsečky odpovídají směrodatné odchylce měření

38 Tab. 4: Cytotoxicita vzorků vody na odtoku z ČOV Modřice, Brno, pro YAS a pro MVLN in vitro testy (ekvivalent 100 µl vody na 100 µl média odpovídá hladinám látek v reálné vodě). Datum Počasí den YAS [µl H 2 O/100µl media] MVLN [µl H 2 O/100µl media] odběru před odběrem Vzorek LOEC IC25 LOEC IC Zataženo Odtok (C18) Polojasno Odtok (C18) NOEC 1000 > Polojasno Odtok 111 > 2000 NOEC 333 > Jasno Odtok 4 93 NOEC 1000 > Polojasno Odtok NOEC 1000 > Jasno Odtok NOEC 1000 > Oblačno Odtok NOEC 1000 > Oblačno Odtok Oblačno Odtok NOEC 333 > Slabý déšť Odtok NOEC 333 > Oblačno Odtok NOEC 1000 > Oblačno Odtok NOEC 333 > 333 NOEC - Cytotoxický účinek odlišitelný od rozpouštědlové kontroly (hladina významnosti 0,05) nebyl zaznamenán ani v nejvyšších exponovaných koncentracích, proto jsou namísto LOEC uvedeny nejvyšší koncentrace vzorků, při kterých se žádný statisticky významný účinek nevyskytoval Xenoandrogenita surové a odtokové odpadní vody Xenoandrogenita odpadních vod byla měřena YAS in vitro testem. Vyhodnocení xenoandrogenity vzorků bylo provedeno porovnáním maximální indukce luminiscence vzorků s luminiscencí vyvolanou testosteronem. Xenoandrogenita vzorků ani v jednom případě nepřesáhla 20 % indukce luminiscence v porovnání s maximem T (1µM) a proto nebylo možné provést výpočet relativního xenoandrogenního potenciálu porovnáním EC50 nebo EC25 vzorků a T. Přibližná hodnota AEQ vzorků byla pomocí logaritmické regrese v programu MS Excel vypočítána z příslušné části křivky dávka-odpověď pro T jako bodový odhad (výpočet viz kap ). Xenoandrogenita byla zaznamenána pouze u některých vzorků surové vody v rozmezí 17 až 205 ng AEQ/l s mediánem 32 ng AEQ/l (Tab. 5). U žádného vzorku vody z odtoku nebyla neměřena významná indukce

39 Tab. 5: Naměřená xenoandrogenita surové vody a vody na odtoku z ČOV Modřice, Brno. Počasí den před XENOANDROGENITA [ng AEQ/l] Datum odběrem Surová Odtok % odstranění AEQ (C18) Zataženo > (C18) Zataženo <NSM (4) > (C18) Polojasno <NSM (2) Polojasno 22 <NSM (2) > Polojasno <NSM (70) <NSM (3) > Jasno <NSM (70) <NSM (3) > Polojasno <NSM (23) <NSM (1) > Jasno 23 <NSM (1) > Oblačno 36 <NSM (1) > Oblačno 23 <NSM (1) > Oblačno 24 <NSM (1) > Slabý déšť 28 <NSM (1) > Oblačno 18 <NSM (1) > Oblačno 17 <NSM (1) >99 NSM - Nejnižší stanovitelné množství xenoandrogenních látek, které bylo možné v daném vzorku YAS testem detekovat. Pro kontrolu, zda je možné správně stanovit efektivitu odbourávání xenoandrogenních látek na základě porovnání přítomnosti těchto látek ve vzorcích surové vody a vody z odtoku odebraných tentýž den, ačkoliv doba zdržení vody v ČOV Modřice, Brno je 24 hodin, byl pomocí YAS in vitro testu navíc hodnocen vzorek surové odpadní vody odebraný o 24 hodin dříve než vzorek vody z odtoku (Tab. 5, vzorek surové odpadní vody z ). Rozdíl efektivity odbourání xenoandrogenních látek mezi jednotlivými po sobě následujícími dny se lišil o 1 %, což je vzhledem k variabilitě odpovědí živých buněk používaných v in vitro testech zanedbatelný rozdíl. Při srovnání xenoandrogenity extraktů z C18 a SDB kolon u vzorku z jsou výsledky srovnatelné v případě, kdy byla specifická odpověď měřena u stejných koncentrací vzorků. Bodový odhad xenoandrogenity xetraktu z SDB kolon byl 23 ng AEQ/l, u C18 extraktu 18 ng AEQ/l, což je zanedbatelný rozdíl. Protože extrakt z C18 kolon byl podstatně méně cytotoxický, bylo možné měřit jeho xenoandrogenitu také ve vyšších koncentracích. Díky tomu byla u extraktu z C18 kolon změřena také vyšší xenoandrogenita než u extraktu z SDB kolony (Tab. 5) Antiandrogenita surové a odtokové odpadní vody Antiandrogenita odpadní vody byla měřena in vitro YAS testem. Ke vzorkům byl přidán 10nM T (výsledná koncentrace v jamce) a bylo sledováno snížení luminiscence oproti luminiscenci buněk exponovaných pouze 10 nm T. Vzhledem k vysoké cytotoxicitě vzorků se YAS test neukázal být dostatečně citlivý pro měření antiandrogenity vzorků odpadních vod. Díky vysoké citlivosti kvasinkových buněk na přítomnost cytotoxických látek nebylo možné antiandrogenní účinky surové vody měřit ani v koncentracích, které představují reálnou

40 odpadní vodu (Tab. 3). U vzorků vody z odtoku nebyla YAS testem antiandrogenní aktivita naměřena. Jedinou výjimkou byl vzorek vody z odtoku ze (Tab. 7). Vzhledem k vysoké citlivosti kvasinkových buněk na cytotoxické látky nelze rozlišit, jestli je 5 až 13% pokles luminiscence naměřený u surové odpadní vody a 11% naměřený u jediného vzorku vody z odtoku způsoben odchylkami v cytotoxicitě jednotlivých kvasinkových kultur, nebo jedná-li se o antiandrogenitu. S jistotou se dá pouze říci, jaká byla nejvyšší koncentrace vzorků, která antiandrogenitu nezpůsobila (hodnoty NOEC Tab. 6, 7). Protože díky vysoké cytotoxicitě vzorků nebylo možné naměřit antiandrogenní účinky, bylo od jejich dalšího měření upuštěno. Tab. 6: Antiandrogenita surové odpadní vody měřená YAS in vitro testem vyjádřená jako % snížení luminiscence oproti čistému roztoku 10nM T (100 µl ekvivalentu vody na 100 µl média odpovídá hladinám látek v reálné vodě). Datum odběru Počasí den před odběrem Vzorek Snížení luminiscence * ANTIANDROGENITA Koncentrace při níž bylo naměřeno snížení luminiscence [µl vody/100µl média] NOEC** [µl vody/100 µl média] Zataženo Surová (C18) 0% Zataženo Surová (C18) 0% Polojasno Surová (C18) 8 % % Polojasno Surová 5% 19 12% Polojasno Surová 3 % Jasno Surová 8 % Polojasno Surová 0% - 12 * Ke vzorkům byl přidán 10nM T a bylo sledováno snížení indukce luminiscence oproti indukci luminiscence buněk exponovaných pouze 10 nm T. ** U vyšších koncentrací nebylo možné odlišit, bylo-li snížení luminiscence způsobeno cytotoxicitou nebo přítomností antiandrogenních látek

41 Tab. 7: Antiandrogenita vody na odtoku z ČOV Modřice, Brno měřená YAS in vitro testem vyjádřená jako % snížení luminiscence oproti odpovědi pro roztok 10nM T (100 µl ekvivalentu vody na 100 µl média odpovídá hladinám látek v reálné vodě). Datum odběru Počasí den před odběrem Vzorek Snížení luminiscence * ANTIANDROGENITA Koncentrace při níž bylo naměřeno snížení luminiscence [µl vody/100µl média] NOEC** [µl vody/100 µl média] Zataženo Odtok (C18) 0% Polojasno Odtok (C18) 0% Polojasno Odtok 11% 11% Jasno Odtok 0% Polojasno Odtok 0% - 12 * Ke vzorkům byl přidán 10nM T a byl sledován úbytek indukce luminiscence, oproti indukci luminiscence buněk exponovaných pouze 10 nm T. ** U vyšších koncentrací nebylo možné odlišit, bylo-li snížení luminiscence způsobeno cytotoxicitou nebo přítomností antiandrogenních látek Xenoestrogenita surové a odtokové odpadní vody Na toxicitu surové vody reagovaly MVLN buňky téměř stejně jako kvasinky, ale voda z odtoku pro ně, na rozdíl od kvasinkových buněk, nebyla toxická ani v koncentracích, které by odpovídaly desetinásobnému zakoncentrování vody (Tab. 4). Citlivost MVLN buněk vůči xenoestrogenním látkám navíc byla velmi vysoká. Díky vysoké citlivosti MVLN buněk vůči estrogenním látkám a významné přítomnosti těchto látek ve vzorcích bylo možné měřit křivky dávka-odpověď jak ve vzorcích surové odpadní vody, tak ve vzorcích vody z odtoku. Naměřený relativní xenoestrogenní potenciál surové vody se pohyboval od 5 do 147 ng EEQ/l s mediánem 30 ng EEQ/l (Tab. 8). Relativní xenoestrogenní potenciál vody z odtoku byl změřen od 0,01 po 4 ng EEQ/l (Tab. 8). Efektivita odbourání xenoestrogenních látek v rozmezí 81 až více než 99 % je znázorněna také grafem 6 na straně

42 Tab. 8: Xenoestrogenita surové a odtokové vody z ČOV Modřice, Brno. Počasí den XENOESTROGENITA [ng EEQ/l] Datum před odběrem Surová Odtok % odstranění EEQ (C18) Zataženo (C18) Zataženo 36 0, (C18) Polojasno 70 <2 > Polojasno Polojasno Polojasno Jasno 60 0, Polojasno 86 <4 > Jasno Oblačno 21 0, Oblačno Oblačno 16 <0,1 > Slabý déšť 5 0, Oblačno Oblačno 11 0,1 99 Při srovnání xenoandrogenity extraktů z C18 a SDB kolon z byla u SDB extraktu naměřena xenoestrogenita (Tab. 8). Pro kontrolu, zda je možné správně stanovit efektivitu odbourávání xenoestrogenních látek vzorků surové vody a vody z odtoku odebraných tentýž den, ačkoliv doba zdržení vody v ČOV Modřice, Brno, je 24 h, byly pomocí MVLN testu měřeny navíc dva vzorky surové vody odebrané o 24 h dříve než vzorky vody z odtoku (Tab. 8, vzorek surové odpadní vody z a ). Rozdíly efektivity odbourání sledovaných látek mezi jednotlivými po sobě následujícími dny se lišily jen velmi málo. U vzorků z a o 0,16 % a u vzorků z a o 1,18 %, což je vzhledem k variabilitě odpovědi živých buněk používaných v in vitro testech zanedbatelný rozdíl Vzorky filtrů použitých pro surovou a odtokovou vodu a dvou vzorků tuhých částic ze surové odpadní vody Navržené zpracování filtrů (kap Optimalizované zpracování vzorků odpadní vody z ČOV Modřice, Brno pro testování v in vitro testech), bylo velmi jednoduché a mělo sloužit pouze pro ujištění, že na filtrech nedochází k významným ztrátám výtěžků ED potenciálu. Látky ze surové vody zachycené na filtrech často tvořily povlaky slizovitého charakteru a bylo obtížné je dostatečně vysušit. Zpracované extrakty z filtrů obsahovaly poměrně velký podíl tuhých částic. V in vitro testech byly testovány vzorky extraktů odebrané nad usazenými pevnými částicemi. U vzorků z filtrů surové odpadní vody z letních měsíců byla změřena mírně vyšší cytotoxicita než u ostatních vzorků z filtrů surové nebo odtokové odpadní vody (Tab. 9). Tato změřená cytotoxicita nebyla ve srovnání se vzorky surové odpadní vody příliš významná (srovnání Tab. 3 a Tab. 9). Xenoandrogenita nebyla u žádného z testovaných vzorku z filtrů nad limitem detekce naměřena (Tab. 10). Slabá xenoestrogenita byla zaznamenána u 4 z 10 měřených vzorků, a to z měsíce června, července a září Naměřená indukce byla významná pouze

43 u nejvyšších koncentrací vzorků, tudíž nebylo možné stanovit hodnoty EC50 nebo EC25. Z výsledků testů je zřejmé, že malý podíl (okolo 5 %) xenoestrogenních látek může být na GF filtrech zachycen (Tab. 11). Dva vzorky pevné části surové odpadní vody byly získány centrifugací surové odpadní vody, a extrakcí na Soxhletově extraktoru. Cytotoxicita těchto vzorků byla zhruba poloviční než cytotoxicita dané surové vody (Tab. 3, Tab. 9). Nejnižší stanovitelné množství (NSM) xenoandrogenních látek bylo (kvůli poměrně zančné cytotoxicitě vzorků) 28 ng AEQ/l. Xenoandrogenita nebyla u těchto vzorků nad NSM stanovena. Xenoestrogenita těchto vzorků bude změřena v rámci navazujících experimentů. Tab. 9: Cytotoxicita extraktů z filtrů použitých pro filtraci surové a odpadní vody na ČOV Modřice, Brno a dvou vzorků pevné části surové odpadní vody. Měřeno pomocí YAS a MVLN in vitro testů (100 µl vody na 100 µl média odpovídá hladinám látek v reálné vodě). Datum YAS [µl H 2 O/100µl media] MVLN [µl H 2 O/100µl media] odběru Vzorek LOEC IC25 LOEC IC Pevná část surové Pevná část surové Filtry z odtoku 2000 > Filtry ze surové Filtry z odtoku > Filtry ze surové NOEC 1000 > Filtry ze surové > Filtry z odtoku >400 > Filtry ze surové Filtry z odtoku 2000 >2000 >1000 > Filtry ze surové 25 > Filtry z odtoku NOEC 2000 >2000 NOEC 333 > Filtry ze surové 25 >2000 NOEC Filtry z odtoku 2000 >2000 NOEC 1000 > Filtry z odtoku 222 >2000 NOEC 1000 >1000 NOEC - Cytotoxiciký účinek odlišitelný od rozpouštědlové kontroly (hladina významnosti 0,05) nebyl zaznamenán ani v nejvyšších exponovaných koncentracích, proto jsou namísto LOEC uvedeny nejvyšší koncentrace vzorků, při kterých se žádný statisticky významný účinek nevyskytoval. Tab. 10: Xenoandrogenita extraktů z GF filtrů použitých pro filtraci surové a odtokové odpadní vody na ČOV Modřice, Brno. Datum XENOANDROGENITA [ng AEQ/l] odběru Filtry ze surové vody Filtry z odtoku Filtry přidány k tuhé části surové vody <NSM (0,1) <NSM (0,6) <NSM (0,1) <NSM (21) <NSM (1,4) <NSM (5) <NSM (1,4) NSM - Nejnižší stanovitelné množství xenoandrogenních látek, které bylo možné v daném vzorku YAS testem detekovat

44 Tab. 11: Xenoestrogenita GF filtrů použitých pro filtraci surové a odtokové odpadní vody na ČOV Modřice, Brno. XENOESTROGENITA [ng EEQ/l] Datum odběru Filtry ze surové Filtry z odtoku , ,68 0, <NSM (8,16) <NSM (0,30) <NSM (0,91) 0, <NSM (2,72) <NSM (0,91) <NSM (0,91) NSM - Nejnižší stanovitelné množství xenoestrogenních látek, které bylo možné v daném vzorku YAS testem detekovat Porovnání dostupných in vitro testů (YAS a MVLN) Xenoandrogenita a antiandrogenita surové odpadní vody a vody z odtoku z ČOV byla měřena pomocí YAS in vitro testu, xenoestrogenita MVLN testem. Oba dva testy mají své výhody a nevýhody. Kvasinkový YAS test je mnohem rychlejší (trvání testu 5h), MVLN test trvá 48 hodin. YAS test je finančně méně náročný, je mnohem snazší na údržbu buněčné kultury a není tolik náročný na sterilitu prostředí. Jeho snad jedinou, ale podstatnou nevýhodou, je nižší citlivost k androgenním látkám (relativně vyšší limit detekce testu) než u MVLN testu k estrogenním. Citlivost vůči cytotoxickým látkám je přitom u obou testů srovnatelná. Měřitelná hodnota androgenních látek v YAS testu se pohybovala od 10 pm AEQ do 1 µm AEQ, kdyžto estrogenních látek v MVLN testu od 1,23 (v několika provedeních testu od 0,41) pm EEQ do 500 pm EEQ (Tab. 12, Graf 4, 5). EC50 T v YAS testu se u jednotlivých desek lišila v rozmezí hodnot 2131 pm až pm s mediánem 2615 pm, EC50 E2 v MVLN testu 6,89 pm až 31,88 pm s mediánem 10,77 pm (Tab. 12, Graf 4, 5). V in vitro testech je často LOEC T nebo E2 zároveň používán jako limit detekce (LOD) testu. Vzorky z životního prostředí bývají při zpracování obvykle zakoncentrovány, takže je možné detekovat množství látek mnohonásobně nižší než je LOEC (respektive LOD) testu. V případě surové odpadní vody byla ale cytotoxicita vzorků natolik vysoká, že bylo nutné surovou vodu mnohonásobně ředit. Díky vysoké citlivosti buněčných kultur vůči cytotoxicitě vzorků, bylo nejnižší stanovitelné množství (NSM) androgenních nebo estrogenních látek u vzorků surové vody mnohem vyšší než LOD testů (Tab. 12)

45 Tab. 12: Srovnání důležitých parametrů YAS a MVLN in vitro testů a nejnižší stanovitelné množství (NSM) (xeno)androgenních nebo (xeno)estrogenních látek u vzorků surové vody, které byly velmi cytotoxické. YAS v médiu YAS v testech surové odpadní vody MVLN v médiu MVLN v testech surové odpadní vody [ng T/l] [pm T] [ng T/l] [pm T] [ng E2/l] [pm E2] [ng E2/l] [pm E2] LOD/NSM 2,9 10 3, ,3 1,2 0,3-7,2 1,2-26,5 NOEC 0,3 1 0,1 0,4 LOEC 2,9 10 0,3 1,2 EC 50 m EC 25 m ,8 3 Lineární rozmezí 28, ,3-27,2 1,2-100 m medián z hodnot EC jednotlivých provedení testu (7 provedení YAS testu, 11 provedení MVLN testu) Pro ověření možnosti srovnání přítomnosti xenoandrogenních látek vztažených k odpovědi buněk vůči testosteronu a vůči dihydrotestosteronu bylo provedeno srovnání kalibračních řad těchto dvou standardů v YAS testu. Základní parametry křivek dávka-odpověď (LOD, EC50, lineární rozmezí) se u těchto standardů významně nelišily. 120 % maximální odpovědi T ,01 0,10 1, ,E T [nm] Graf 4: Ukázka kalibračních řad pro testosteron měřené YAS testem. Chybové úsečku znázorňují směrodatnou odchylku

46 120 % maximální odpovědi E Deska Deska Deska Deska Deska ,41 1,23 3,70 11,11 33, E2 [pm] Graf 5: Ukázka kalibračních řad pro 17β-estradiol měřené MVLN testem. Chybové úsečku znázorňují směrodatnou odchylku Optimalizovaný postup přípravy vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech Jako souhrnný výsledek na základě literární rešerše, optimalizačních experimentů a získaných zkušeností byl vypracován standardní postup pro přípravy vzorků odpadních vod pro testování v in vitro testech. Cílem bylo připravit návod, který by komukoliv umožnil osvojení přípravy vzorků odpadní vody pro testování xenoandrogenity, antiestrogenity, androgenity a antiandrogenity v in vitro testech. Optimalizovaný postup je navržen pro testování libovolných odpadních vod MVLN a YAS in vitro testy. Navržené objemy odebraných vzorků a rozmezí testovaných koncentrací by mělo být dostatečné pro testování všech typů odpadních vod. Popis přípravy vzorků obsahuje návod, jak postupovat při dlouhodobém odebírání vzorků z jednoho vodního zdroje. Jeho použití je ale možné i pro jednorázové odběry vzorků vody z různých zdrojů. Při testování vzorků odpadní vody za účelem hodnocení jejich relativního ED potenciálu pomocí in vitro testů doporučujeme postupovat takto: Chemikálie a spotřební materiál - GF filtry (např. 2,7 a 1µm póry), lze použít i jiné GF filtry s menší porositou - 100% methanol, případně jiné rozpouštědlo - SPE kolonky nebo disky: C18 se sorbentem octadecylsilica nebo SDB se sorbentem

47 stirendivinylbenzenem, komerčně dostupné také jako HLB, ENV+ nebo SDB-XC - Těsnící zátky na SPE kolony - Teflonové hadičky pro převedení vzorku při SPE (nejsou potřeba při použití disku) - Čisté 20ml skleněné uzavíratelné nádobky na eluci SPE kolon nebo disků, víčka, septa - Čisté 1,5ml skleněné vialky, víčka, septa - Střička s destilovanou vodou a další materiál běžného použití v laboratoři Přístroje - Filtrační aparatura, nejlépe skleněná (filtrace za použití podtlaku) - Aparatura pro SPE (manifold s regulací tlaku, kohouty pro regulaci průtoku kolonami/disky) - Elektrická vývěva/pumpa - Tlaková dusíková bomba se střičkami - Pro urychlení zkoncentrování vzorků rotační vakuová odparka (není nezbytně nutná) Postup práce A) Odběr vzorků odpadní vody Pro první odběr neznámých vzorků odebrat 500 ml surové vody a 1000 ml vody na odtoku. Odebrání reprezentativního vzorku vody je důležitým předpokladem pro jakoukoliv další analýzu. Vzhledem k proměnlivému složení látek v odpadních vodách jsou pro hodnocení xenoestrogenity a xenoandrogenity vhodné směsné vzorky, nikoliv jednorázově odebrané. Vzorkovací nádoby by měly být skleněné se skleněnými nebo teflonovými zátkami, aby nedocházelo k vyluhování látek z plastů sběrných nádob. Lahve je vhodné před použitím promýt methanolem nebo jiným organickým rozpouštědlem pokud hrozí, že jsou znečištěny organickými látkami. Vzorky odebírat nejlépe po dobu 24 hodin automatickým vzorkovačem nejméně každých 120 min po objemech úměrných k velikosti průtoku, případně každých 30 min po dobu 7 h, nebo dle možností a technického vybavení. Vzorky zpracovat do 48 hodin. Skladování vzorků do doby extrakce probíhá při 4 C bez jakékoliv konzervace. B) Zpracování vzorků Provést předfiltraci surové vody, filtraci surové i odtokové vody, SPE a zakoncentrování surové i odtokové vody na 0,5 ml. Předfiltrace a filtrace se provádějí za účelem odstranění tuhých částic, které by mohly ucpat SPE kolony nebo disky. Voda by před průchodem kolonami měla být přefiltrována přes GF filtry s póry 1 µm nebo menšími. SPE disky nejsou na ucpání

48 tolik náchylné, nicméně voda by měla být přefiltrována přes filtry s podobnou porositou i pro ně. Standardně jsou používány materiály ze skla, většinou GF filtry. Pokud je laboratoř vybavena dostatečně silnou vývěvou, nemusí být potřeba provádět předfiltraci surové vody a můžeme přejít rovnou k filtraci přes GF filtry s póry 1 µm nebo menšími. Pokud probíhá filtrace surové vody příliš pomalu, nebo je spotřebováno příliš mnoho filtrů, vzorek může být předfiltrován přes sklovitou vatu nebo přes GF filtry s většími póry. Pro předfiltraci surové vody se osvědčilo použití filtrů o porositě 2,7 µm. Vodu z odtoku je většinou možné filtrovat rovnou GF filtry s póry 1 µm nebo menšími. Filtry nechat uschnout a později vložit na SPE kolonu nebo disk těsně před elucí. Eluce filtrů spolu s kolonami/disky by měla eliminovat případné ztráty látek zadržených na filtrech (Obr. 3). Obr. 3: Eluce SPE kolony a filtru. Obr. 4: Extrakce 2 l vzorku přes několik C18 kolon o malém objemu. (Převzato z SPE se skládá z kondicionace kolony nebo disku, převedení vzorku a eluce zachycených látek. Nejdůležitější je výběr SPE kolony, případně disku. Lze použít buď C18 kolony nebo disky se sorbentem octadecylsilica nebo SDB kolony, známé také jako ENV+ nebo HLB kolony nebo SBD-XC disky se sorbentem styrenedivinylbenzenem (Obr. 1 na str. 14). Disky jsou dražší než kolony, ale jsou méně náchylné k ucpání a práce s nimi je rychlejší. Kolony mají tu výhodu, že jich lze zapojit více paralelně vedle sebe a nepřekážejí si. To má význam při zpracování velkého množství vzorků nebo tehdy, kdy jsou k dispozici pouze malé kolony, ale je třeba extrahovat velké množství vzorku (Obr. 4). Extrakci takového vzorku lze provést přes několik kolon. Ztráta výtěžku by mohla nastat převáděním eluátu z mnoha nádobek do jedné. Tomu se dá jednoduše vyhnout elucí kolon postupně do jediné nádoby