jako markeru oxidativního

Transkript

1 Monitoring koncentrace 8-isoprostanu jako markeru oxidativního stresu v kondenzátu vydechovaného vzduchu Lukáš Chytil Ústav organické technologie

2 Úvod Cíl: - nalezení vhodného analytické metody pro analýzu 8- isoprostanu v dechovém kondenzátu - nalezení korelace mezi stupněm postižení oxidativním stresem a hodnotou koncentrace 8-isoprostanu jako markeru Sledovaná skupina: - pacienti s onemocněním, na jehož rozvoji se podílí oxidativní stres (azbestóza, silikóza, mezoteliom pleury)

3 oxidativní stres xidativní stres Alzheimerova choroba produkce volné radikály volných radikálů Chronické zánětlivé plicní onemocnění Ateroskleróza oxidace biomolekul Cukrovka Nemoci z ozáření poškození buňkypočátek patologie Artritida

4 Produkty působenp sobení volných kyslíkových kových,h 2 reaktivní formy kyslíku radikálů oxidace nukleových kyselin oxidace aminokyselin možné narušen ení struktury a funkce genu H 2 2 oxidace membránových lipidů H H 8-isoprostan CH konjugované dieny alkany aldehydy

5 Biosyntéza 8-isoprostanu8 membránový lipid CH 2 C R C CH CH 2 P X 2 - CH 2 C R1 C CH CH 2 P X H 1. přestavba 2. redukce buněčnými peroxidázami H C CH 2 CH 2 C R1 fosfolipáza A 2 H CH CH 2 P X H H H 8-isoprostan

6 8-isoprostan v dechovém m kondenzátu 1. Vlastnosti markeru oxidativního stresu: Specificita pro sledovaný děj (peroxidace membránových lipidů) Citlivost i k velmi malému množství v. k. r. Proveditelnost analýzy Korelace mezi rozsahem poškození a koncentrací markeru Stabilita molekuly 2. Důvody použití kondenzátu vydechovaného vzduchu: Neinvazivnost odběru Selektivita monitoringu postižení dýchacích cest Proveditelnost u všech pacientů

7 dběr r vydechovaného vzduchu dběrové pracoviště: Klinika nemocí z povolání VFN a 1. LFUK Kondenzátor: ECSCREEN Jaeger Požadavky na odběr: klidné dýchání vyloučení dýchání nosem vyloučení kontaminace slinami Požadavky na skladování: sterilní plastová nádobka nutnost hlubokého zmrazení (-80 C)

8 Zastoupení diagnóz z ve sledované skupině Kontrolní skupina - bez plicního onemocnění Silikóza, azbestóza 60 Mezoteliom pleury

9 Analytický postup 1. Předpříprava vzorku Přidání izotopově značeného standardu (určení kvantity) Extrakce sledovaných molekul (eliminace vlivu biologické matrice) 2. HPLC/MS analýza 3. Kvantifikace a vyhodnocení značený standard + extrakce extrakt zakoncentrování koncentrát HPLC/MS vzorek

10 Extrakce molekul 8-isoprostanu8 z biologického vzorku Požadavky na extrakční metodu: 1. Rychlost 2. Vysoká selektivita (musí být extrahovány pouze sledované molekuly) 3. Technická nenáročnost SLID PHASE EXTRACTIN extrakce na pevné fázi IMUNEXTRAKCE extrakce molekul na základě imunochemických reakcí LYFILIZACE mrazové vakuové sušení +technická nenáročnost -časová náročnost -velmi nízká selektivita +technická nenáročnost +časová nenáročnost +vysoká selektivita -přístroj není běžným vybavením +časová nenáročnost -velmi nízká selektivita

11 Antisérum pro imunoextrakci 1. Do laboratorního zvířete je vpraven 8-isoprostan 2. Po krátké době se začne tvořit protilátka (antisérum) 8-isoprostanu 3. Sérum a antisérum se k sobě váží imunochemickou reakcí 4. Protilátka je oddělena z krve zvířete a nanesena na pevný sorbent a tím je připravena ke komerčnímu využití

12 Imunoextrakční postup 1. Přidání sorbentu s navázanou protilátkou do vzorku 2. 1 hodina na třepačce zkumavek 3. Centrifugace a oddělení sorbentu s imunochemicky navázanými molekulami 8-isoprostanu 4. Přilití metanolu k oddělenému sorbentu zrušení vazby 8- isoprostan-protilátka a přechod 8-isoprostanu do metanolu dechový kondenzát roztok k HPLC/MS

13 Hmotnostně spektrometrická Ionizace ESI - molekulový ion [M-H] - sprejovací kapilára Taylorův kužel Zdroj vysokého napětí metoda-ionizace

14 Hmotnostně spektrometrická Trojitý kvadrupol metoda-analýza analýza iontů 1. kvadrupol analyzuje ionty z iontového zdroje (hmota 352) 2. kvadrupol slouží jako kolizní cela-kolize molekul analytu s molekulami kolizního plynu a následný vznik produktového iontu 3. kvadrupol analyzuje produktové ionty z 2. kvadrupolu (hmota 192) SRM (tandemová hmotnostní spektrometrie) ESI chromatogram dané rozpadové reakce-nejlepší identifikace molekuly 8-isoprostan: [M-H] - =352; [Product Ion] - =192 [M-H]- I [M-H]- II [Product Ion]- III I II III

15 Kvantifikace 1. Sestrojení kalibrační přímky (lineární závislost koncentrace analytu na 500 ploše píku) 2. Výpočet koncentrace 8-isoprostanu ve vzorku přídavek standardu neznámé množství analytu Koncentrace [pg/ml] y = 0,001x + 2,0346 R 2 = 0, Plocha Imunoextrakce + HPLC/MS množství standardu po analýze množství analytu po analýze

16 Výsledky měřm ěření koncentrace [pg/ml] Koncentrace 8-isoprostanu v kondenzátu vydechovaného vzduchu kontrolní skupina azbestóza+silikóza mezoteliom pleury

17 Výsledky měřm ěření Závislost koncentrace 8-isoprostanu na délce expozice azbestu 150 koncentrace [pg/ml] délka expozice [roky]

18 Azbestové vlákno

19 Závěr 1. Byla nalezena metoda pro stanovení 8-isoprostanu jako markeru oxidativního stresu v konenzátu vydechovaného vzduchu. Přednosti využití nalezeného analytického postupu jsou: a. Relativně nízká cena b. Rychlost analýzy c. Spolehlivost analýzy 2. Byla nalezena korelace mezi stupněm postižení dýchacích cest a koncentrací 8-isoprostanu, což je předpokladem pro další klinické testování