Histology FISH Accessory Kit Kód K5799

Histology FISH Accessory Kit Kód K5799 7. vydání K použití s technikou fluorescence in situ hybridizace (FISH) na tkáňových řezech fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Souprava obsahuje činidla postačující na 20 testů. P04094CZ_03/K579911-2 p. 1/27

Obsah Použití... 3 Úvod... 3 Činidla... 3 Dodané materiály... 3 Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky... 4 Bezpečnostní opatření... 5 Uchovávání... 8 Příprava vzorků... 8 Řezy zalité v parafínu... 8 NÁVOD K POUŽITÍ... 9 A. Příprava činidla... 9 A.1 Roztok Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Promývací pufr Wash Buffer... 9 A.4 Etanolové řady... 9 A.5 Roztok Pepsin Diluent... 9 B. Postup barvení... 10 B.1 Poznámky k postupu... 10 B.2 Zpracování tkání před barvením... 10 B.3 Protokol barvení... 11 B.3.a. Protokol barvení pro sondy FISH ředěné v hybridizační pufru na bázi etylenkarbonátu... 11 B.3.b. Protokol barvení pro sondy FISH ředěné v hybridizační pufru na bázi formamidu... 14 Kontrola kvality... 18 Interpretace výsledků... 18 Odstraňování závad... 19 Příloha 1... 24 Příloha 2... 25 Reference... 26 Vysvětlení symbolů... 27 P04094CZ_03/K579911-2 p. 2/27

ČEŠTINA Použití K diagnostice in vitro. Souprava Histology FISH Accessory Kit je určena k použití s technikou fluorescence in situ hybridizace (FISH) na vzorcích tkáňových řezů fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Činidla dodaná v této Histology FISH Accessory Kit mohou být rovněž použita společně se směsí HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (kód K5731, Lahvička 3). Jestliže se činidla v soupravě Dako Histology FISH Accessory, kód K5799 používají společně s činidly z výrobku kód K5731, musí se dodržovat postup uvedený v příbalové informaci k výrobku pod kódem K5731. Úvod Histology FISH Accessory Kit obsahuje všechna klíčová činidla, s výjimkou sondy, která jsou potřeba k provedení postupu FISH na vzorcích tkáňových řezů fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Po odstranění parafínu a po rehydrataci, jsou vzorky zahřívány v roztoku pro předběžné zpracování a potom proteolyticky natráveny za použití pepsinu. Po krocích obsahujících zahřátí a proteolytické předběžné zpracování se přidají FISH sondy dodané uživatelem a vzorky jsou před denaturací a hybridizací zapečetěny utěsňujícím prostředkem pro krycí sklíčka. Po hybridizaci se provádí stringentní promývání, které zajišťuje odstranění nevazebnosti a nespecifické vazby sond FISH před dehydrací etanolem. Nakonec se vzorky montují montážním médiem obsahujícím modré fluorescenční kontrastní barvivo. Výsledky se pak interpretují pomocí fluorescenčního mikroskopu vybaveného příslušnými filtry (viz Příloha 1). Činidla Dodané materiály Materiály uvedené níže postačí na 20 testů (jeden test je definován jako cílová oblast o velikosti 22 mm x 22 mm). Souprava obsahuje dostatek materiálů na 10 samostatných cyklů barvení FISH (čtyři oddělené cykly, pokud se používá pepsinová metoda ponořování). Souprava Histology FISH Accessory Kit je balena v suchém ledu. Suchý led musí být přítomen až do převzetí, aby bylo zajištěno, že komponenty soupravy nebudou vystaveny vysokým teplotám během přepravy. Je třeba poznamenat, že některé komponenty soupravy mohou zůstat nezmražené, aniž by došlo k snížení účinnosti soupravy Histology FISH Accessory Kit. Lahvička 1 Lahvička 2A Lahvička 2B Lahvička 4 Roztok Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný Pufr MES (2-[N-morfolino]etansulfonická kyselina). Pepsin 4 x 6,0 ml, k okamžitému použití Roztok pepsinu, ph 2,0; obsahuje stabilizátor a antimikrobiální prostředek. Roztok Pepsin Diluent (10x) 24 ml, 10x koncentrovaný Ředicí pufr, ph 2,0; obsahuje antimikrobiální látku. Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný SSC (saline-sodium citrate) pufr s detergentem Tween-20. P04094CZ_03/K579911-2 p. 3/27

Lahvička 5 Lahvička 6 Položka 7 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Fluorescenční montážní médium k okamžitému použití s 500 μg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Promývací pufr Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x koncentrovaný pufr TTris/HCl. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka 1 zkumavka Roztok k okamžitému použití pro odstranitelné lepidlo na krycí skla. POZNÁMKA: Všechna činidla je možné nahradit odpovídajícími činidly ze soupravy Dako HER2 IQFISH pharmdx (kód K5731). Jestliže se činidla v soupravě Dako Histology FISH Accessory, kód K5799 používají společně s činidly z výrobku kód K5731, musí se dodržovat postup uvedený v příbalové informaci k výrobku pod kódem K5731. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Laboratorní činidla Destilovaná nebo deionizovaná voda Etanol, 96% Xylen nebo substituty xylenu Laboratorní vybavení Absorpční ubrousky Nastavitelné pipety Kalibrovaný imerzní teploměr (rozsah 37 100 C) Krycí sklíčka (18 mm x 18 mm nebo 22 mm x 22 mm a 24 mm x 50 mm nebo 24 mm x 60 mm) Kleště Digestoř Dako Hybridizer (kód S2450/S2451)* Topný blok nebo hybridizační trouba* Vlhkostní hybridizační komora* Mikrocentrifuga Sklíčka, Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem nebo sklíčka superfrost Plus Barvící nádoby nebo lázně Kovové nebo plastové kolébky Časový spínač (umožňující intervaly 0 60 minut) Vodní lázeň s víkem (schopná udržovat teplotu 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C a od 95 C do 99 C Mikrovlnná trouba se schopností snímání, v případě, že je předběžné zpracování prováděno pomocí mikrovlnné trouby** (viz Krok 1 v části B.3.a nebo B.3.b. Protokol barvení metoda B). Kontrolní nádoba mikrovlnné trouby, víko musí mít otvory o průměru asi jeden cm. * Lze použít topný blok pro trávení (37 (±2) C), topný blok nebo hybridizační troubu k denaturaci (66 (±2) C (B.3.a.) nebo 82 (±2) C) (B.3.b.) a vlhkostní komoru pro hybridizaci (45 (±2) C), společnost Dako však doporučuje hybridizér Dako Hybridizer, kód S2450/S2451. ** Namísto mikrovlnné trouby můžete použít vodní lázeň s víkem (schopná udržovat teplotu 95 99 C) nebo mikroprocesorem řízenou tlakovou komoru, například Dako Pascal, kód S2800. P04094CZ_03/K579911-2 p. 4/27

Mikroskopické vybavení a příslušenství Filtry pro fluorescenční mikroskop: DAPI filtr a vhodné filtry pro používaný fluorochrom, např. dvojitý filtr FITC/Texas Red nebo FITC a jednoduché filtry Texas Red pro Dako FISH sondy viz Příloha 1, kde naleznete další informace. Jako světelný zdroj pro sondy Dako FISH by se měl použít fluorescenční mikroskop se 100wattovou rtuťovou lampou. S těmito filtry se nedoporučuje používat jiné světelné zdroje. Složka na mikroskopická sklíčka (kartonová přihrádka pro 20 sklíček se sklápěcím víkem nebo podobně) Bezpečnostní opatření 1. K diagnostice in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Roztok Pre-Treatment Solution (20x), nevyžaduje označení nebezpečnosti. Bezpečnostní list (Safety Data Sheet (SDS)) pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. 4. Lahvička 2A, Pepsin, obsahuje 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, a 0.011-<0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one a 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Lahvička 2A je označen: Nebezpečí H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. Může vyvolat alergickou kožní reakci. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste osobu na čerstvý vzduch a ponechte ji v poloze usnadňující dýchání. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 5. Lahvička 2B, Roztok Pepsin Diluent (10x) obsahuje 50-<75% propan-2-ol, and 5-<10% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Lahvička 2B je označen: Nebezpečí H225 H319 H336 P280 P210 Vysoce hořlavá kapalina a páry. Způsobuje vážné podráždění očí. Může způsobit ospalost nebo závratě. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. P04094CZ_03/K579911-2 p. 5/27

P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 6. Lahvička 4, Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Lahvička 4 je označen: Používejte e všechna zař výbušného p PŘI VDECH ponechte ji v PŘI STYKU části oděvu vodou/osprc Uchovávejte Obsah a oba regionálními H319 H315 P280 Varování P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 7. Lahvička 6, Promývací pufr Wash Buffer (20x), obsahuje ), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% trometamol. Lahvička 6 je označen: H319 H315 P280 Varování P264 P305 + P351 + P338 Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Po manipulaci důkladně omyjte. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 8. Coverlip Sealant, Těsnící prostředek pro krycí sklíčka, obsahuje 100% benzinová frakce (ropná), hydrogenovaná lehká a má označení: Nebezpečí H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 Vysoce hořlavá kapalina a páry. Při požití a vniknutí do dýchacích cest může způsobit smrt. Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. Používejte elektrická, ventilační, osvětlovací zařízení a všechna zařízení pro manipulaci s materiálem vhodná do výbušného prostředí. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. P04094CZ_03/K579911-2 p. 6/27

P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou/osprchujte. Uchovávejte v chladu. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy. 9. Další informace najdete v příslušném Bezpečnostním listu (SDS). 10. Jiné než předepsané metody fixace tkáně a tloušťky vzorků mohou způsobit ztrátu morfologie tkáně nebo změnit intenzitu signálu. 11. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. 12. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit chybnou účinnost. 13. Pro metodu pepsinového ponoření se musí používat pouze čisté barvicí nádoby (krok 2, metoda C). P04094CZ_03/K579911-2 p. 7/27

Uchovávání Uchovávejte v temnu při teplotě 2 8 C. Činidla je možné uchovávat také zmražená. Pepsin (lahvička 2) může být v případě vystavení působení tepla nepříznivě ovlivněn. Tuto komponentu nenechávejte v pokojové teplotě. Fluorescence Mounting Medium (lahvička 5) může být v případě vystavení působení intenzivního světla negativně ovlivněno. Neskladujte tuto komponentu na světle. Nepoužívejte soupravu po datu exspirace vytištěném na krabičce. Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných než uvedených podmínek, musí uživatel tyto podmínky ověřit (1). Neexistují žádné známky toho, že by tyto produkty byly nestabilní. Proto je důležité, aby byly hodnoceny normální tkáně, které byly prokázány jako FISH dobré, jako kontrola průběhu testu. Pokud zpozorujete neočekávané zabarvení, které nelze vysvětlit změnami laboratorních postupů, a máte podezření, že se jedná o problém s Histology FISH Accessory Kit, obraťte se naše technické služby. Příprava vzorků Se vzorky pro biopsie, excize a resekce je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro FISH analýzy. Postupujte podle doporučené metody zpracování tkání pro imunocytochemické barvení popsané níže. Další informace naleznete v odkazu na literaturu (2). Použití tkáně vystavené dekalcifikaci v kyselině se pro FISH nedoporučuje (3-6). Jako dekalcifikátor se více osvědčil EDTA, který pro metody (F)ISH (3, 4, 7) lépe konzervuje DNA (6). POZNÁMKA: Účinnost testu Dako Histology FISH Accessory Kit u odvápněných tkání nebyla dosud ověřena. Řezy zalité v parafínu K použití jsou vhodné pouze tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu a zalité v parafínu. Vzorky by měly být například bločkovány na tloušťku 3 nebo 4 mm a fixovány po dobu 18-24 hodin v neutrálním pufrovaném formalínu. Tkáně se potom dehydrují ve vzestupné alkoholové řadě a v xylenu, potom jsou napuštěny rozpuštěným parafínem a skladovány při teplotě do 60 C. Řádně fixované a zalité tkáně vydrží před řezáním a montáží na podložní sklo neurčitou dobu, pokud se skladují na chladném místě (15 25 C) (2, 8). Jiná fixativa nejsou vhodná. Příliš dlouhé doby fixace mohou zapříčinit vyžadování delší inkubační doby během trávení pepsinem. Vzorky tkání je třeba nařezat na řezy o tloušťce 2 6 µm, uložit na podložní skla a nechat uschnout na vzduchu. Pro sondy Dako Split Signal FISH je optimální tloušťka tkáňových řezů 2 3 µm. Řezy o tloušťce 4 6 µm je možné používat i pro ostatní FISH aplikace. Parafín je nutno rozpouštět při 60 C po dobu 30 60 minut. Řezy je třeba nechat chladnout při pokojové teplotě (20 25 C) a skladovat při 2 8 C, nejsou-li okamžitě použity. Tkáňové řezy je doporučeno montovat na silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem nebo sklíčka Superfrost Plus. Obecně platí, že je třeba analyzovat vzorky během 6 měsíců od nařezání, pokud jsou uchovávány při teplotě 2-8 C. Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných než uvedených podmínek, musí uživatel tyto podmínky ověřit. P04094CZ_03/K579911-2 p. 8/27

NÁVOD K POUŽITÍ A. Příprava činidla Je vhodné připravit před barvením následující činidla: A.1 Roztok Pre-Treatment Solution V lahvičce 1 se mohou objevit krystaly, ale ty se při pokojové teplotě rozpustí. Před přípravou činidel zkontrolujte, zda se nevyskytují krystaly. Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 1 (roztok Pre-Treatment Solution 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný roztok lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Rozředěný roztok zlikvidujte, pokud je zakalený. A.2 Stringent Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 4 (Stringent Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Naředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.3 Promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 6 (promývací pufr Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Naředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.4 Etanolové řady Z 96% etanolového roztoku připravte 3 nádoby obsahující 70%, 85% a 96% etanol. Zakryté nádoby skladujte při pokojové teplotě nebo při 2 8 C a použijte pro maximálně 200 podložních skel. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. A.5 Roztok Pepsin Diluent Roztok Pepsin Diluent je potřebný pouze v případě, že se používá pepsinová metoda ponořování (část B.3.a a B.3.b, krok 2, metoda C). Pepsinový roztok se připravuje následujícím způsobem. Pro nádobu s kapacitou šesti sklíček připravte 60 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 48 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Nasaďte víko na nádobu a vyrovnejte teplotu roztoku pepsinu na 37 (±2) C ve vodní lázni. Pro nádobu s kapacitou 24 sklíček připravte 240 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 192 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Nasaďte víko na nádobu a vyrovnejte teplotu roztoku pepsinu na 37 (±2) C ve vodní lázni. Zahřátý roztok Pepsin Diluent se musí použít během 5 hodin. P04094CZ_03/K579911-2 p. 9/27

B. Postup barvení B.1 Poznámky k postupu Uživatel by si měl pečlivě přečíst tyto pokyny a před použitím se dobře seznámit se všemi součástmi. (viz Bezpečnostní upozornění). Jsou-li komponenty soupravy skladovány zmražené, doporučuje se přepravovat činidla při teplotě až 2 8 C den před provedením analýz, aby byly vyváženy na správnou teplotu. Všechny činidla musí být vyváženy před použitím na správnou teplotu. Lahvička 1: Zředěný roztok k předběžné úpravě by měl být vyvážen na 95 99 C, je-li použita vodní lázeň (část B3a nebo B3b. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda A). Je-li pro předběžnou úpravu používána mikrovlnná trouba se schopností snímání (část B.3.a nebo B.3.b. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda B), zředěný roztok k předběžnému zpracování by měl být vyvážen na pokojovou teplotu 20 25 C. Lahvička 2A: Pepsin by měl být aplikován při 2 8 C (část B.3.a nebo B.3.b. Protokol barvení, krok 2: metoda A a B) a udržovat stále chladný. Lahvička 2B: Pepsin Diluent by měl být aplikován při 2 8 C (část B.3.a nebo B.3.b. Protokol barvení, krok 2: metoda C). Lahvička 4: Před použitím je třeba vyvážit jednu nádobu naředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer na pokojovou teplotu a další nádobu na teplotu 63 (±2) C (část B.3.a) nebo 65 (±2) C (část B.3.b). Lahvička 5: Fluorescenční montovací médium smí být aplikováno při jakékoli teplotě od 2-25 C. Lahvička 6: Naředěný promývací pufr Wash Buffer by měl být vyvážen na pokojovou teplotu (20 25 C). Položka 7: Těsnící prostředek pro krycí sklíčka může být přidán při pokojové teplotě (20-25 C). Všechny kroky musí být prováděny při uvedené teplotě. Postup před barvením obsahuje dehydrataci a potom sušení vzorků. Zkontrolujte, zda jsou vzorky dokonale suché, než začnete provádět další krok. Zamezte vysychání vzorků během dalších kroků procedury. Pokud je postup barvení přerušen, podložní skla mohou zůstat v promývacím pufru Wash Buffer po odstranění parafínu po dobu až 1 hodiny při pokojové teplotě (20 25 C). B.2 Zpracování tkání před barvením Odstraňovaní parafínu a rehydratace Před barvením musí být podložní skla s tkáněmi zbavena parafínu, aby se odstranilo médium, ve kterém je tkáň zalita, a aby mohla být rehydratována. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků parafínu způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Vložte podložní sklíčka do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 96 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 70 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2) na minimálně 2 minuty. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části B.3.a nebo B.3.b, krok 1, Předběžné zpracování. Pokaždé po zpracování 200 podložních skel musí být připraven čerstvý roztok xylenu a alkoholu. P04094CZ_03/K579911-2 p. 10/27

Mohou být použity substituty xylenu. POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky analýzy. Volitelné zrání vzorků: Před odstraněním parafínu a rehydratací inkubujte podložní skla při 60 C např. po dobu 1 hodiny v topném bloku, bloku v hybridizační troubě nebo v hybridizéru Dako. Sklíčka se také mohou ponořit do roztoku pepsinu a inkubovat při 37 C po dobu 1-2 dnů a potom po dobu 1 hodiny při 60 C. Pokračujte odstraněním parafínu a rehydratací. POZNÁMKA: Tento krok je volitelný. Tento krok může snížit intenzitu potencionální pozadí. B.3 Protokol barvení Postupujte podle jednoho ze dvou protokolů barvení, B.3.a nebo B.3.b. Nezaměňujte kroky obou procedur: Protokol barvení B.3.a popisuje půldenní postup, který má být dodržen při použití sond FISH ředěných v hybridizačním pufru na bázi etylenkarbonátu. Protokol barvení B.3.b popisuje dvoudenní postup, který má být dodržen při použití sond FISH ředěných v hybridizačním pufru na bázi formamidu. B.3.a. Protokol barvení pro sondy FISH ředěné v hybridizační pufru na bázi etylenkarbonátu Krok 1: Předběžné zpracování (mikrovlnná trouba, vodní lázeň, Pascalův hrnec) Předběžná úprava může být prováděna ve vodní lázni, viz metoda A) nebo jako alternativu je možno použít, mikrovlnnou troubu se schopností snímání, metoda B) nebo Pascalův tlakový hrnec, popisovaný jako metoda C). Metoda A: Předběžné zpracování při použití vodní lázně Naplňte barvicí nádoby, např. Coplinovy nádobky, zředěným roztokem pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl A.1). Vložte barvicí nádoby obsahující zředěný roztok Pre-Treatment Solution do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok Pre- Treatment Solution na 95 99 C. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Ponořte řezy, ze kterých byl odstraněn parafín při pokojové teplotě do předehřátého roztoku Pre- Treatment Solution v barvicích nádobách. Překontrolujte teplotu a inkubujte po dobu 10 (±1) minut při teplotě 95 99 C. Vyjměte celou nádobu s podložními skly z vodní lázně. Odstraňte víčko a nechte sklíčka po dobu 15 minut chladit v roztoku pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution při pokojové teplotě. Přemístěte sklíčka do nádobky se zředěným promývacím pufrem (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. POZNÁMKA: Roztok pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution je určen k aplikaci pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Metoda B: Předběžné zpracování prováděné v mikrovlnné troubě se schopností snímání (doporučeno) Naplňte plastovou nádobu naředěným roztokem Pre-Treatment Solution pokojové teploty (20-25 C). Ponořte řezy zbavené parafínu do roztoku Pre-Treatment Solution, zakryjte nádobu víkem s otvory a umístěte ji do mikrovlnné trouby. Zvolte funkci vaření se snímačem a program, který běží po dobu 10 minut poté, co bylo dosaženo teploty bodu varu*. P04094CZ_03/K579911-2 p. 11/27

Po 10 minutách inkubace vyjměte nádobu se sklíčky z trouby, sejměte víko a nechejte ochladit 15 minut při pokojové teplotě. Přeneste podložní skla do nádoby s naředěným promývacím pufrem na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. * Použití mikrovlnné trouby s funkcí snímání znamená, že trouba musí obsahovat snímač a program, který nejprve zahřeje roztok Pre-Treatment Solution k bodu varu a potom udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 C) a zároveň odečítá nastavený čas (10 (±1) minut). Některé modely mikrovlnných trub s funkcí snímání nemají možnost nastavení odečítání času. Pokud model zahrnuje pouze předem nastavené programy, je potřeba zvolit program, který udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 C) po dobu nejméně 10 (±1) minut a manuálně ukončit program po 10 (±1) minutách. POZNÁMKA: Roztok pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution je určen k aplikaci pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Metoda C: Předběžné zpracování za použití tlakové komory Pascal Nalijte 500 ml deionizované vody do Pascalova hrnce. Naplňte plastovou nádobu 250 ml naředěného roztoku Pre-Treatment Solution. Ponořte řezy zbavené parafínu do roztoku Pre- Treatment Solution a umístěte nádobu do Pascalova hrnce. Inkubujte při teplotě 121 C po dobu 1 minuty. Po ochlazení na 90 C uvolněte tlak. Informace o správné manipulaci s tlakovou komorou Pascal si pečlivě prostudujte v příručce k zařízení Pascal. Po uvolnění páry vyjměte nádobu. Odstraňte víčko a nechte sklíčka dalších 15 minut chladit v roztoku Pre-Treatment Solution při pokojové teplotě. Sklíčka přeneste do nádoby se zředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2). Řezy máčejte 3 minuty při pokojové teplotě. Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 2. POZNÁMKA: Roztok pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution je určen pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Nepoužívejte vzduchotěsně uzavřenou nádobu při provádění předběžné úpravy v mikrovlnné troubě, protože v nádobě dochází je zvyšování tlaku a při otevření může způsobit výbuch nebo poranění. Použití kovové kolébky v mikrovlnné troubě nepředstavuje problém, jestliže je kolébka ponořena v pufru po celou dobu mikrovlnného zpracovávání. Kov v mikrovlnné troubě nepoužívejte žádným jiným způsobem. Postupujte podle pokynů výrobce mikrovlnné trouby. Zamezte soustavnému varu roztoku Pre-Treatment Solution během 10minutové inkubace. Pravidelně kontrolujte teplotu cejchovaným teploměrem a ověřujte správné teplotní podmínky. Krok 2: Pepsin, připravený k okamžitému použití (ready-to-use, RTU) nebo roztok pepsinu Pepsinová inkubace může být prováděna přímou aplikací kapek pepsinu RTU na sklíčka při pokojové teplotě (20 25 C) (Metoda A) nebo při teplotě 37 C (Metoda B). Případně mohou být sklíčka ponořena do roztoku pepsinu a inkubována při teplotě 37 (±2) C (Metoda C). Metoda A a Metoda B: Oklepejte přebytečný pufr. Použijte materiál nezanechávající chloupky (jako např. absorpční ubrousek nebo gázový tampon), opatrně otřete okolí vzorku k odstranění zbývající tekutiny a k udržení činidel v předepsané oblasti. Pro zakrytí vzorku aplikujte 5 8 kapek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsinu (ampule 2A). Pepsin uchovávejte vždy při teplotě 2-8 C. Metoda A: Pepsin, RTU Inkubace při teplotě 20 25 C Inkubujte po dobu 5-15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Inkubační doba 5 15 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci a/nebo na tloušťce vzorku a měla by být určena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. P04094CZ_03/K579911-2 p. 12/27

Metoda B: Pepsin, RTU Inkubace při teplotě 37 C Vzorky s Pepsinem vložte na topný blok při teplotě 37 C např. hybridizér Dako a inkubujte 3-5 minut. Inkubační doba 3-5 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci a/nebo na tloušťce vzorku a měla by být určena uživatelem. Oklepejte přebytečný Pepsin a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydratujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96% etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Metoda C: Roztok pepsinu Ponoření sklíček do roztoku pepsinu o teplotě 37 C Souprava obsahuje dostatek činidel na čtyři oddělené cykly (60 ml roztoku pepsinu, malou nádobu na šest sklíček) nebo jeden cyklus (240 ml roztoku pepsinu, velká nádoba na 24 sklíček). Roztok Pepsin Diluent připravte podle návodu v části A.5. Nasaďte víko na nádobu a vyrovnejte teplotu roztoku pepsinu na 37 (±2) C ve vodní lázni. Zajistěte ustálení teploty. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Oklepejte přebytečný promývací pufr. Sklíčka ponořte do roztoku pepsinu o teplotě 37 (±2) C a inkubujte po dobu 20 30 minut. Inkubační doba 20-30 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci a/nebo na tloušťce vzorku a měla by být určena uživatelem. Oklepejte přebytečný pepsin a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydratujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96% etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Krok: 3 Sondy FISH ředěné v hybridizačním pufru na bázi etylenkarbonátu (poskytnuto uživatelem) POZNÁMKA: Směs sond FISH ředěná v hybridizačním pufru na bázi etylenkarbonátu musí být mezi použitími skladována při teplotě 18 C. Skladování při teplotě 18 C vede k separaci pufru na bázi na dvě fáze. Před použitím zkontrolujte, že po vyrovnání směsi sond na pokojovou teplotu (20 25 C) a následném míchání byla přítomna pouze jedna fáze. Směs sond FISH nechte rozmrznout při pokojové teplotě (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom lahvičku nechte protočit na 15 sekund při 2 500 rpm ve vířivém mixéru. Aplikujte příslušné množství směsi sond, např. 10 µl, do středu tkáňového řezu. Ihned překryjte směs sond krycím sklíčkem 22 mm x 22 mm a nechejte směs pod sklíčkem rovnoměrně rozprostřít. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud se vytvoří bublinky vzduchu, jemně je vyklepejte pomocí pinzety. Krycí sklíčko utěsněte těsnícím prostředkem Coverslip Sealant vytlačením těsnícího prostředku podél obvodu krycího sklíčka. Překryjte těsnícím prostředkem krycí sklíčko k podložnímu uhnětením těsnícího prostředku kolem krycího sklíčka. Zajistěte, aby těsnící prostředek Coverslip Sealant pokryl celou hranu krycího sklíčka. Připravte Dako Hybridizer* (kód S2450 nebo S2451) na hybridizační cyklus. Zkontrolujte, zda jsou kontrolní proužky Humidity Control Strips (kód S2452) saturované a optimální pro použití. Spusťte hybridizér a zvolte program, který bude: denaturovat při teplotě 66 C po dobu 10 minut a následně hybridizovat při teplotě 45 C po dobu 60 120 minut. P04094CZ_03/K579911-2 p. 13/27

Sklíčka umístěte do hybridizéru, zkontrolujte, zda je víko dobře uzavřené a spusťte program. Podrobnost najdete v Návodu k použití hybridizéru Dako. * K denaturaci a hybridizaci lze použít vybavení odpovídající výše popsaným podmínkám: Sklíčka položte na kovovou nebo kamennou plochu (topný blok nebo blok v hybridizační peci) předehřátou na teplotu 66 (±1) C. Denaturujte přesně 10 minut. Umístěte podložní sklíčka do předehřáté vlhkostní hybridizační komory. Zakryjte komoru víkem a inkubujte při teplotě 45 (±2) C po dobu 60 120 minut. Krok 4: Stringentní promytí Naplňte dvě barvicí nádoby, např.coplinovy nádobky, zředěným pufrem pro důkladné promytí Stringent Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, oddíl A.2). Minimální doporučovaný objem je 100 ml nebo 15 ml pro každé sklíčko. Umístěte jednu z barvicích nádob se zředěným pufrem pro důkladné promytí Stringent Wash Buffer při pokojové teplotě do digestoře a druhou do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný stringentní promývací pufr 63 (±2) C. Zkontrolujte, zda se teplota stabilizovala. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Cejchovaným teploměrem měřte teplotu v nádobce s vodní lázní, aby dosáhla správné výše. Pufr pro důkladné promytí Stringent Wash Buffer obsahuje detergent a při teplotě 63 C se může zkalit; toto neovlivní výsledek. Pomocí pinzety nebo rukavic vyndejte sklíčka z hybridizační komůrky a opatrně odstraňte těsnící prostředek Coverslip Sealant a krycí sklíčko a umístěte sklíčka jedno po druhém do předmývací nádobky o pokojové teplotě. Jakmile byla odstraněna všechna krycí sklíčka, přeneste podložní skla z předmývací nádoby o pokojové teplotě do nádoby o teplotě 63 (±2) C s vodní lázní. Ihned po přenesení podložních skel do zředěného pufru Stringent Wash Buffer o teplotě 63 (±2) C ve vodní lázni by měl být spuštěn časovač. Stringentní promývání provádějte přesně 10 minut. Vyndejte sklíčka ze zředěného pufru pro důkladné promytí Stringent Wash Buffer a po dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte naředěný promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Dehydratujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96% etanolu. Nechejte tkáňové řezy úplně vyschnout. Krok 5: Montáž Na cílovou oblast sklíčka aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média Fluorescence Mounting Medium obsahujícího DAPI (ampule 5) a přikryjte krycím sklíčkem. POZNÁMKA: Podložní skla lze číst po 15 minutách nebo během 7 dnů po montáži. Pokud jsou však sklíčka vystavena světlu nebo vysokým teplotám, může se objevit vyblednutí. Pro minimalizaci blednutí sklíček je uchovávejte ve tmě při teplotě 18 8 C. B.3.b. Protokol barvení pro sondy FISH ředěné v hybridizační pufru na bázi formamidu DEN 1 Krok 1: Předběžné zpracování (mikrovlnná trouba, vodní lázeň, Pascalův hrnec) Předběžná úprava může být prováděna ve vodní lázni, viz metoda A) nebo jako alternativu je možno použít mikrovlnnou troubu se schopností snímání, metoda B) nebo tlakovou komoru Pascal, popisovanou jako metoda C). Metoda A: Předběžné zpracování při použití vodní lázně Naplňte barvící nádobky zředěným roztokem Pre-Treatment Solution (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.1). Vložte barvicí nádoby obsahující zředěný roztok Pre-Treatment Solution do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok Pre-Treatment Solution na 95 99 C. Měřte teplotu uvnitř nádoby P04094CZ_03/K579911-2 p. 14/27

cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přikryjte nádoby víkem (bez otvorů), aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Po odstranění parafínu ponořte řezy do předehřátého roztoku Pre-Treatment Solution. Překontrolujte teplotu, zavřete víko vodní lázně a inkubujte po dobu 10 (±1) minut při 95 99 C. Vyjměte celou nádobu s podložními skly z vodní lázně. Odkryjte víko (nevyjímejte podložní skla). Nechte podložní skla zchladnout v roztoku Pre-Treatment Solution po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Přeneste podložní skla do nádoby s naředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2) na 3 minuty při pokojové teplotě. Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 2. Metoda B: Předběžné zpracování prováděné v mikrovlnné troubě se schopností snímání (doporučeno) Naplňte nádobu naředěným roztokem Pre-Treatment Solution pokojové teploty (20 25 C). Po odstranění parafínu ponořte řezy do roztoku a uzavřete víkem. Víko musí obsahovat otvory, aby mohl unikat tlak. Nádobu se sklíčky umístěte do mikrovlnné trouby a zahřejte. Než budete ohřívat, zkontrolujte, zda je vnější povrch nádoby a vnitřní prostor mikrovlnné trouby suchý. Inkubujte těsně pod bodem varu (ne méně než 95 C) po dobu 10 minut. Po skončení inkubace odkryjte víko (nevyjímejte podložní skla). Nechte podložní skla zchladnout v roztoku Pre-Treatment Solution po dobu 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Sklíčka musí být zakryta pufrem po celou dobu předběžného zpracovávání. Přeneste podložní skla do nádoby s naředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2) na 3 minuty při pokojové teplotě. Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 2. Metoda C: Předběžné zpracování za použití tlakové komory Pascal Nalijte 500 ml deionizované vody do Pascalova hrnce. Naplňte plastovou nádobu 250 ml naředěného roztoku Pre-Treatment Solution. Ponořte řezy zbavené parafínu do roztoku Pre- Treatment Solution a umístěte nádobu do Pascalova hrnce. Inkubujte při teplotě 121 C po dobu 1 minuty. Po ochlazení na 90 C uvolněte tlak. Informace o správné manipulaci s tlakovou komorou Pascal si pečlivě prostudujte v příručce k zařízení Pascal. Po uvolnění páry vyjměte nádobu. Odstraňte víčko a nechte sklíčka dalších 15 minut chladit v roztoku Pre-Treatment Solution při pokojové teplotě. Sklíčka přeneste do nádoby se zředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2). Řezy máčejte 3 minuty při pokojové teplotě. Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 2. POZNÁMKA: Roztok pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution je určen pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Nepoužívejte vzduchotěsně uzavřenou nádobu při provádění předběžné úpravy v mikrovlnné troubě, protože v nádobě dochází je zvyšování tlaku a při otevření může způsobit výbuch nebo poranění. Použití kovové kolébky v mikrovlnné troubě nepředstavuje problém, jestliže je kolébka ponořena v pufru po celou dobu mikrovlnného zpracovávání. Kov v mikrovlnné troubě nepoužívejte žádným jiným způsobem. Postupujte podle pokynů výrobce mikrovlnné trouby. Zamezte soustavnému varu roztoku Pre-Treatment Solution během 10minutové inkubace. Pravidelně kontrolujte teplotu cejchovaným teploměrem a ověřujte správné teplotní podmínky. Krok 2: Pepsin, připravený k okamžitému použití (ready-to-use, RTU) nebo roztok pepsinu Inkubace pepsinem se může provádět přímo použitím kapek pepsinu RTU na sklíčka při pokojové teplotě (20 25 C) (metoda A) nebo při 37 C (metoda B). Případně mohou být sklíčka ponořena do roztoku pepsinu a inkubována při teplotě 37 (±2) C (metoda C) P04094CZ_03/K579911-2 p. 15/27

Metoda A a metoda B: Oklepejte přebytečný pufr. Použijte materiál nezanechávající chloupky (jako např.absorpční ubrousek nebo gázový tampon), opatrně otřete okolí vzorku k odstranění zbývající tekutiny a k udržení činidel v požadované oblasti. Přidejte 5 8 kapek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A) a zkontrolujte, zda jsou vzorky zakryty. Pepsin uchovávejte vždy při teplotě 2 8 C. Metoda A: Pepsin, RTU Inkubace při teplotě 20 25 C Inkubujte po dobu 5-50 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Inkubační doba v délce 10 20 minut při pokojové teplotě bude pro většinu vzorků dostačující, avšak uživatel by měl stanovit optimální inkubační dobu. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 3, sonda FISH nebo viz Příloha 2 pro optimalizaci doby trávení (volitelné). Metoda B: Pepsin, RTU Inkubace při teplotě 37 C Vzorky s pepsinem vložte při 37 C do hybridizéru Dako nebo na předehřátý topný blok. Inkubační doba v trvání 2 6 minut při 37 C bude postačující pro většinu vzorků připravených podle popisu v části Příprava vzorků. Optimální inkubační doba závisí na typu tkáně, fixaci tkáně, tloušťce vzorku, zrání vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Tyto faktory mohou zvýšit potřebnou dobu natrávení na 7 15 min nebo i déle. Uživatel by měl nejprve stanovit optimální dobu trávení otestováním reprezentativní tkáně po dobu 1, 3, 6, 12 a 18 minut. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 3, sonda FISH nebo viz Příloha 2 pro optimalizaci doby trávení (volitelné). Metoda C: Roztok pepsinu Ponoření sklíček do roztoku pepsinu o teplotě 37 C Kit obsahuje činidla postačující na čtyři jednotlivé cykly (60 ml roztoku pepsinu, malá nádobka na šest sklíček) nebo na jeden cyklus (240 ml roztoku pepsinu, velká nádoba na 24 sklíček). Roztok Pepsin Diluent připravte podle návodu v části A.5. Nasaďte víko na nádobu a vyrovnejte teplotu roztoku pepsinu na 37 (±2) C ve vodní lázni. Zajistěte ustálení teploty. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Oklepejte přebytečný promývací pufr. Sklíčka ponořte do roztoku pepsinu o teplotě 37 (±2) C a inkubujte po dobu 20 30 minut. Inkubační doba 20-30 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci a/nebo na tloušťce vzorku a měla by být určena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte krokem 3, sonda FISH nebo viz Příloha 2 pro optimalizaci doby trávení (volitelné). POZNÁMKA: Doporučuje se postupovat podle části Příprava vzorků. Nedostatečně natrávená tkáň může vést k výsledku bez signálů nebo se zavádějícími signály, často s vysokou úrovní zeleného cytosolického pozadí. Krok 3: Sonda FISH (dodaná uživatelem) POZNÁMKA: Jestliže se činidla v soupravě Dako Histology FISH Accessory, kód K5799 používají společně s činidly z výrobku kód K5731, musí se dodržovat postup uvedený v příbalové informaci k výrobku pod kódem K5731. Následující krok by měl být prováděn v digestoři. Sondy značené fluorochromem mohou být v případě vystavení působení intenzivního světla negativně ovlivněny. Neprovádějte zbývající část procedury na silném světle, např. na přímém slunečním světle. Dehydratujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96% etanolu (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.4). P04094CZ_03/K579911-2 p. 16/27

Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Přidejte příslušné množství sondy značené fluorochromem, např. 10 µl sondy FISH Dako doprostřed vzorku tkáně. Sondu ihned přikryjte krycím sklíčkem o velikosti 18 mm x 18 mm (nebo 22 mm x 22 mm) a rozprostřete rovnoměrně pod krycí sklíčko. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud zpozorujete vzduchové bubliny, opatrně je odstraňte pryč. Utěsněte krycí sklíčko nanesením těsnícího prostředku pro krycí sklíčka kolem okraje krycího sklíčka. Překryjte těsnícím prostředkem krycí sklíčko k podložnímu uhnětením těsnícího prostředku kolem krycího sklíčka. Zkontrolujte, zda těsnící prostředek pro krycí sklíčka utěsňuje celý kraj krycího sklíčka. Pokud se používají sondy Dako FISH, umístěte sklíčka do hybridizéru Dako Hybridizer (kód S2450/S2451) a nastavte denaturaci na 82 C na dobu 5 minut a hybridizaci na 45 C přes noc (14 20 h). Pokračujte dnem 2, krok 4, stringentní promývání. Další pokyny naleznete v uživatelské příručce k hybridizéru. POZNÁMKA: Můžete také použít topný blok, hybridizační troubu a hybridizační komoru, viz níže. Sklíčka položte na kovovou nebo kamennou plochu (topný blok nebo blok v hybridizační peci) předehřátou na teplotu 82 (±2) C. Denaturujte 5 minut a zajistěte, aby teplota bloku neklesla pod 80 C. Umístěte podložní sklíčka do předehřáté vlhkostní hybridizační komory. Přikryjte komoru víkem a inkubujte přes noc (14 20 hodin) při 45 (±2) C za použití sond Dako FISH. DEN 2 Krok 4: Stringentní promytí Naplňte dvě barvící nádobky zředěným stringentním promývacím pufrem Stringent Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2). Pro 1 6 podložních skel v nádobě je požadován minimální objem 100 ml naředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer. Pro více než 6 sklíček použijte nejméně 15 ml pufru na každé sklíčko. Umístěte jednu z barvicích nádob se zředěným pufrem pro důkladné promytí Stringent Wash Buffer při pokojové teplotě do digestoře a druhou do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný stringentní promývací pufr 65 (±2) C. Zkontrolujte, zda se teplota stabilizovala. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Vyjměte podložní skla z hybridizační komory. Použijte kleště a opatrně odstraňte těsnící prostředek pro krycí sklíčko a krycí sklíčko a přeneste podložní sklo při pokojové teplotě do předmývací nádoby. Jakmile byla odstraněna všechna krycí sklíčka, přeneste podložní skla z předmývací nádoby o pokojové teplotě do nádoby o teplotě 65 (±2) C s vodní lázní. Uzavřete víko nádoby a víko vodní lázně. Proveďte stringentní promývání přesně po dobu 10 minut při 65 (±2) C. Vyjměte sklíčka ze zředěného stringentního promývacího pufru Stringent Wash Buffer a po dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C) řezy máčejte ve zředěném promývacím pufru Wash Buffer. Vyměňte naředěný promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Dehydratujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96% etanolu (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.4). Nechejte skla na vzduchu úplně uschnout. Krok 5: Montáž Přidejte 15 µl fluorescenčního montážního média (lahvička 5), obsahujícího modré kontrastní barvivo, do cílové oblasti podložního skla a přikryjte krycím sklem (např. 24 mm x 50 mm nebo 24 mm x 60 mm). Nechejte médium rozprostřít přes vzorek. POZNÁMKA: Podložní skla lze číst po 15 minutách nebo během 7 dnů po montáži. Pokud jsou podložní skla vystavena světlu nebo vysokým teplotám, nastane vyblednutí. Proto je nutno podložní skla skladovat v temnu při 18 8 C. P04094CZ_03/K579911-2 p. 17/27

Kontrola kvality 1. Signály musí být světlé, výrazné a snadno hodnotitelné. 2. Normální tkáně, které se ukázaly dříve jako na FISH reagující by měly být použity jako kontrola provedeného testu. 3. Buňky normálních tkání by měly mít zřetelně viditelné fluorescenční signály, indikující, že sondy FISH byly úspěšně hybridizovány do cílových oblastí. 4. Selhání detekovaných signálů v buňkách normálních tkání znamená selhání testu a výsledky by měly být považovány za neplatně. 5. Některé normální buňky budou mít z důvodu řezání tkání menší počet signálů, než je očekáváno. 6. Pokud se při hodnocení používá filtr DAPI, musí být jaderná morfologie intaktní a homogenní. Řada jakoby průhledných buněk a obecně špatná jaderná morfologie indikuje přílišné natrávení nebo denaturaci vzorku, což může mít za následek ztrátu fragmentace signálů. Zabarvení na okrajích, díry v buňkách (filtr DAPI) a/nebo silné zelené cytosolické zabarvení pozadí při pozorování dvojitým filtrem Texas Red/FITC může ukazovat na nedostatečné natrávení, které může vést ke ztrátě signálu. Takové vzorky by měly být považovány za neplatné. 7. Rozdíly ve fixaci tkání, zpracování a zalití tkání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. Interpretace výsledků Prozkoumejte několik oblastí buněk a spočítejte možnou heterogennost. Vyberte oblast s dobrou distribucí jader. Začněte analyzovat v levém horním čtverci zvolené oblasti zleva doprava a zjistěte počet signálů na jaderném okraji každého hodnoceného jádra podle níže uvedeného návodu. Postupujte shora dolů a hledejte všechny signály v jednotlivých jádrech. Nepočítejte jádra bez signálu. Nezahrnujte jádra, která vyžadují subjektivní posouzení. Vynechejte jádra se slabou intenzitou signálu a nespecifickým nebo příliš silným pozadím. Uživatel musí stanovit počet jader, která mají být do každé sondy započítána. Vyhněte se oblastem, kde jsou nukleové hranice nejasné. Omezení 1. Optimální inkubační doba pro digesci pepsinu se může lišit v závislosti na fixaci tkáně anebo tloušťce vzorku a musí být stanovena a ověřena uživatelem. 2. Příslušné informace o produktu a účelu použití sondy FISH najdete v příbalech jednotlivých sond FISH. 3. FISH je vícestupňový proces, který vyžaduje specializované školení ohledně výběru vhodných činidel, dále volby tkání, jejich fixace a zpracování, přípravy sklíček FISH a interpretace výsledků barvení. 4. Výsledky FISH závisí na manipulaci s tkáněmi a jejich zpracování před barvením. Nesprávná fixace, mytí, sušení, ohřívání, vytváření řezů nebo kontaminace jinými tkáněmi či kapalinami může ovlivnit hybridizaci sondy. Nekonzistentní výsledky mohou vzniknout kvůli odchylkám v metodách fixace a zalití nebo v důsledku skrytých nepravidelností tkání. 5. Pro optimální a reprodukovatelné výsledky je nutné, aby sklíčka s tkání byla dokonale deparafinizována. Odstranění parafínu musí být dokončeno před zahájením procesu barvení. (Viz návod k použití, část B.2). 6. Je třeba používat pouze teplotně kalibrované vodní lázně, topná tělesa a hybridizační pece. Použití jiných typů vybavení může způsobit odpařování směsi sondy během hybridizace a je na uživateli, aby je posoudil. P04094CZ_03/K579911-2 p. 18/27

Odstraňování závad Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Žádné nebo slabé signály 1a. Nesprávná doba trávení. 1a. Zajistěte, aby byly použity pouze formalínem fixované, do parafínu zalité tkáňové řezy. Prodloužená doba trávení, např. 7 15 minut při 37 C by mohla pomoci problém vyřešit. Viz část B.3.a nebo B.3.b, krok 2, odstraňování potíží, bod 4d, 4e a Příloha 2. 1b. Souprava byla vystavena během přepravy nebo skladování vysokým teplotám. 1c. Nesprávné podmínky předběžného zpracování. 1d. Nesprávné podmínky denaturace. 1b. Zkontrolujte podmínky skladování. Zkontrolujte, zda byl přítomen suchý led, když byla zásilka přijata. Zkontrolujte, zda lahvičky 2A a 5 byly skladovány při 2 8 C a zda lahvička 5 byla skladována v temnu. 1c. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného trávení. Dále, že inkubační doba trávení byla optimalizována, je-li to potřeba, viz část B.3.a nebo B.3.b, krok 2. Čím více se teplota předběžného zpracování blíží bodu varu, tím jsou signály silnější. Zkontrolujte, zda je s pepsinem nakládáno při správné teplotě. Viz část B1. 1d. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba denaturace. 1e. Nesprávná hybridizační teplota. 1e. Hybridizujte při 45 (±2) C, pokud používáte sondy FISH Dako. 1f. Odpaření pufru sondy během hybridizace. 1f. Zkontrolujte, zda je v hybridizační komoře dostatečná vlhkost. Použijte hybridizér Dako Hybridizer (kód S2450/S2451) a kontrolní proužky vlhkosti Hybridizer Humidity Control Strips (kód S2452). Použijte těsnící prostředek pro krycí sklíčka. Viz Řešení problémů, body 5a a 5b. P04094CZ_03/K579911-2 p. 19/27

1g. Nesprávné podmínky stringentního promývání. 1h. Mikroskop nefunguje správně. - Nasazení nesprávného filtru - Nevhodná lampa - Rtuťová lampa je příliš stará - Vyhořelé filtry - Špinavé nebo prasklé kolektorové čočky - Nevhodný imerzní olej 1g. Zkontrolujte, zda je dodržena doporučená teplota a doba stringentního promývání a zda byla odstraněna před provedením stringentního promývání krycí sklíčka. 1h. Zkontrolujte mikroskop a zjistěte, zda použité filtry jsou vhodné pro použití s fluorochromy, zda nejsou opotřebované a zda je použita vhodná rtuťová lampa a zda nebyla překročena doba použitelnosti lampy (viz Příloha 1). Použijte pro fluorescenci vhodný imerzní olej. V případě pochyb kontaktujte svého dodavatele mikroskopů. 1i. Vybledlé signály. 1i. Neprovádějte příliš dlouhá mikroskopická vyšetření a minimalizujte vystavení působení silných světelných zdrojů. 2. Oblasti bez signálu 2a. Nedostatečný objem sondy. 2a. Zajistěte, aby byl objem sond dostatečný k pokrytí plochy pod krycím sklíčkem 2b. Výskyt vzduchových bublin během aplikace sondy nebo montáže. 2c. Nedostatečně odstraněný parafín. 2b. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud zpozorujete vzduchové bubliny, opatrně je odstraňte pryč. 2c. Přesvědčte se, že z řezů byl odstraněn kompletně všechen parafín. Viz část B2. 3. Přílišné zabarvení pozadí 3a. Nesprávná doba trávení. Silné zelené cytosolické pozadí může ukazovat na nedostatečné natrávení. 3a. Zajistěte, aby byly použity pouze formalínem fixované, do parafínu zalité tkáňové řezy. Prodloužená doba trávení, např. 7 15 minut při 37 C by mohla problém vyřešit. Viz část B.3.a nebo B.3.b. krok 2, Řešení problémů, bod 4e a Příloha 2. 3b. Řezy v kroku B.3 vyschly. 3b. Postupujte podle pokynů a nenechejte řezy vysušit, pokud to není v pokynech. P04094CZ_03/K579911-2 p. 20/27

3c. Parafín není zcela odstraněn. 3c. Postupujte podle kroků odstranění parafínu a rehydratace uvedených v části B.2 3d. Teplota stringentního promývání je příliš nízká. 3e. Příliš dlouhé vystavení hybridizovaného řezu silnému světlu. 3f. Podložní sklíčka s prošlou dobou použitelnosti nebo nevhodně zvolená podložní sklíčka mohou způsobit příliš silné červené zabarvení červánky. 3d. Zkontrolujte, zda je dodržena doporučená teplota stringentního promývání. 3e. Neprovádějte příliš dlouhá mikroskopická vyšetření a minimalizujte vystavení působení silného světla. 3f. Použijte doporučený typ podložních sklíček a zkontrolujte, zda nemají prošlou dobu použitelnosti. Viz část Řezy zalité v parafínu. 4. Špatná morfologie jader nebo slabé zabarvení jader 3g. S fluorescenčním montážním médiem byl smísen nefluorescenční imerzní olej. 4a. Nesprávné podmínky předběžného zpracování mohou mít za následek nejasný nebo zakalený výsledek. 3g. Při provádění montáže použijte velká krycí sklíčka podle doporučení. Viz část B.3.a nebo B.3.b, krok 5. Tak se zabrání tomu, aby se imerzní olej smíchal s montážním médiem a aby nevznikala automatická fluorescence a předešlo se náhodnému odstranění krycích sklíček objektivem mikroskopu. 4a. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného trávení. Viz také Řešení problémů, body 4b-e. 4b. Vaření během předběžného zpracovávání může mít za následek poškození morfologie a ztrátu signálů. 4b. Zabraňte varu. Viz část B.3, krok 1. Viz také Řešení problémů, bod 4d. 4c. Nesprávné zpracování Pepsinu. 4c. Používejte doporučené inkubační doby pepsinu. Viz část B.3, krok 2 a Příloha 2. Viz též Řešení problémů, body 1a, 1c 3a, 4d a 4e. 4d. Příliš dlouhé působení pepsinu rozpouští tkáň a dochází tak ke ztrátě signálů. Příliš dlouhé natrávení může způsobovat vznik jakoby průhledných buněk a zobrazování jader s obecně špatnou jadernou morfologií. 4d. Zkraťte inkubační doby Pepsinu. Viz část B.3.a nebo B.3.b, krok 2 a Příloha 2. Zajistěte tloušťku řezu 2-6 µm. Viz též Řešení problémů, body 1a, 1c, 4b a 4e. P04094CZ_03/K579911-2 p. 21/27

5. Krycí sklíčko po hybridizaci silně přilnulo k podložnímu sklíčku a proto jde obtížně odstranit. 4e. Příliš krátké ošetření pepsinem může vést ke ztrátě signálů. Nedostatečně natrávená tkáň může mít za následek barvení okrajových jader a otvory v jádrech (filtr DAPI); silné zelené cytosolové zabarvení pozadí (dvojitý filtr Texas Red/FITC). Pamatujte, že jádra v nedostatečně natrávené tkáni mají, na rozdíl od nadměrně natrávené tkáně, pěkně zachovanou morfologii. 4f. Teplota denaturace je příliš vysoká. 4g. Nesprávné podmínky hybridizace. 5a. Krycí sklíčko je nesprávně utěsněno ke krycímu sklíčku. 5b. Nesprávné podmínky hybridizace. Může způsobit snížení nebo ztrátu signálů, poškození tkáně a zabarvení pozadí. 4e. Použijte prodloužené doby inkubace pepsinem, např. 2 3 krát delší než je použitý čas natrávení. Viz též Řešení problémů, body 1a, 1c, 3a, 4a a 4d. 4f. Zkontrolujte, zda je dodržena doporučená teplota denaturace. 4g. Viz Řešení problémů, body 1f a 5b. 5a. Neodstraňujte krycí sklíčko silou, jestliže je silně přilepeno ke skleněnému podložnímu sklíčku. Ponořte sklíčko do nádoby se zředěným stringentním promývacím pufrem Stringent Wash Buffer při pokojové teplotě na dobu pěti minut a potom krycí sklíčko odstraňte. Dodržujte doporučení k utěsnění krycích sklíček uvedená v části B.3.a nebo B.3.b, krok 3. Viz Řešení problémů, body 1f a 5b. 5b. Zkontrolujte, zda je v hybridizační komoře dostatečná vlhkost. Použijte hybridizér Dako Hybridizer (kód S2450/S2451) a kontrolní proužky vlhkosti Hybridizer Humidity Control Strips (kód S2452). Dodržujte pokynu v příbalové informaci ke kontrolním proužkům vlhkosti hybridizéru. Dodržujte doporučení k podmínkám hybridizace uvedená v části B.3.a nebo B.3.b, krok 3. Viz také Řešení problémů, body 1f a 5a. P04094CZ_03/K579911-2 p. 22/27

6. Vysoká úroveň zelené autofluorescence na sklíčku včetně oblastí bez tkáně FFPE 6. Použití prošlých nebo nevhodných podložních sklíček 6. Zkontrolujte, zda potažené sklíčko (Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo poly-l-lysinem potažené sklíčko) nemá prošlou dobu použitelnosti. POZNÁMKA: Pokud nelze za příčinu problému považovat žádnou z uvedených příčin nebo pokud se nepodaří problém doporučeným postupem vyřešit, obraťte se s žádostí o pomoc na technické služby společnosti Dako. P04094CZ_03/K579911-2 p. 23/27

Příloha 1 Histology FISH Accessory Kit, kód K5799 Specifikace fluorescenčního mikroskopu Společnost Dako doporučuje následující vybavení pro použití soupravy Histology FISH Accessory, používají-li se sondy Dako FISH: 1. Typ mikroskopu Episkopický fluorescenční mikroskop. 2. Lampa 100 wattová rtuťová lampa (měla by být nahrazena vždy po 200 hodinách provozu). 3. Objektivy Pro skrínink tkání jsou vhodné objektivy 10x suchá fluorescence nebo 16x fluorescence olejová imerziva. Pro velké rozlišení a hodnocení signálů se doporučují pouze fluorescenční objektivy s olejovou imerzí, např. 63x nebo 100x. 4. Filtry Filtry jsou navrženy pro konkrétní fluorochromy a jejich výběru je třeba věnovat náležitou pozornost. Dako doporučuje používat speciální filtry DAPI v kombinaci s vysoce kvalitním dvojitým filtrem Texas Red/FITC, používáte-li sondy FISH. Filtr DAPI Texaská červeň / dvojitý filtr FITC Texaská červeň a jednoduché filtry FITC mohou být použity po ověření. Fluorochrom Excitační vlnová délka Emisní vlnová délka FITC 495 nm 520 nm Texaská červeň 596 nm 615 nm Pro každý typ mikroskopu jsou určeny specifické filtry, proto je výběr filtru zásadní pro interpretaci výsledků. Další podrobné informace obdržíte od výrobce mikroskopů nebo od reprezentanta společnosti Dako. 5. Olej Nefluorescenční imerzní olej. Bezpečnostní opatření Jednotlivé fluorochromy vyžadují různé vybavení. Pro FISH sondy Dako je doporučena 50 wattová rtuťová výbojka, nelze použít rhodaminové filtry a nedoporučuje se použití trojitých filtrů. Neoptimalizovaný mikroskop může způsobit problémy při čtení fluorescenčních signálů. Je důležité, aby světelný zdroj neměl prošlou expirační dobu a aby byl správně nastaven a nasměrován. Uživatelé musí postupovat podle doporučení výrobce pro rtuťovou výbojku a musí řádně provádět údržbu mikroskopu. Aby bylo zamezeno vyblednutí fluorescence, je třeba vzorek vystavit excitačnímu světlu po co nejkratší dobu. Doporučuje se prodiskutovat nastavení konkrétního mikroskopu s výrobcem nebo nastudovat příslušnou literaturu před provedením fluorescence in situ hybridizace. P04094CZ_03/K579911-2 p. 24/27

Příloha 2 Stanovení optimální doby trávení Pepsinu - volitelný krok Tento volitelný krok může být použit k zhodnocení efektu trávení pepsinu a jako pomůcka při stanovení optimální doby trávení pepsinu, krok 2. Abyste mohli zkontrolovat, zda doba trávení pepsinu je dostatečná, musíte obarvit promyté, pepsinem natrávené tkáňové řezy 10 µl látky propidium iodid (400 ng/ml), dodané uživatelem. Přikryjte propidium iodid krycím sklíčkem o velikosti 22 mm x 22 mm a nechte ho rozprostřít pod krycí sklíčko. Inkubujte 1 minutu. K vyhodnocení červeného zabarvení jader propidium iodidem použijte fluorescenční mikroskop s dvojitým filtrem Texas Red/FITC (viz Příloha 1). Aby se trávení tkáně dalo označit jako vyhovující, musí být jádra zabarvena červeně po celém obvodu. Odstraňte propidium iodid opláchnutím řezů v naředěném promývacím pufru Wash Buffer dvakrát po 3 minutách při pokojové teplotě (20 25 C) a pokračujte částí B3 barvicího protokolu, krok 3, sonda FISH. Jsou-li jádra po autofluorescenci stále zelená a pokud se propidium iodidem nezabarvila červeně je nutné opakovat proces trávení: Řezy ponořte do naředěného promývacího pufru Wash Buffer dvakrát po 3 minutách při pokojové teplotě (20 25 C), aby se odstranil propidium iodid. Pro zakrytí vzorku aplikujte 5 8 kapek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Pepsin uchovávejte vždy při 2 8 C. Sklíčka vložte při 37 C na předehřátý topný blok nebo do hybridizéru Dako Hybridizer. Inkubujte 10 minut, pokud se projevuje slabé nebo žádné trávení. Inkubační doba v délce 10 minut je pouze doporučení; uživatel musí stanovit optimální doby inkubace. Řezy znovu ponořte do naředěného promývacího pufru Wash Buffer dvakrát po 3 minutách při pokojové teplotě (20 25 C), aby se odstranil pepsin. Přidejte ještě jednou 10 µl propidium iodidu (400 ng/ml) na dobu 1 minuty. Vyhodnoťte zabarvení a máčejte řezy v naředěním promývacím pufru Wash Buffer dvakrát po dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Je-li potřeba, opakujte cyklus nebo přejděte k části B.3.a nebo B.3.b, barvicí protokol, krok 3, sonda FISH. POZNÁMKA: Souprava obsahuje činidla postačující na 20 testů. Jestliže použijete promývací pufr Wash Buffer a pepsin pro tento volitelný krok, snížíte tak celkový počet možných testů provedených s touto soupravou. P04094CZ_03/K579911-2 p. 25/27

Reference 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, 1992. 2. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; 1980. 3. Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem 2002 50:113-5. 4. Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem 1999 47:703-9. 5. Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol 1992 45:763-5. 6. Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol 2000 53:336. 7. Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol 2006 30: 892 6. 8. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; 1981. P04094CZ_03/K579911-2 p. 26/27

Vysvětlení symbolů Katalogové číslo Teplotní rozmezí od do Čislo šarže In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Chraňte před slunečním světlem (viz sekci o skladování) Použitelné do Viz Návod k použití Lze použit pro <n> testů Výrobce Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Revize 2017.08 Výrobce: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel. +45 44 85 95 00 DK-2600 Glostrup Fax +45 44 85 95 95 Dánsko www.agilent.com P04094CZ_03/K579911-2 p. 27/27