Přímá analýza reálných vzorků hmotnostní spektrometrií s využitím nanodesorpčního elektrospreje (nano-desi-ms) Teorie: Desorpční elektrosprej (DESI) byl popsán v roce 2004 Zoltánem Takátsem. Jedná se o ambientní měkkou ionizační techniku, která umožňuje přímo analyzovat nízkomolekulární látky povrchu často bez jakékoliv úpravy. DESI ionizuje a desorbuje molekuly povrchu pomocí elektrospreje. Elektrosprej vytváří jemné nabité kapičky rozpouštědla, které dopadají na povrch pod úhlem, desorbují molekuly na povrchu a pod úhlem (viz. Obr. 1) jsou transportovány do hmotnostního spektrometru (MS). DESI je složeno ze dvou v sobě vložených kapilár. Vnitřní sprejovací kapilárou protéká rozpouštědlo (sprejovací kapalina), na které je vkládáno vysoké napětí 3-5 kv. Okolo vnitřní kapiláry proudí dusík, který pomáhá fokusovat jemný sprej a desorbovat molekuly povrchu do MS. Princip ionizace a desorpce molekul povrchu pomocí DESI není zcela objasněn. Na základě počítačových simulací se předpokládá, že analyzovaný povrch je postupně zavlažen sprejovací kapalinou, molekuly povrchu jsou extrahovány z povrchu do kapaliny, ionizovány a desorbovány. Ionty a nabité mikrokapičky jsou z povrchu odprašovány (tzv. droplet pick-up mechanismus) a transportovány do MS. DESI si pro svou jednoduchost našlo široké uplatnění např. v analýze farmakokinetik, výbušnin, produktů pyrolýzy a metabolismu, ale i ve forenzní chemii i v zobrazovacím 2D módu, např. při analýze lipidů v mozkové tkáni. Obr. 1 Schéma iontového zdroje DESI Pro toto cvičení byla navržena jednodušší alternativa desorpčního elektrosprej, desorpční nanoelektrosprej (nano-desi), se kterým má katedra analytické chemie letité zkušenosti. Nano-DESI nevyžaduje pomocný plyn k tvorbě spreje. Vysoké napětí je vkládáno na kapiláru s vnitřním průměrem 1-2 nm. Jenmý sprej nabitých kapiček rozpouštědla je vytvářen pomocí kapilárních sil ve sprejovací špičce a průtok kapaliny je v jednotkách nl/min (viz. Obr. 2).
Obr. 2 Schéma iontového zdroje nano-desi Nano-desorpční elektrosprej: Nano-DESI připevněný k hmotnostnímu spektrometru je zobrazen na Obrázku 3 a 4. Sprejer je pohyblivý v osách x, y, z a úhlu u. Barevně označené posuvné šrouby umožňují nastavit sprejer do správné geometrie. Žlutý šroub pohybuje sprejem v ose y, červený v ose x, zelený a šedý v ose z. Na pravé straně je červeně označeným drátem přiváděno vysoké napětí, proto buďte opatrní při manipulaci se zdrojem a vždy se ujistěte, že zdroj je vypnutý a v uživatelském okně svítí černý trojúhelník v zeleném pozadí (viz. níže). Pod sprejovací kapilárou je umístěno podložní sklíčko, na které je umístěn vzorek. Sprejer je snadno vyjmutelný k naplnění sprejovací kapiláry sprejovacím rozpouštědlem.
Obr. 3 DESI nasazené na hmotnostní spektrometr LCQ Finnigan Obr. 4 Sprejovací kapilára směřuje před ústí vstupní kapiláry hmotnostního spektrometru..
Analýza kofeinu ve slinách metodou nano-desi-ms Úvod: Nápoje typu káva, coca-cola nebo čaj obsahují kofein. Ve vysoké koncentraci je kofein pro lidský organismus toxický, ale v malých dávkách má povzbudivé účinky na lidský organismus. Jeho účinek má rychlý nástup, protože se během několika minut se vstřebává žaludeční sliznicí a pak v tenkém střevě. Uvádí se, že káva (200 ml) obsahuje kolem 120 mg kofeinu, energetický nápoj RedBull obsahuje 60 mg kofeinu a čaj jen 50 mg. Molekulová hmotnost kofeinu je 194 g/mol a xantinu 152 g/mol. Úkol: Sestavte kalibrační křivku závislosti koncentrace kofeinu na poměru absolutních intenzit kofeinu a vnitřního standardu xantinu. Stanovte koncentraci kofeinu ve slinách v časových intervalech 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 a 120 minut od požití nápoje s obsahem kofeinu. Chemikálie a pomůcky: Káva, pitná voda na propláchnutí úst, destilovaná voda, methanol, kyselina mravenčí, standard kofeinu a xantinu, mikrozkumavky (1,5 ml), podložní sklíčka, sprejovací špičky, mikrostříkačka 50 l, mikropipety, lihový fix, nano-desi, hmotnostní spektrometr LCQ Finnigan. Pracovní postup: 1) Na internetu vyhledejte molekulovou hmotnost kofeinu a xantinu. 2) Připravte si kalibrační roztoky kofeinu o objemu 100 l a koncentraci 0,5, 1, 10, 25, 50, 100 a 250 mg/l. Ke každému vzorku přidejte 100 l xantinu o koncentraci 5 mg/l a jako ředící roztok požijte směs metanolu:vody v poměru 1:1. 3) Připevněte DESI zdroj ke vstupu do hmotnostního spektrometru a upravte geometrii zdroje (viz. Teorie a Obr. 2, 3 a 4). Otevřete si program LCQ tune, ikonu najdete na ploše. Otevřete si metodu C:\Xcalibur\methods\desi\cvicení_kofein. Sprejovací špičku naplňte sprejovací kapalinou, upevněte ji do držáku, vložte čisté sklíčko do zdroje a přisuňte k vyhřívané kapiláře. Spusťte ladění. Na displeji se objevují spektra pozadí (sprejovací kapaliny), píky o nízké intenzitě okolo 10E3 (viz. Příloha 1). Nevidíte-li spektra, zastavte ladění a upravte geometrii nano-desi. Je-li signál stabilní, zastavte ladění. 4) Na podložní sklíčko naneste 5 l kalibračního roztoku a zespodu sklíčka označte fixem místo kapky. Nechte kapku uschnout. Zatím si připravte sptrejovací kapalinu: směs methanol:voda v poměru 1:1 s 0,2 % kyseliny mravenčí. Vložte sklíčko do zdroje a spusťte ladění. Vidíte-li ve spektru píky kofeinu a xantinu zastavte ladění a spusťte akvizici
. Spektra sbírejte jednu minutu. Spektra uložte do složky D:\Data\Desi_cvičení. Každý bod kalibrační křivky změřte dvakrát. (Práci si výrazně urychlíte tím, když nebudete měnit polohu sprejovací kapiláry, ale jen vypnete sprejování a opatrně vyměníte sklíčka se vzorky). 5) Sestavte kalibrační závislost. Na osu x vyneste koncentraci kofeinu a na osu y vyneste poměr absolutních intenzit kofeinu a xantinu. Proložte body lineární spojnicí trendu a zobrazte rovnici regrese. 6) Osm mikrozkumavek si označte v pořadí 1 až 8. Vypijte nápoj s kofeinem cca 150 ml a ústa vypláchněte alespoň 3 dl vody. Do 1. mikrozkumavky odeberte 100 l slin, jedná se o čas 0 minut. Sliny odebírejte každých 15 minut do po sobě jdoucích mikrozkumavek. Tedy do mikrozkumavky číslo osm odeberte sliny po 120 minutách. Ke každému 100 l vzorku slin přidejte 100 l roztoku vnitřního standardu xantinu, stejně jako při přípravě kalibračních vzorků. 7) Na podložní sklíčko naneste 5 l vzorku a nechte zaschnout. Vložte sklíčko do zdroje a spusťte akvizici. Sbírejte spektra 1 minutu. Opakujte 2x u všech vzorků slin. 8) Podle rovnice regrese kalibrační křivky spočítejte koncentraci kofeinu ve slinách a sestavte graf závislosti koncentrace kofeinu ve slinách na čase.
Příloha I. Spektrum pozadí DESI.