2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

Transkript

1 CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid) při různých počátečních koncentracích substrátu. Množství vzniklého produktu (p-nitroanilin žluté barvy) je úměrné rychlosti hydrolýzy. Po přidání inhibitoru (aprotininu) k reakční směsi se určí míra inhibice enzymové aktivity. Intenzita zbarvení reakčního roztoku se měří při % kyselina octová 0.05 M Tris-HCl pufr, ph 8.2 (obsahuje 0.02 M CaCl 2 ) M BAPNA v dimethylsulfoxidu trypsin (1 mg/ml) aprotinin (vodný roztok 1:1000) 1) Připravte řadu roztoků BAPNA o různé koncentraci ředěním základního roztoku podle následující tabulky: č. zkumavky BAPNA (ml) Dimethylsulfoxid (ml) ) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. 3) Do 1. řady zkumavek pro slepé stanovení přidejte 1.8 ml 0.05 M Tris-HCl pufru, 0.3 ml roztoku kys. octové a 0.2 ml roztoku trypsinu v uvedeném pořadí. 4) Do 2. řady zkumavek přidejte 1.8 ml 0.05 M Tris-HCl pufru, vložte do termostatu nastaveného na 35 C a nechte cca 5 min vytemperovat. Potom pipetujte postupně v minutových intervalech 0.2 ml roztoku trypsinu, čímž zahájíte enzymovou reakci. Přesně po 10 minutách od zahájení reakce v první zkumavce začněte opět v minutových intervalech přidávat do zkumavek ve stejném pořadí 0.3 ml 30% kys. octové, čímž reakci ukončíte. Upozornění: Doba reakce musí být v každé jednotlivé zkumavce přesně 10 min. 5) Do 3. řady zkumavek přidejte 1.6 ml 0.05 M Tris-HCl pufru a 0.2 ml roztoku inhibitoru (aprotininu). Dále postupujte stejně jako v bodu 4. 6) Po ukončení enzymové reakce přidejte do všech zkumavek 4 ml destilované vody, abyste naředili intenzivní žluté zbarvení. Změřte absorbanci výsledného roztoku při vlnové délce 405 nm vždy proti slepému pokusu o téže koncentraci substrátu.. Do grafu vyneste naměřené hodnoty absorbance (veličina úměrná reakční rychlosti) proti hodnotám počátečních koncentrací substrátu v reakčním roztoku pro inhibovanou i 1

2 neinhibovanou reakci. Graficky dvojnásobným reciprokým vynesením absorbance proti počáteční koncentraci substrátu určete hodnotu K m. Určete maximální reakční rychlost V max ( A/10 min) u obou reakcí, vypočítejte procento inhibice a určete její typ. 2) Stanovení glukosy setem BIO-LA-TEST Glukosa se oxiduje kyslíkem za katalýzy glukosaoxidasou na peroxid vodíku a glukonát. Vzniklý H 2 O 2 se stanovuje reakcí katalyzovanou peroxidasou v přítomnosti chromogenu. Vzniklý barevný produkt se měří spektrofotometricky při vlnové délce 500 Glukosa + ½ O 2 + H 2 O glukosaoxidasa > glukonát + H 2 O 2 ½ H 2 O aminoantipyrin + fenol peroxidasa > chinonimin + 4 H 2 O BIO-LA-TEST je komerční set určený pro stanovení hladiny glukosy v krevním séru nebo plasmě v klinických laboratořích. Pracovní roztok se připraví smícháním obsahu 2 lahviček podle přiloženého návodu. č. 1 enzymy, 4-aminoantipyrin č. 2 pufr, chromogen 1) Do 3 označených zkumavek pipetujte roztoky podle tabulky: Roztok Blank Standard Vzorek Glukosa standard - 10 µl - Vzorek µl Dest. voda 10 µl - - Pracovní roztok 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 2) Obsah zkumavek promíchejte a 30 min inkubujte bez míchání při laboratorní teplotě nebo 15 min při 37 C. Inkubační roztok musí být chráněn před přímým světlem. 3) Do 40 min po skončení inkubace změřte absorbanci vzorku a standardu proti slepému pokusu (blank) při vlnové délce 500 Vypočítejte koncentraci glukosy ve vzorku podle vztahu: A vzorku c standardu = c glukosy (mmol/l) koncentrace standardu glukosy je 5 mmol/l A standardu 2

3 3) Stanovení proteolytické aktivity pomocí rozpustného a nerozpustného chromolytického substrátu 3a) Stanovení aktivity trypsinu nerozpustným chromolytickým substrátem Černá želatina jako nerozpustný chromolytický substrát byla připravena zesítěním želatiny glutaraldehydem v přítomnosti černé tuše. Působením trypsinu se hydrolyticky štěpí některé peptidové vazby želatiny a dochází k uvolňování černé tuše do reakční směsi. Výhodou tohoto substrátu je, že je možné měřit aktivitu proteas i v barevných vzorcích, protože černé zbarvení roztoku umožňuje měřit absorbanci v širokém rozsahu vlnových délek M Tris-HCl pufr, ph 8.2 trypsin (100 µg/ml) černá želatina (10 mg/ml) 1) Připravte si nerozpustný substrát k 0.2 g černé želatiny přidejte 20 ml pufru a na magnetické míchačce nechte nabobtnat cca půl hodiny. 2) Připravte si dvě sady po 6 zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. 3) Do druhé sady napipetujte za stálého míchání 2 ml suspenze černé želatiny a pufr podle následující tabulky. Obsah zkumavek nechejte cca 5 min vytemperovat v termostatu při 37 C. Potom přesně v minutových intervalech začněte přidávat do zkumavek roztok trypsinu podle tabulky. č. zkumavky pufr (µl) trypsin (µl) ) Obsah zkumavek krátce promíchejte a inkubujte v termostatu přesně 30 min při 37 C. Přesně po 30 minutách od zahájení reakce v první zkumavce opět v minutových intervalech inkubační směs krátce protřepejte a ihned přefiltrujte do připravené sady zkumavek. 5) Změřte absorbanci roztoků č. 2 6 proti zkumavce č. 1 (slepý vzorek) při vlnové délce 600 6) Připravte si dvě řady po třech zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. Za stálého míchání pipetujte do 3 zkumavek druhé řady 2 ml suspenze substrátu. Do 1. zkumavky pipetujte 1 ml pufru (slepý pokus). Obsah zkumavek nechte cca 5 min temperovat v termostatu při 37 C. 7) Potom přesně v minutových intervalech přidejte do zkumavek č. 2 a č. 3 1 ml vzorku trypsinu o neznámé koncentraci. Dále postupujte přesně podle bodu 4 a 5. 3

4 Z naměřených hodnot podle bodu 5 sestrojte kalibrační křivku (závislost absorbance na koncentraci enzymu v µg/ml, závislost není lineární v celém rozsahu). Vypočtěte koncetraci trypsinu v neznámém vzorku v µg/ml. 3b) Stanovení aktivity trypsinu rozpustným chromolytickým substrátem Azokasein je chemicky modifikovaný mléčný protein kasein s navázanou oranžovou sulfanilamidovou skupinou. Hydrolýzou se uvolňují barevné peptidy rozpustné v trichloroctové kyselině. Kyselina trichloroctová také zastaví proteolýzu a precipituje makromolekuly (enzymy a nezhydrolyzovaný azokasein) M Tris-HCl pufr, ph 8.2 trypsin (2 mg/ml) rozpustný chromolytický substrát: 1% azokasein v 0.05 M Tris-HCl pufr, ph 8.2 5% trichloroctová kyselina 1) Připravte si dvě sady po 6 zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. 2) Do druhé sady pipetujte 1 ml 1% azokaseinu a pufr podle následující tabulky. Obsah zkumavek krátce promíchejte a nechte cca 5 min vytemperovat v termostatu při 37 C. č. zkumavky pufr (µl) trypsin (µl) ) Potom přesně v minutových intervalech začněte přidávat do zkumavek roztok trypsinu podle tabulky. Obsah zkumavek krátce promíchejte a inkubujte v termostatu 30 min při 37 C. Přesně po 30 minutách od zahájení reakce v první zkumavce opět v minutových intervalech zastavte reakci přidáním 1.5 ml 5% trichloroctové kyseliny a ihned přefiltrujte do připravené sady zkumavek. 4) Změřte absorbanci roztoků č. 2 6 proti zkumavce č. 1 (slepý vzorek) při vlnové délce 366 5) Připravte si dvě řady po třech zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. Do všech tří zkumavek druhé sady napipetujte 1 ml 1% azokaseinu a do 1. zkumavky přidejte 1 ml pufru (slepý pokus). Obsah zkumavek krátce promíchejte a nechte cca 5 min temperovat v termostatu při 37 C. 6) Potom přesně v minutových intervalech přidejte do zkumavek č. 2 a č. 3 1 ml vzorku trypsinu o neznámé koncentraci. Dále postupujte přesně podle bodu 3 a 4. Z naměřených hodnot podle bodu 4 sestrojte kalibrační přímku (závislost absorbance na koncentraci enzymu v µg/ml). Vypočtěte koncetraci trypsinu v neznámém vzorku v µg/ml. 4

5 4) Detekce proteolytické aktivity na tenké vrstvě chromolytického substrátu Jednoduchá detekce proteas je založená na hydrolýze velmi tenké vrstvy nerozpustného chromolytického substrátu, konkrétně želatiny zesítěné glutaraldehydem v přítomnosti vhodného barviva. Metoda může být dobře použita k rychlé detekci proteolytické aktivity v různých vzorcích. vzorky enzymů desky s nanesenou vrstvou barevné želatiny Kápněte na destičku 10 µl jednotlivých vzorků enzymatických preparátů. Nechejte inkubovat 20 min po poslední aplikaci vzorku při laboratorní teplotě. Potom destičku krátce a důkladně opláchněte pod tekoucí vodou a odstraňte zhydrolyzované fragmenty. Bezbarvá místa indikují přítomnost proteasy ve vzorku. Určete vzorky, ve kterých jste nalezli proteolytickou aktivitu. 5