(GENO)TOXICITA PRACHOVÝCH ČÁSTIC Jan Topinka Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR jtopinka@biomed.cas.cz
Úvod Respirabilní (PM2.5) prachové částice ve vnějším ovzduší obsahují komplexní směsi polutantů - řada toxických i genotoxických látek (PAU a jejich deriváty) Mechanismy působení komplexních směsí nejsou dosud dobře popsány Cíle Vyhodnocení genotoxicity org.látek z PM v ovzduší Studium změn v genové expresi v odpovědi na působení těchto látek u dvou různých linií plicních buněk
PM 2,5 (<2,5 μm) in 4 lokality: 1. Ostrava Bartovice 2. Ostrava Poruba 3. Karviná 4. Třeboň Odběr vzorků Odběr 24 hodin denně (ne vždy) 30-35 dní (Listopad 2009 Duben 2010) 4 1-3 Velkoobjemový vzorkovač ECOTECH
Extrakce organických látek z filtrů Extrakce organické hmoty z filtrů dichlormetanem + chemická analýza PAU firma ALS Czech Republic s.r.o. Dichlormetan odpařen dusíkem, odparky rozpuštěny v DMSO (50 mg/ml),
Velkoobjemové odběry a analýza PAU Porovnání zima 2008-2009 a 2009-2010 Lokalita Období odběru Objem vzduchu [m 3 ] PM 2,5 [μg/m 3 ] B[a]P [ng/m 3 ] c-pahs [ng/m 3 ] Ostrava-Bartovice 03/2009 29 900 36.7 13.6 81.6 Ostrava-Poruba 03/2009 35 200 25.8 4.28 27.2 Karviná 04/2009 47 400 n.a. 1.88 12.1 Třebon 11-12/2008 44 700 11.4 1.11 7.92 Lokalita Období odběru Objem vzduchu [m 3 ] PM 2,5 [μg/m 3 ] B[a]P [ng/m 3 ] kpau [ng/m 3 ] Ostrava-Bartovice 1-2/2010 17 207 130,3 29,01 235,1 Ostrava-Poruba 3-4/2010 47 367 34,4 4.73 34,2 Karviná 11-12/2009 32 104 69,4 24,6 162,5 Třeboň 11-12/2009 56 622 13,0 1,71 11,2
Buněčné linie Buňky HEL lidské embryonální plicní fibroblasty Buňky A549 buňky lidského alveolárního adenokarcinomu
In vitro inkubace (zima 2008-2009) HEL a A549 24h inkubace s extrakty organických látek (EOM) ze 4 lokalit ve 3 subtoxických koncentracích kontrola - DMSO 10, 30, 60 µg extraktu/ml
In vitro inkubace (zima 2009-2010) Extrakty přidávány do kultivačního média k buňkám v koncentracích odpovídajících obsahu PM2.5 respektive obsahu extrahovatelné hmoty (EOM) v PM2.5/m 3 vzduchu Ostrava-Bartovice: 10, 30, 60 µg/ml. S ohledem na nižší obsah EOM/m3 v ostatních lokalitách byly spočteny následující faktory: Ostrava-Poruba 3,6; Karviná 2.2; Třeboň 10,5, kterými byly výše uvedené koncentrace vyděleny, abychom mohly udělat kvantitativní porovnání toxicity ovzduší, tj dýcháme stejný objem vzduchu ať jsme v Bartovicích nebo v Třeboni.
Prováděné analýzy test cytotoxicity (LDH test) nalezení subtoxických koncentrací stanovení genotoxicity (hladiny DNA aduktů 32 P- postlabeling) analýza celogenomové exprese pomocí čipové technologie a ověření výsledků qpcr
DNA adukty (relativní jednotky) DNA adukty (relativní jednotky) Genotoxicita DNA adukty zima 2008-2009 HEL A549 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 10 30 60 10 30 60 10 30 60 10 30 60 Bartovice Poruba Karviná Třeboň 0 10 30 60 10 30 60 10 30 60 10 30 60 Bartovice Poruba Karviná Třeboň
DNA adukty na 10 8 nukleotidů DNA adukty na 10 8 nukleotidů Genotoxicita DNA adukty zima 2009-2010 HEL A549 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 Bartovice Poruba Karviná Třeboň 0 Bartovice Poruba Karviná Třeboň
DNA adducts / 0 8 nucleotides DNA adducts / 10 8 nucleotides Korelace genotoxicity (DNA aduktů) s koncentrací benzo[a]pyrenu v extraktech zima 2008-2009 HEL A549 8 R 2 = 0.822 6 R 2 = 0.965 6 4 4 2 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 B[a]P ng/ml medium 0 0 20 40 60 80 B[a]P ng/ml medium
Analýza celogenomové exprese Komplexní směsi vedle genotoxických i řada jiných toxických účinků Biologická interpretace složitá a časově náročná Seznam deregulovaných genů většinou nestačí potřebná je analýza biologických drah a procesů
Změny genové exprese v buňkách po působení organických extraktů z PM2.5 Analýza pokrývá prakticky celý lidský genom Výsledky zatím pro zimu 2008-2009 Platforma Illumina
Analýza celogenomové exprese Metody analýzy biologických drah 2 základní přístupy 1. Analýza na úrovni individuálních genů Porovnání genové exprese jednotlivých genů mezi 2 skupinami (exponované vs. kontrolní), výsledkem je seznam diferenciálně exprimovaných genů 2 kroky: 1. stanovení změn exprese jednotl. genů mezi 2 nebo i více skupinami 2. seznam testován na obohacení konkrétních biologických procesů
Number of deregulated genes Počty významně deregulovaných genů Number of deregulated genes HEL A549 3000 2500 2000 1500 10 ug/ml 30 ug/ml 60 ug/ml 600 500 400 300 10 ug/ml 30 ug/ml 60 ug/ml 1000 200 500 100 0 Ostrava - Bartovice Ostrava - Poruba Karviná Třeboň 0 Ostrava - Bartovice Ostrava - Poruba Karviná Třeboň
Analýza celogenomové exprese 2. Analýza na úrovni genových setů Genový set je skupina genů, které jsou součástí stejného biologického procesu Např. databáze KEGG pathways (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)- databáze biochemických, metabolických a regulačních drah Tento přístup je z řady důvodů výhodnější menší pravděpodobnost ztráty informace
Buňky HEL identifikace změněných biologických dráh a genů (výběr) Metabolismusof xenobiotik cytochromy P450 * Wnt signální dráha * Metabolismus glutathionu * TGF-beta signální dráha * Metabolismus arachidonové kyseliny * Gap junction * Metabolismus léčiv cytochromy P450 * p53 signaling Nukleotidová excizní reparace CYP1B1, MGST1 NKD2, SMAD3 CCND2, WNT2 MGST1 BMP2, ID2 TBXAS1, PTGS2 TJP1, TUBA3D MGST1 CHEK2 POLE2 * Přizpůsobené p-value < 0.05
Závěry (stále jen dílčí) 1. Genotoxicita ovzduší nejvyšší v Ostravě-Bartovicích 2. Analýza celogenomové exprese Identifikovány deregulované geny a biologické dráhy specifické pro dané lokality a buněčné linie vybrány zajímavé stezky pro HEL (p-value < 0.05) a geny, které měly největší příspěvek pro deregulaci těchto stezek Výsledky na čipech ověřeny qpcr vysoká hodnota korelace Detailnější analýza výsledků stále pokračuje
Poděkování Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha H. Líbalová K. Hanzalová A. Milcová J. Schmuczerová V. Stránecký J. Kléma J. Topinka R.J. Šrám Podpora: Ministerstvo školství mládeže a tělovýchovy (#2B08005) Grantová Agentura České republiky (#P503-11-0142)
Veřejně prezentované nesmysly (vystoupení pana primátora Kajnara v Událostech ČT 14.11.2011) Reakce p.kajnara na dokument britské celoplošné televize ITV: Britové by si měli zamést před vlastním prahem neboť znečištění PM10 v Londýně je aktuálně vyšší než v Ostravě aneb svoje znečištění si rozvracet nedáme Jak to je ve skutečnosti???: http://www.chmi.cz; http://www.zuova.cz http://www.london.gov.uk/sites/default/files/monit oringairpollution.pdf
a aby to bylo politicky vyvážené (24.11.2011 Právo, náměstek ostravského primátora p.madej) p.madej Nevidím důvod, dávat peníze do výzkumu, který vyzkoumá jen to, co tady všichni víme. Že zde máme špatné ovzduší ovlivňující zdraví lidí. Raději bych peníze místo na výzkum dal například na čištění ostravských ulic aneb buržoazní pavědi stěžují nám práci Jestliže tedy vše potřebné víme: pak netřeba monitorovat stav ovzduší na Ostravsku ze strany ČHMÚ a ZÚ Ostrava a můžeme zavřít příslušná oddělení na těchto institucích a příslušní pracovníci by mohli řídit čistící vozy
Děkuji za pozornost