BUNĚČNÝ CYKLUS III. (Nové odpovědi na staré otázky)

BUNĚČNÝ CYKLUS III. (Nové odpovědi na staré otázky) Fatima Cvrčková Katedra fyziologie rostlin PřF UK, Viničná 5, 128 44 Praha 2 E-mail fatima@prfdec.natur.cuni.cz Úvod Uplynuly 3 roky od chvíle, kdy jsem se na stránkách této série sborníků již podruhé zabývala eukaryotním buněčným cyklem (Cvrčková, 1995). V prvním článku této série (Cvrčková, 1993) jsem se soustředila na popis dnes již klasického modelu buněčného cyklu jakožto posloupnosti událostí řízených centrálním oscilátorem, jehož ústřední součástí je proteinkináza p34 cdc2 řízená regulační podjednotkou-cyklinem. Druhý článek cyklu o cyklu pak podrobněji pojednává o mechanismu fungování tohoto oscilátoru, jak byl popsán v modelovém případě pučivé kvasinky Saccharomyces cerevisiae (Box 1). Ačkoli si jistě nemůžeme dovolit tvrdit, že u motýlků je to taky tak, reprezentativní příklad jednoduché jednobuněčné kvasinky ukazuje, jak složitá je kontrola buněčného cyklu u moderních eukaryotních organismů, které si na rozdíl od svých dávných příbuzných zřejmě nemohou dovolit mnoho riskovat. U mnohobuněčných živočichů a rostlin je pak systém regulace pomocí CDK a cyklinů ještě složitější - zatímco kvasinka si vystačí s jedinou CDK, typická savčí buňka jich má aspoň 7. Zdá se na první pohled téměř nepochopitelné, že by složitá, mnohonásobně provázaná a vysoce redundantní síť regulačních drah zodpovědných za řízení jednotlivých kroků vedoucích k buněčnému dělení mohla vzniknout chybujícím, bloudícím a křivolakým procesem biologické evoluce. Přesto si lze představit evoluční scénář, který mohl vést k postupnému vzniku současné složité regulační hierarchie (Cvrčková, 1995; Cvrčková, 1996). V této - již třetí - části volné série o buněčném cyklu se budeme věnovat několika aspektům, kterým bylo až dosud věnováno jen málo prostoru. Zatím jsme se příliš nezabývali jinou než transkripční regulací funkce genů, ačkoli posttranslační úpravy proteinů hrají v řízení buněčného cyklu extrémně důležitou úlohu. Sotva jsme se dotkli otázky, co vlastně CDK kinázy a cykliny bezprostředně řídí, a už vůbec nebyla řeč o tom, jak je činnost

centrálních regulátorů buněčného cyklu ovlivňována mimobuněčnými faktory. Všechna tato opomenutí by tato kapitola měla aspoň z části vynahradit. Box 1: CDK a cykliny pučivé kvasinky Saccharomyces cerevisiae Buněčný cyklus S. cerevisiae je řízen jedinou CDK kódovanou genem CDC28, která střídá regulační podjednotky-cykliny, jak je znázorněno na obrázku (vodorovná osa představuje čas vyjádřený jako fáze cyklu, svislá koncentraci cyklinů). Funkce některých kvasinkových cyklinů se vzájemně překrývají, což má za následek zdánlivou funkční redundanci. Buňka tedy může přežít ztrátu některých cyklinů, nedokáže však např. projít buněčným cyklem, pokud nemá aspoň jeden z tzv. G1 cyklinů nutných pro průchod startem - rozhraním mezi G1 a S fází (Cln1, Cln2, Cln3) nebo zahájit replikaci DNA, nemá-li ani jeden cyklin typu Clb. Clb5,6 Clb3,4 Cln1,2 Clb1,2 Cln3 G1 S G2 M "start" Vzestupné fáze všech křivek odrážejí regulaci transkripce genů pro cykliny. Sestupné fáze pak obrážejí jednak inhibici transkripce (jako v případě Cln cyklinů, jejichž geny jsou od S fáze reprimovány následkem akumulace cyklinů typu Clb), jednak proteolytickou degradaci cyklinů, která je také pod kontrolou CDK (Clb cykliny po skončení replikace DNA a zahájení anafáze v G2/M indukují vlastní degradaci, a příslušný specifický proteolytický komplex je inaktivován až v důsledku akumulace Cln cyklinů v příští G1). Nejen transkripce: posttranskripční regulace v eukaryotním buněčném cyklu Aniž bychom zlehčovali význam kontroly buněčných procesů regulací genové exprese na transkripční úrovni, musíme si připustit, že transkripční regulace je sice významným, ale zdaleka ne jediným mechanismem, který se při řízení eukaryotního buněčného cyklu uplatňuje. Totéž možná platí i u jiných biologických pochodů, které bývají občas prezentovány jako záležitosti převážně transkripční - např. odpovědi buňky na různé zevní signály. To, že transkripci můžeme dosti snadno studovat a že o ní hodně víme, neznamená, že bychom se neměli rozhlížet po dalších molekulárních mechanismech.

V případě buněčného cyklu je zřejmé, že tyto další mechanismy budou alespoň dva. Protože jeden z ústředních regulátorů buněčného cyklu je proteinkináza, je zřejmé, že fosforylace proteinů bude hrát klíčovou roli. (Méně zřejmé je, že ona ústřední kináza - CDK - bude vystupovat nejen jako původce fosforylace, ale také - jak záhy uvidíme - jako její substrát.) Vzhledem k periodickým změnám koncentrace většiny cyklinů nás rovněž nepřekvapí, že významné řídicí pochody se budou odehrávat na úrovni kontroly destrukce proteinů (ale mohlo by nás překvapit, že regulace proteolytických procesů v rámci cyklu zdaleka není omezena na cykliny). CDK jakožto substrát fosforylace Podmínkou aktivity CDK není jen asociace s cyklinem, ale i přítomnost dalších proteinových složek aktivního polypeptidového komplexu (jako je např. metodicky významný p13 suc1 ) a naopak absence proteinových inhibitorů CDK (CKI), o kterých ještě bude řeč. Kromě toho CDK podléhají regulaci prostřednictvím fosforylace katalytické podjednotky. Podmínkou pro to, aby se molekula CDK mohla aktivovat spojením s cyklinem, je fosforylace konzervativního threoninového zbytku (T161 - T167). Za tuto fosforylaci, která by mohla být významná pro rozhodování o vstupu buňky ze stavu mimo cyklus do cyklu, odpovídá kináza, označovaná jako CAK - CDK activating kinase. Z hlediska regulačního je nanejvýš zajímavé, že úlohu CAK přinejmenším v některých případech hrají kinázy blízce příbuzné CDK, jako je třeba Kin28 u S. cerevisiae, nebo dokonce přímí členové CDK rodiny! Fosforylace CDK kináz na jiném místě - na dvojici threoninu a tyrosinu poblíž N-konce molekuly (T14 Y15 nebo T18 Y19) naopak CDK inaktivuje. Přinejmenším u poltivé kvasinky S. pombe je poměr fosforylované a nefosforylované formy CDK kódované genem cdc2+ pečlivě regulován poměrem aktivit specifických kináz (Wee1 a Mik1) a proteinfosfatázy Cdc25, a přispívá ke kontrole velikosti buňky (Nurse, 1991). Transkripční mechanismus regulace vstupu do cyklu velikostí buňky, podrobně diskutovaný v předchozím článku této série, tedy není jedinou možností řešení významného problému spřažení mezi cyklem a růstem (Box 2). Zajímavé je, že tentýž mechanismus inhibice CDK fosforylací je zachován i u savčích buněk, kde snad přispívá k řízení mitózy, a u pučivé kvasinky, kde je jeho úloha zcela jiná (Amon et al., 1992). Uplatňuje se totiž jako záchranná brzda (checkpoint), umožňující pozastavit jaderné dělení, pokud nedošlo k pučení a buňka by tudíž nemohla projít cytokinezí (Lew and Reed, 1995a; Lew and Reed, 1995b).

Setkáváme se zde tedy s dalším z mnoha příkladů zřejmě obecného biologického jevu: zatímco na jedné straně tentýž problém (spřažení růstu a cyklu) je řešen více způsoby, na straně druhé tentýž mechanismus (fosforylace CDK) je používán k různým účelům. Box 2: Kritická velikost a regulace cyklu velikostí buňky Buňky prokaryotních i eukaryotních mikroorganismů často za širokého rozmezí podmínek vstupují do cyklu při konstantním nukleocytoplasmatickém poměru, což zajišťuje, že se v posloupnosti po sobě následujících cyklů buňky kultury ani nezvětšují, ani nezmenšují (důkaz pro kvasinky viz např. (Hartwell and Unger, 1977)). Hovoříme o tzv. kritické velikosti pro vstup do cyklu, protože zdvojení biomasy u eukaryotních buněk trvá obvykle delší dobu, než jaká je třeba k uskutečnění všech strukturních událostí buněčného cyklu. Cyklus tedy musí někde počkat, až jej růst dožene. U organismů, které jsou zpravidla diploidní, jako třeba S. cerevisiae (viz Box 4) nebo my, může buněčný cyklus čekat v G1, protože i v předreplikačním stavu má buňka od každého chromosomu záložní kopii. Pučivá kvasinka skutečně podle potřeby reguluje průchod startem - G1/S rozhraním. U haploidních organismů, jako je S. pombe, je bezpečnější pozdržet cyklus až po replikaci - v G2 (Nasmyth et al., 1991). Jaký molekulární mechanismus zajišťuje, že buňka vnímá svou velikost? Jednou z možností je titrace vazebných míst v jádře, jejichž počet je úměrný ploidii, nějakým faktorem, jehož koncentrace v buňce je stálá a množství připadající na jádro tedy odráží velikost buňky. Současný model startu u pučivé kvasinky předpokládá závislost aktivace transkripce cyklinů Cln1a Cln2 na absolutním množství necyklujícího cyklinu Cln3 - srv. Box 1, (Dirick et al., 1995) a příslušnou pasáž v (Cvrčková, 1995). V případě regulace spřažení mezi růstem a cyklem u poltivé kvasinky lze snad spekulovat o variantě tohoto mechanismu: víme, že CDK se (aspoň někdy) vyskytují v jádře, a můžeme si představit, že specifické kinázy (Wee1/Mik1) a fosfatáza (Cdc25), jejichž aktivita odráží velikost buňky, by mohly chodit do jádra za svým substrátem. Při současném nedostatku údajů o lokalizaci a regulaci těchto kináz a fosfatázy však skutečně zůstává jen u spekulace. Destrukce proteinů: nejen cykliny jsou degradovány Degradace proteinů hraje v kontrole buněčného cyklu významnou roli. Základní rysy mechanismu, který u S. cerevisiae na základě řízené proteolýzy Clb cyklinů pomáhá zabránit současné akumulaci G1 a G2 cyklinů, byl již diskutován v předchozím článku této série; v detailech odkazuji na původní práce (Amon et al., 1994; Amon, 1997). Jeden z mechanismů, kterými buňka selektivně odstraňuje vybrané proteiny, je založen na označování proteinů odsouzených k degradaci kovalentní vazbou několika kopií ubikvitinu. Tento mechanismus se uplatňuje i při inaktivaci (alespoň některých) cyklinů - viz např. (Luca, 1993; King et al., 1996; Irniger and Nasmyth, 1997). Zjištění, že jeden z klasických cdc genů S. cerevisiae, CDC34, kóduje ubikvitin-konjugující enzym, tedy nebylo žádným překvapením. Buňky s podmíněně letální mutací cdc34 jsou v restriktivních podmínkách

schopny pučet (dokonce několikrát), nedovedou však replikovat jadernou DNA. Mají přitom zvýšenou hladinu G1 (Cln) cyklinů a neměřitelnou aktivitu proteinkinázy asociované s Clb cykliny, které jsou potřebné pro replikaci DNA a mitózu. Poněkud překvapivě se však ukazuje, že příčinou není neschopnost degradovat G1 cykliny, jak by se možná dalo předpokládat, ale neschopnost odstranit specifický proteinový inhibitor Clb/Cdc28 komplexů, syntetizovaný v G2/M a přetrvávající do G1 příštího cyklu (Schwob et al., 1994; Knapp et al., 1996). Tento inhibitor, kódovaný genem SIC1, je představitelem významné třídy tzv. CDK inhibitorů (CKI) - regulačních molekul, které se možná podílejí na řízení buněčného cyklu stejně významnou měrou, jako cykliny (Nasmyth and Hunt, 1993; Pines, 1994). CKI představují mnohem různorodější skupinu molekul, než cykliny - liší se navzájem strukturou, velikostí i funkcí: od regulátorů replikace u kvasinek, jako je již zmiňovaný Sic1 nebo Rum1 u Schizosaccharomyces pombe (Labib and Moreno, 1996) po nejrůznější živočišné CKI o různě široké specifitě i úloze (Xiong et al., 1993; Serrano et al., 1993; Gu et al., 1993); některé z nich se účastní odpovědi živočišných buněk na růstové faktory (Reynisdottir et al., 1995), a je vážné podezření, že poruchy této třídy regulátorů hrají významnou úlohu při vzniku rakoviny (Sherr, 1996). Substráty CDK a regulace strukturních událostí buněčného cyklu Až dosud jsme se zabývali téměř výhradně centrálními regulátory buněčného cyklu - CDK a cykliny, a ponechali jsme stranou otázku, co a jak CDK řídí. Přitom ale prvotním důvodem našeho zájmu o buněčný cyklus byly právě ony řízené události, především replikace a segregace genetického materiálu. Nyní ale snad už víme dost na to, abychom se k dosud zanedbávanému tématu strukturních událostí cyklu vrátili. Proč se jaderná DNA replikuje jen jednou za cyklus? Jedním z klasických problémů buněčné biologie je otázka, co zabraňuje opakované replikaci chromozómů nebo jejich částí v rámci jednoho buněčného cyklu. Vhodným nástrojem ke studiu tohoto problému samozřejmě jsou kvasinkoví mutanti, u kterých dochází k odpřažení mezi replikací a mitózou. Jedním takovým příkladem jsou mutanti S. pombe s pozměněným (inaktivovaným či naopak hyperaktivovaným) genem pro již zmiňovaný CKI Rum 1. Podle okolností u nich totiž může docházet k mitóze bez předchozí replikace (např. v rum1- buňkách, pokud nezávislým způsobem zablokujeme replikaci jejich DNA) nebo naopak k opakované replikaci DNA v rámci jednoho cyklu (např. v buňkách s konstitutivní

expresí rum1+)(murray, 1994; Labib and Moreno, 1996). Vzhledem k tomu, že Rum1 zasahuje do centrální regulace cyklu, však zmíněné mutace možná nepostihují vlastní regulaci replikace DNA. Mutantní buňky by například mohly trpět poruchou uvědomování si vlastní pozice v rámci cyklu, takže i při nepatřičné replikaci by jejich CDK a cykliny procházely stavem, který zhruba odpovídá normální S fázi. Dalším zajímavým příkladem kvasinkového genu ovlivňujícího časování replikace DNA je CDC6. Protein kódovaný tímto genem je (spolu s dalšími proteiny) součástí tzv. prereplikačních komplexů (pre-rc), které se ustavují během G1 fáze kolem proteinového jádra trvale umístěného v oblasti replikačních počátků - tzv. ORC komplexů. Tvorba pre-rc sama je pod kontrolou CDK a cyklinů (Heichman and Roberts, 1994). Pouze nereplikované replikační počátky (s intaktními pre-rc) jsou použity v následující S-fázi, a replikace převádí pre-rc na postreplikační ORC, které jsou pro novou iniciaci nepoužitelné (Stillman, 1996) (viz obrázek). anafáze mitózy pre-rc ORC Cdc6 replikace DNA Transkripce CDC6 je regulována v závislosti na fázi buněčného cyklu a Cdc6 protein sám je nestabilní, takže může vstupovat do pre-rc pouze v okně mezi mitózou a pozdní G1 následujícího cyklu. To je jedním z faktorů, které zabraňují předčasné obnově transkripční kompetence použitých replikačních počátků. (Piatti et al., 1995) Další kontrolu pak zajišťuje inaktivace Cdc6 proteinu nenavázaného na ORC prostřednictvím Clb cyklinů a Cdc28 (Piatti et al., 1996). I zde se tedy setkáváme s ukázkovým příkladem vícenásobného jištění ( redundance ) důležitých buněčných funkcí. Anatomie mitózy Souvislost mezi CDK, cykliny a mitózou je obecně známá: prvním biochemicky charakterizovaným CDK/cyklinovým komplexem byl právě MPF čili mitosis promoting factor. Mechanismy, které zajišťují koordinaci složitého mnohastupňového procesu jaderného dělení (Box 3) se zbytkem cyklu však dlouho zůstávaly záhadou.

Nelze totiž vystačit s prostým konstatováním, že akumulace mitotických cyklinů vyvolává nástup metafáze a jejich degradace anafázi (schéma A). Ukazuje se totiž, že kvasinky s mutací cdc15 zastavují průchod cyklem v anafázi B nebo telofázi, ale s vysokou hladinou mitotických (Clb) cyklinů, a i v jiných systémech (např. v extraktech oocytů) lze navodit anafázi bez rozkladu cyklinů (Surana et al., 1993) (Luca, 1993). Zdálo by se tedy, že degradace cyklinů není příčinou, nýbrž následkem nějaké události, která vyvolává přechod z metafáze do anafáze (schéma B). A CDK cyclin metafáze anafáze telofáze G1 B Cdc15 metafáze anafáze telofáze G1 C APC Cdc15 metafáze anafáze telofáze G1 Poněkud překvapivě se ale ukazuje, že rozchod sesterských chromatid, který jistě nezávisí na degradaci cyklinů, vyžaduje proteolytickou dráhu závislou na ubikvitinu, která se rozkladu cyklinů také účastní. Důvod byl objeven nedávno: stejný proteolytický aparát závislý na ubikvitinu odstraňuje mitotické cykliny a odděluje od sebe sesterské chromatidy na rozhraní metafáze a anafáze! Tento rozsáhlý proteolytický komplex sestávající z mnoha podjednotek, je označován jako APC (anaphase promoting complex) a v současnosti je předmětem intenzivního studia. Již dnes je však jasné, že jde o evolučně velice konzervativní systém (Peters et al., 1996; Zachariae et al., 1996; Zachariae and Nasmyth, 1996; Yu et al., 1998; Jorgensen et al., 1998; Zachariae et al., 1998). Na závěr ještě malá odbočka k předchozímu tématu. Už byla řeč o dvou mechanismech zabraňujících opakované replikaci DNA v rámci jednoho buněčného cyklu, teď je na řadě třetí. Kvasinkový APC zůstává aktivní od anafáze až do startu příštího buněčného cyklu a

zabraňuje tak nejen předčasné akumulaci G2 cyklinů, ale zřejmě i zahájení replikace uvnitř G1 (Irniger and Nasmyth, 1997). Box 3: Fáze mitózy Mitotickou anafázi (pohyb chromozómů od ekvatoriální roviny buňky k pólům vřeténka) lze u rostlinných a živočišných buněk dále rozčlenit: zatímco v anafázi A se zkracují mikrotubuly, spojující kinetochory chromosomů s MTOC (centriolem), v anafázi B se MTOC vzdalují od sebe a vřeténko se prodlužuje. metafáze anafáze A telofáze anafáze B U kvasinek, kde chromozómy v mitóze nekondenzují a jaderná membrána zůstává celistvá, nemůžeme morfologicky rozlišit mezi metafází a anafází A; až v anafázi B je vidět prodloužení vřeténka a rozdělení masy DNA. Žádná buňka není sama: buněčný cyklus a signály z prostředí Navzdory jednobuněčnému způsobu života se kvasinka osvědčila jako neobyčejně úspěšný model pro studium odpovědi buňku na mimobuněčné signály. Kvasinka reaguje jak na abiotické podněty z prostředí např. (dostupnost živin), tak i na signály vysílané jinými kvasinkami (Box 4). Nemusí ovšem vždy jít jen o specifické signální molekuly, jako jsou feromony - kvasinky vnímají i těkavé metabolity sousedních buněk, například amoniak (Palková et al., 1997). Zůstaňme však prozatím u feromonů, protože signální dráha, kterou kvasinka vnímá jejich přítomnost a reaguje na ni, je prvním příkladem, kde v hrubých rysech známe celou cestu přenosu signálu od receptoru na membráně až po konečné efektory - transkripční faktory a regulátory buněčného cyklu (přehled viz (Ammerer, 1994)). Haploidní buňky S. cerevisiae mají na cytoplasmatické membráně receptory pro feromon vylučovaný buňkami opačného párovacího typu. Vazba feromonu na receptor má za následek disociaci podjednotek

trimerního G-proteinu asociovaného s receptorem. Podjednotky βγ pak dále interagují s proteinkinázou Ste20, která se kromě této své funkce v přenosu feromonového signálu účastní také buněčné morfogeneze (Simon et al., 1995). Dále následuje kaskáda tří vrstev proteinkináz, které aktivují jedna druhou prostřednictvím fosforylace. Tato kaskáda, sestávající z proteinů Ste7, Ste11 a Fus3/Kss1, odpovídá evolučně konzervovanému MAP kinázovému modulu (MAPKKK, MAPKK a MAPK) známého z buněk živočichů a rostlin. Jedním z proteinů fosforylovaných kinázami nejnižšího stupně (Fus3/Kss1) je transkripční faktor Ste12, který kontroluje expresi řady genů nutných pro diferenciaci vegetativní buňky v gametu. Jedním z nich je gen FAR1, kódující specifický CKI, který hraje významnou úlohu v synchronizaci konjugujících buněk v G1 fázi. Odpověď na feromony samozřejmě není jediným příkladem přímé reakce buněčného cyklu kvasinky na podněty z prostředí. Jiným příkladem může být úprava kritické velikosti buňky (viz Box 2) v závislosti na dostupnosti živin. V bohatém médiu jsou totiž kvasinky větší - buňky snad využívají příznivých podmínek k tomu, aby si nastřádaly na horší časy. Ukazuje se, že dostupnost živin ovlivňuje vnitrobuněčnou hladinu camp, jejíž zvýšení má za následek relativní zpomalení syntézy Cln cyklinů v poměru k rychlosti buněčného růstu, a posléze zvýšení kritické velikosti (Baroni et al., 1994; Tokiwa et al., 1994). V podobném směru by mohla působit i společná regulace příjmu živin a degradace Cln cyklinů, na níž se podílí produkt genu GRR1 (Barral et al., 1995). Box 4: Životní cyklus pučivé kvasinky Mimo speciální laboratorní či průmyslové situace tráví Saccharomyces cerevisiae jen poměrně malou část svého života aktivní proliferací, tedy provozováním buněčného cyklu. V podmínkách nepříznivých dělení, jaké panují po většinu roku, setrvávají buňky zpravidla ve stacionární fázi, kterou lze pokládat za obdobu fáze G0 savčích buněk - stav mimo cyklus, který je jakousi odbočkou G1. Rovněž o dalších možných vývojových osudech kvasinky - sporulaci u diploidů a konjugaci u haploidů - se rozhoduje v G1, přičemž nejzazší hranicí, kdy lze (aspoň ve druhém vzpomínaném případě) osud buňky v daném cyklu ještě změnit, je start. Zatímco sporulace je indukována vhodně nevhodnými kultivačními podmínkami (např. acetát jako jediný zdroj uhlíku), ke konjugaci dochází za podmínek vhodných pro vegetativní růst, je-li k dispozici potenciální partner opačného párovacího typu, vysílající peptidové feromony. Protože diferenciace vegetativních buněk v gamety probíhá v podmínkách vhodných pro růst, je součástí diferenciačního programu kromě exprese specifických proteinů pro konjugaci a kromě přestavby buněčného tvaru také zablokování buněčného cyklu v pozdní G1.

Dodatek: jak smířit nesmiřitelné aneb ohlédnutí za jednou kontroverzí Ve vztahu k eukaryotnímu buněčnému cyklu jsme si poslední dobou připomněli dvě výročí. Vloni uplynulo 30 let od doby, kdy Leland Hartwell publikoval článek popisující izolaci série kvasinkových termosenzitivních mutantů s poruchami syntézy makromolekul (Hartwell, 1967). Netušil ovšem, že vedlejším produktem jeho úsilí bude sbírka kvasinkových kmenů, mezi kterými o několik let později identifikuje první cdc mutanty se specifickými poruchami pochodů vedoucích k buněčnému dělení a učiní tak první krok směrem ke stavbě modelu buněčného cyklu, jak jej známe dnes. Před 10 lety pak byla publikována série prací, z níž vyrostl základ sjednoceného modelu buněčného cyklu (Arion et al., 1988; Dunphy et al., 1988; Gautier et al., 1988; Labbe et al., 1988). Snad by stálo za to připomenout si, co vzniku tohoto modelu předcházelo. Výzkum buněčného cyklu od 60. do konce 80. let ovládaly dvě diametrálně odlišné a zdánlivě nesmiřitelné koncepce. Na počátku jedné z těchto větví zkoumání snad stály klasické práce fágové genetiky 60. let (viz např. (Weigle, 1966)), z nichž vyplynul model postupného sestavování fágových partikulí po definovaných krocích, z nichž každý může nastat jen tehdy, když byly úspěšně dokončeny všechny předchozí. Odtud už nebylo příliš daleko k modelu buněčného cyklu jakožto posloupnosti biochemicky definovaných stavů buněčného obsahu, z nichž každý může nastat jen tehdy, když byly úspěšně dokončeny všechny předchozí. Z takového modelu, který hezky vystihuje představa padající řady kostiček domina, které porážejí jedna druhou, právě vycházel L. Hartwell ve svých klasických experimentech s cdc mutanty, na jejichž základě zkonstruoval první genetický model buněčného cyklu (Hartwell et al., 1974). Druhá větev studia buněčného cyklu vyšla z experimentů s fúzí buněk z různých stadií buněčného cyklu, které ukázaly, že mitotické buňky obsahují jakousi látku, která dokáže v interfázním jádře indukovat určité příznaky mitózy, a že cytoplasma buněk v S fázi může vyvolat replikaci DNA v buňkách z G1 fáze (viz přehled a diskuse prací Raa a Johnsona z počátku 70. let v (Nasmyth, 1996). Biochemická identifikace proteinového komplexu označovaného jako mitosis promoting factor (MPF) pak elegantně zapadala do představy, že buněčný cyklus je řízen centrálním oscilátorem či vnitřními hodinami. Taková představa ovšem byla neslučitelná s modelem posloupnosti vzájemně závislých událostí, a ještě v r. 1986 nebyly nikterak vzácné spekulace o tom, že buněčný cyklus kvasinek představuje zvláštní, výjimečný případ, a že buněčný cyklus vyšších eukaryot je možná řízen úplně jinak.

Jak víme nyní, deset let poté, co byl produkt Hartwellova klíčového genu CDC28 identifikován jakožto katalytická podjednotka MPF, opak je pravdou. Molekulární mechanismy řídící buněčný cyklus hub, rostlin a živočichů sice nejsou identické, s klidným svědomím však můžeme říci, že jsou variacemi na společné (a evolučně bezpochyby velice staré) téma. Na cestu, která vedla od dvou nesmiřitelných koncepcí domina a hodin až k jednotnému modelu buněčného cyklu jakožto cyklu cdc2 (Murray, 1989; Murray and Kirschner, 1989), bychom mohli nahlížet jen jako na nedůležitou historickou kuriozitu. Můžeme v ní ale vidět i naději: to, že nějaký jev lze popsat dvěma způsoby, které se navzájem (zdánlivě) vylučují, ještě neznamená, že jeden z popisů musí být špatně! Terminologický slovníček APC buněčný cyklus CAK CDC CDK checkpoint CKI cyklin (cyclin) proteinový komplex, který zodpovídá za fyzické rozpojení chromatid metafázických chromozómů a indukuje tak anafázi (anaphase promoting complex) posloupnost událostí, kterými z jedné buňky vzniká více než jedna buňka (typicky 2, ačkoli se setkáváme i se situacemi, kdy z jedné buňky vzniká 2 n buněk; tyto tzv. C n cykly jsou typické např. pro některé řasy) proteinkináza fosforylující Thr161/Thr167 různých CDK kináz a tím umožňující jejich aktivaci (CDK activating kinase) geny kvasinek (Saccharomyces cerevisiae či Schizosaccharomyces pombe) kontrolující jednotlivé strukturní události buněčného cyklu (cell division cycle genes) nebo strukturní homology těchto genů z jiných organismů; protože CDC geny pučivé a poltivé kvasinky byly identifikovány nezávisle, tentýž gen může být označován dvěma různými čísly a naopak, a vždy je nutno dávat pozor na kontext proteinkináza regulovaná cyklinem (cyclin dependent kinase) mechanismus, kontrolující průběh událostí buněčného cyklu a v případě potřeby pozastavující průběh cyklu, aby buňka získala čas k opravě případného poškození (např. mechanismus zabraňující mitóze při nedoreplikované chromozomální DNA) inhibitor CDK kináz (CDK inhibitor) původně protein, jehož koncentrace v buňce se periodicky mění v závislosti na stadiu buněčného cyklu a který reguluje aktivitu CDK kináz; nyní kterýkoli příslušník strukturně definované genové rodiny, identifikované na základě společných sekvenčních rysů cyklinů vyhovujících původní definici

MPF faktor vyvolávající maturaci oocytů a mitózu oplodněných vajíček (maturation/mitosis promoting factor), později identifikovaný jako komplex proteinů, jehož hlavní složkou je p34 cdc2 a cyklin MTOC pól dělicího vřeténka (microtubule organizing center); u živočišných buněk funkci MTOC vykonává centriol, u kvasinek jaderný plak (SPB, spindle pole body), u rostlin zřejmě struktury funkčně analogické SPB a umístěné v jaderné membráně ORC komplex proteinů umístěný na replikačním počátku v chromozomální DNA a v jeho těsném okolí (origin recognition complex) p13 suc1 p34 cdc2 pre-rc start protein o velikosti zhruba 13 kdal, který je součástí aktivního CDKcyklinového komplexu; afinita mezi p13 suc1 a CDK je často využívána k izolaci či měření aktivity CDK-cyklinových komplexů. proteinkináza o molekulové hmotnosti zhruba 34 kdal, kódovaná homologem genu cdc2+ Schizosaccharomyces pombe nebo CDC28 Saccharomyces cerevisiae; historicky první popsaný typ CDK kinázy prereplikační komplex, soustava chromozomálních proteinů, která se ustavuje v průběhu G1 fáze v okolí replikačního počátku; součástí pre-rc je komplex označovaný jako ORC dle původní Hartwellovy definice událost, kontrolovaná produktem kvasinkového genu CDC28, jejíž uskutečnění ireverzibilně rozhoduje o vstupu buňky do příštího buněčného cyklu; prakticky se kryje s překročením hranice G1/S a s aktivací syntézy Cln cyklinů Literatura Ammerer, G. (1994). Sex, stress and integrity: the importance of MAP kinases in yeast. Curr.Opin.Genet.Dev. 4, 90-95. Amon, A. (1997). Regulation of B-type cyclin proteolysis by Cdc28-associated kinases in budding yeast. EMBO J. 16, 2693-2702. Amon, A., Irniger, S., and Nasmyth, K. (1994). Closing the cell cycle circle in yeast: G2 cyclin proteolysis initiated at mitosis persists until the activation of G1 cyclins in the next cycle. Cell 77, 1037-1050. Amon, A., Surana, U., Muroff, I., and Nasmyth, K. (1992). Regulation of p34cdc28 tyrosine phosphorylation is not required for entry into mitosis in S. cerevisiae. Nature 355, 368-371. Arion, D., Meijer, L., Brizuela, L., and Beach, D. (1988). cdc2 is a component of the M phase-specific histone H1 kinase: evidence for identity with MPF. Cell 55, 371-378. Baroni, M.D., Monti, P., and Alberghina, L. (1994). Repression of growth-regulated G1 cyclin expression by cyclic AMP in budding yeast. Nature 371, 339-342. Barral, Y., Jentsch, S., and Mann, C. (1995). G1 cyclin turnover and nutrient uptake are controlled by a common pathway in yeast. Genes Dev. 9, 399-409. Cvrčková, F. (1993). Buněčný cyklus. In Molekulární biologie a genetika VI. J. Jonák, ed. (Praha: ČSPCH ÚMG AV ČR a KRBS CIS UK), pp. 16-34. Cvrčková, F. (1995). Buněčný cyklus II: blížíme se rozluštění genetického kódu? In Molekulární biologie a genetika VII. J. Jonák, ed. (Praha: ČSVTS a CIS UK), pp. 59-71. Cvrčková, F. (1996). Životní minimum z pohledu bakterie. Vesmír 75, 128-131.

Dirick, L., Bohm, T., and Nasmyth, K. (1995). Roles and regulation of Cln-Cdc28 kinases at the start of the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14, 4803-4813. Dunphy, W.G., Brizuela, L., Beach, D., and Newport, J. (1988). The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell 54, 423-431. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., and Maller, J. (1988). Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene cdc2+. Cell 54, 433-439. Gu, Y., Turck, C.W., and Morgan, D.O. (1993). Inhibition of CDK2 activity in vivo by an associated 20K regulatory subunit. Nature 366, 707-710. Hartwell, L.H. (1967). Macromolecule synthesis in temperature-sensitive mutants of yeast. J.Bacteriol. 93, 1662-1670. Hartwell, L.H., Culotti, J., Pringle, J.R., and Reid, B.J. (1974). Genetic control of the cell division cycle in yeast. Science 183, 46-51. Hartwell, L.H. and Unger, M.W. (1977). Unequal division in Saccharomyces cerevisiae and its implication for the control of cell division. J.Cell Biol. 75, 422-435. Heichman, K.A. and Roberts, J.M. (1994). Rules to replicate by. Cell 79, 557-562. Irniger, S. and Nasmyth, K. (1997). The anaphase-promoting complex is required in G1 arrested yeast cells to inhibit B-type cyclin accumulation and to prevent uncontrolled entry into S-phase. J.Cell Sci. 110, 1523-1531. Jorgensen, P.M., Brundell, E., Starborg, M., and Hoog, C. (1998). A subunit of the anaphasepromoting complex is a centromere-associated protein in mammalian cells. Mol.Cell Biol. 18, 468-476. King, R.W., Deshaies, R.J., Peters, J.M., and Kirschner, M.W. (1996). How proteolysis drives the cell cycle. Science 274, 1652-1659. Knapp, D., Bhoite, L., Stillman, D.J., and Nasmyth, K. (1996). The transcription factor Swi5 regulates expression of the cyclin kinase inhibitor p40sic1. Mol.Cell Biol. 16, 5701-5707. Labbe, J.C., Lee, M.G., Nurse, P., Picard, A., and Doree, M. (1988). Activation at M-phase of a protein kinase encoded by a starfish homologue of the cell cycle control gene cdc2+. Nature 335, 251-254. Labib, K. and Moreno, S. (1996). rum1: a CDK inhibitor regulating G1 progression in fission yeast. Trends Cell Biol. 6, 62-66. Lew, D.J. and Reed, S.I. (1995a). A cell cycle checkpoint monitors cell morphogenesis in budding yeast. J.Cell Biol. 129, 739 Lew, D.J. and Reed, S.I. (1995b). Cell cycle control of morphogenesis in budding yeast. Curr.Opin.Genet.Dev. 5, 17 Luca, F.C. (1993). Does degradation lead to segregation? Curr.Biol. 3, 716-718. Murray, A.W. (1989). Cell biology: the cell cycle as a cdc2 cycle [news; comment]. Nature 342, 14-15. Murray, A.W. (1994). Rum tale of replication. Nature 367, 219-220. Murray, A.W. and Kirschner, M.W. (1989). Dominoes and clocks: the union of two views of the cell cycle. Science 246, 614-621. Nasmyth, K. (1996). Viewpoint: putting the cell cycle in order. Science 274, 1643-1645. Nasmyth, K. and Hunt, T. (1993). Cell cycle. Dams and sluices [news; comment]. Nature 366, 634-635. Nasmyth, K.A., Dirick, L., Surana, U., Amon, A., and Cvrčková, F. (1991). Some facts and thoughts on cell cycle control in yeast. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 56, 9-20. Nurse, P. (1991). Universal control mechanisms regulating onset of M-phase. Nature 354, 356-357. Palková, Z., Janderová, B., Gabriel, J., Zikánová, B., Pospíšek, M., and Forstová, J. (1997). Ammonia mediates communication between yeast colonies. Nature 390, 532-536. Peters, J.M., King, R.W., Hoog, C., and Kirschner, M.W. (1996). Identification of BIME as a subunit of the anaphase-promoting complex. Science 274, 1199-1201. Piatti, S., Bohm, T., Cocker, J.H., Diffley, J.F., and Nasmyth, K. (1996). Activation of S-phasepromoting CDKs in late G1 defines a "point of no return" after which Cdc6 synthesis cannot promote DNA replication in yeast. Genes Dev. 10, 1516-1531.

Piatti, S., Lengauer, C., and Nasmyth, K. (1995). Cdc6 is an unstable protein whose de novo synthesis in G1 is important for the onset of S phase and for preventing a 'reductional' anaphase in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14, 3788-3799. Pines, J. (1994). Arresting developments in cell cycle control. Trends.Biochem.Sci. 19, 143-145. Reynisdottir, I., Polyak, K., Iavarone, A., and Massague, J. (1995). Kip/Cip and Ink4 Cdk inhibitors cooperate to induce cell cycle arrest in response to TGFβ. Genes Dev. 9, 1831-1845. Schwob, E., Bohm, T., Mendenhall, M.D., and Nasmyth, K. (1994). The B-type cyclin kinase inhibitor p40sic1 controls the G1 to S transition in S. cerevisiae [see comments] [published erratum appears in Cell 1996 Jan 12;84(1):following 174]. Cell 79, 233-244. Serrano, M., Hannon, G.J., and Beach, D. (1993). A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 366, 704-707. Sherr, C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science 274, 1672-1677. Simon, M.N., De Virgilio, C., Souza, B., Pringle, J.R., Abo, A., and Reed, S.I. (1995). Role for the Rho-family GTPase Cdc42 in yeast mating-pheromone signal pathway. Nature 376, 702-705. Stillman, B. (1996). Cell cycle control of DNA replication. Science 274, 1659-1664. Surana, U., Amon, A., Dowzer, C., McGrew, J., Byers, B., and Nasmyth, K. (1993). Destruction of the CDC28/CLB mitotic kinase is not required for the metaphase to anaphase transition in budding yeast. EMBO J. 12, 1969-1978. Tokiwa, G., Tyers, M., Volpe, T., and Futcher, B. (1994). Inhibition of G1 cyclin activity by the Ras/cAMP pathway in yeast. Nature 371, 342-345. Weigle, J. (1966). Assembly of phage lambda in vitro. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 55, 1462-1466. Xiong, Y., Hannon, G.J., Zhang, H., Casso, D., Kobayashi, R., and Beach, D. (1993). p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases. Nature 366, 701-704. Yu, H., Peters, J.M., King, R.W., Page, A.M., Hieter, P., and Kirschner, M.W. (1998). Identification of a cullin homology region in a subunit of the anaphase- promoting complex. Science 279, 1219-1222. Zachariae, W. and Nasmyth, K. (1996). TPR proteins required for anaphase progression mediate ubiquitination of mitotic B-type cyclins in yeast. Mol.Biol.Cell 7, 791-801. Zachariae, W., Shevchenko, A., Andrews, P.D., Ciosk, R., Galova, M., Stark, M.J., Mann, M., and Nasmyth, K. (1998). Mass spectrometric analysis of the anaphase-promoting complex from yeast: identification of a subunit related to cullins. Science 279, 1216-1219. Zachariae, W., Shin, T.H., Galova, M., Obermaier, B., and Nasmyth, K. (1996). Identification of subunits of the anaphase-promoting complex of Saccharomyces cerevisiae. Science 274, 1201-1204.