BUNĚČNÝ CYKLUS SOMATICKÝCH BUNĚK A JEHO REGULACE

Transkript

1 BUNĚČNÝ CYKLUS SOMATICKÝCH BUNĚK A JEHO REGULACE Somatické buňky (jakékoliv buňky organismu kromě pohlavních buněk) během své existence procházejí sérií buněčných cyklů. Výjimkou jsou např. neurony, jsou to plně diferencované buňky, které setrvávají permanentně v interfázi. Průběh buněčného cyklu je řízený a kontrolovaný různými mechanismy např. (i) geneticky řízená kontrola v tzv. kontrolních bodech; (ii) délka telomer (viz dále); (iii) signální molekuly ve vazbě s receptory nebo (iiii) molekuly, které jsou syntetizované v cyklující buňce (např. cykliny, cyklin-dependentní proteinkinasy nebo cyklus inhibující proteiny). Buněčný cyklus somatických buněk sestává ze dvou funkčně odlišných období; z interfáze a vlastního buněčného děl mitózy. Interfáze tvoří vět část buněčného cyklu, mitóza představuje jeho krat část. Mitóza je úsek buněčného cyklu, během kterého vzniknou z rodičovské buňky dvě buňky dceřiné s rovnoměrně rozděleným genetickým álem. Děl somatických buněk je nezbytné pro růst organismu a diferenciaci tkání. Vybrané příklady genů podílejících se na regulaci buněčného cyklu Cykliny a na cyklinech závislé proteinkinasy (Cyclin-Dependent Protein Kinases; Cdkproteinkinasy) jsou proteiny, které jsou součástí řídícího systému buněčného cyklu. Jsou to produkty genů zvaných protoonkogeny (viz Onkogenetika). Katalyzují fosforylaci jiných proteinů. Vyskytují se buď v inaktivní formě anebo ve formě aktivní, což závisí na vazbě s dalmi molekulami, které Cdk proteiny fosforylují. U vyšch živočichů je dosud známo 8 cyklinů, které jsou značeny A, B, C, D, E, F, G a H a 7 typů Cdk-proteinkinas (Cdk1-Cdk7). V jednotlivých fázích buněčného cyklu jsou přítomné určité typy cyklinů v komplexu s určitou Cdk-proteinkinasou. Cyklické spoj nebo zruš vazby jednotlivých typů cyklinů s Cdk molekulami, a jejich následná degradace, je hlavní reakce, která umožňuje navoz postupných fází buněčného cyklu. Jednotlivé Cdk-proteinkinasy vykazují odlišné funkce v závislosti na fázích buněčného cyklu. Aktivita Cdk-proteinkinas je ložena na fosforylaci serinů a threoninů cílových proteinů, ale jedině pokud Cdk-proteinkinasy vytvoří komplex s příslušnými cykliny. Bez této vazby jsou Cdk molekuly inaktivní. Působ molekul Cdk je podporováno vazbou s PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) a inhibováno působm inhibitorů proteinkinas. Zvýšená hladina inhibitorů Cdk-proteinkinas je jedním z regulačních mechanismů, který vede k zastav buněčného cyklu ve fázi G1. ál elům m a dal řen

2 Zjednodušené schéma buněčného cyklu, kontrolní body, účast cyklinů a cyklin-dependentních proteinkinas Mitóza Cyklin A+B : Cdk 1 G 2 M Cyklin B : Cdk 2 G 2 G 1 G 0 Cyklin A : Cdk2 S Cyklin B : Cdk 2 Kontrolní bod 2 Kontrolní bod 1 S G 1 Cyklin D : Cdk2,4,5+6 G 1 Cyklin E : Cdk2 Tumor-supresorové geny kódují proteiny, které se uplatňují při inhibici proliferace a růstu buněk. Jejich ztrátové mutace souvisejí se vznikem různých typů nádorů (viz Onkogenetika). Nejlépe je prozkoumán vztah průběhu buněčného cyklu a genů Rb-1 a TP53. Gen Rb1 se nachází na dlouhém raménku chromosomu 13 (13q14). Je aktivní téměř ve všech somatických buňkách. Jeho produkt, Rb protein (prb), je jaderný transkripční faktor, který má zásadní úlohu při regulaci buněčného děl, během diferenciace a při indukci apoptózy. Má schopnost vázat se s nesčetným množstvím proteinů, které se podílejí na buněčné diferenciaci a proliferaci a regulovat jejich činnost. Inhibiční usměrňování přechodu z G 1 do S fáze Rb proteinem určuje jeho fosforylace. Rb protein je aktivní pokud je nefosforylovaný nebo málo fosforylovaný. Hlavním cílem aktivního prb jsou multifunkční transkripční faktory rodiny E2F. Rodina transkripčních faktorů E2F (E2F1 - E2F6) má rozhodující úlohu v kontrole buněčného cyklu. Tyto transkripční faktory řídí aktivitu genů podílejících se na progresi buněčného cyklu, syntéze DNA a apoptóze. Komplex prb-e2f potlačuje transkripci genů, jejichž produkty jsou nezbytné pro postup přes G1/S kontrolní bod, je například ál elům m a dal řen cyklin D a E. Tím je průběh buněčného cyklu pozastaven. Naopak neaktivní fosforylovaná

3 forma Rb proteinu vede k uvolnění prb z vazby s proteiny, které umožňují přechod z G1 do S fáze (např. faktory E2F). Komplex cyklin D-Cdk 4/6 se podílí na první fázi uvolnění buněčného cyklu z kontrolního bodu G 1. Následuje syntéza cyklinu E, který pak v komplexu s Cdk 2 posunuje buněčný cyklus z kontrolního bodu G1 do S fáze. Fosforylace serinů a threoninů proteinu Rb (a tím jeho inaktivace) je vyvolána cyklindependentními proteinkinasami. Cdk fosforylují prb až po vzniku komplexu Cdk s příslušným cyklinem. Interakce Cdk s cyklinem je iniciována vazbou molekul růstových faktorů k receptorům. Rb protein je v buňkách přítomen neustále. V průběhu buněčného cyklu se ze střídá jeho fosforylace a defosforylace. Ve fosforylované neaktivní formě zůstává v průběhu S, G2 a M fáze. Tumor-supresorový gen TP53 je nazýván strážce genomu, protože na jeho funkci závisí, zda proběhne kontrola genetického álu mezi G1/S fází a opravy chyb (velký repair). Tento gen se též podílí při kontrole genetického álu po replikaci mezi S/G2 fází, v tzv. post-replikačním kontrolním bodě (malý repair). Gen TP53 je lokalizován na krátkých raménkách chromosomu 17 (17p13). Produkt genu TP53, protein p53, je transkripční faktor, který se váže na promotor několika cílových genů a reguluje jejich transkripci. Produkty těchto genů teprve vykonávají specializované funkce, je pozastav buněčného cyklu, oprava poškoz genetického álu nebo navoz apoptózy. Gen TP53 reaguje na poškoz DNA a různé typy stresu (hypoxie, nedostatek růstových faktorů atp.) zvýšenou expresí a zvýšm stability (prodloužm poločasu degradace) proteinu p53. Pozastavm buněčného cyklu v G1 fázi umožňuje reparačním mechanismům provést opravu poškozené DNA. Reakce buněk na aktivaci p53 je závislá jak na hladině p53, tak i na buněčném typu a na dalch regulačních proteinech, zejména na proteinu Rb. Produkt genu TP53 je jaderný fosfoprotein p53, který působí transkripční faktor pro několik cílových genů. Uvádíme tři geny, které mají zásadní význam pro regulaci buněčného cyklu, reparaci poškoz genetického álu a navoz apoptózy. Jsou to geny CIP1/WAF 1(Cyklin-dependent Inhibitor Protein Kinase / Wild-type p53 dependent growth Arrest Factor), GADD 45 (Growth Arrest and DNA Damage) a BAX (proapoptotický člen rodiny Bcl-2; viz apoptóza). Exprese genu CIP1/WAF1 je vázána zejména na hladinu p53, ale je regulována i mechanismy, které nezávisí na aktivitě genu TP53. Jeho produkt protein 21 (p21) se váže k ál elům m a dal řen cyklin-dependentním proteinkinasám a inhibuje jejich aktivitu jak v G1 tak G2 kontrolním

4 bodě. Protein p21 může také tlumit replikaci zpomalm postupu replikační vidlice. Inhibuje katalytickou aktivitu na PCNA závislé DNA-polymerasy delta. Produkt genu GADD 45, protein Gadd 45, podněcuje reparaci excizí (vyštěpm) a to buď přímo a nebo v kooperaci s molekulami PCNA. Gen BAX má významnou úlohu při navoz apoptózy. Inhibice aktivity proteinkinas je vyvolána i produkty dalch tumor-supresorových genů. Například růstový faktor TGF-beta (viz Buněčná signalizace), který je inhibitor proliferace na rozdíl od opačného účinku většiny růstových faktorů, reguluje transkripci tumorsupresorového genu INK4 (Inhibitor Protein Kinase 4). Transkripce genu INK4 má dvě možné varianty a tak vznikají dva typy mrna; jeden pro syntézu proteinu p15 (transkript INK4B) a druhý pro syntézu proteinu p16 (transkript INK4A). Oba proteiny jsou inhibitory Cdks, které se podílejí na průběhu G1 fáze; p15 inhibuje aktivitu Cdk4, zatímco p16 inhibuje Cdk2, Cdk4 a Cdk6. Růstovým faktorem TGF-beta je regulována syntéza i dalch proteinů s inhibičním účinkem na buněčnou proliferaci, ale též s vlivem na terminální diferenciaci některých tkání. Inhibice proliferace buněk je např. také vyvolána nedostatkem růstových faktorů. Specifické kombinace růstových faktorů, pokud jsou přítomny v dostatečném množství, stimulují ve většině případů buňky k proliferaci; výjimečně ji primárně inhibují (viz TGFbeta). Důležitou funkcí růstových faktorů je, kromě stimulace buněčné proliferace, regulace proteosyntézy a buněčného růstu. Tentýž růstový faktor má většinou schopnost regulovat proliferaci i buněčný růst. Neplatí to ale absolutně. Variabilita funkce růstových faktorů je zřejmá i z faktu, že některé řídí diferenciaci buněk v průběhu embryogeneze, jiné se v tomto období neuplatňují. Dále se budeme zabývat dalmi ději, které jsou typické pro jednotlivá období buněčného cyklu. Průběh buněčného cyklu Interfáze Interfáze je období mezi dvěmi mitózami. Jádro je v tomto období ohraničené od cytoplasmy jadernou membránou. Z funkčního hlediska je interfáze členěna na G1, S a G2 fázi. G1 fáze Po ukonč mitózy vstupuje buňka do G1 fáze. G1 fáze má variabilní délku trvání. Některé ál elům m a dal řen buňky (například lymfocyty) setrvávají na počátku interfáze v tzv. klidovém stadiu (Go fázi) a

5 teprve po aktivaci (antigenní podnět) opět pokračují v buněčném cyklu. Jiné, plně diferencované buňky (například neurony) setrvávají trvale v Go fázi a dále se nedělí. V G1 fázi se uplatňuje hlavní kontrolní bod buněčného cyklu (G1 kontrolní bod, viz výše tumor-supresorové geny). V G1 fázi nedochází k syntéze DNA. Interfázní chromosom je v G1 fázi tvořen jen jednou chromatidou obsahující jednu molekulu dvouvláknové DNA. V G1 fázi probíhá syntéza RNA a proteinů, vytváří se zásoba nukleotidů. Zvětšuje se počet ribosomů, mitochondrií, enasmatického retikula. Buňka se zvětšuje. Po G1 fázi následuje S fáze. S fáze S fáze je období DNA syntézy (replikace). Každý chromosom se replikuje (viz Molekulární genetika) a stává se dvouchromatidovým chromosomem. Množství DNA se zdvojnásobí. Syntéza DNA n synchronní pro všechny chromosomy. Synchronně se replikují homologní páry autosomů. Výjimkou jsou chromosomy X. Inaktivovaný X chromosom (viz Genetická kontrola prenatálního vývoje) se replikuje později než jeho aktivní homolog. V S fázi jsou syntetizovány histony. G2 fáze V G2 fázi se každý chromosom skládá ze dvou sesterských chromatid; ze dvou identických molekul DNA. V G2 fázi se uplatňuje G2 kontrolní bod, tzn. kontrola genomu a jeho postreplikační opravy. DNA tvoří komplex s histony. Ke konci G2 fáze začíná kondenzace chromatinu (viz chromosomy lidských somatických buněk). Mitóza Vlastní děl buněk - mitóza je plynulý proces, ale v jejím průběhu je možné odlišit čtyři zásadní fáze. Profáze Chromosomy kondenzují a jsou patrné dlouhé, tenké struktury. Nastává rozpad jadérka. Centrioly se pohybují k protilehlým pólům buňky. Centrioly jsou malé organely, které se během S fáze replikují. V pozdní profázi se rozpadá jaderný obal. Kolem centriol se vytvářejí vlákna dělícího (mitotického) vřeténka, která se v závěru profáze připojují k centromeře, ke kinetochoru (struktura ležící v oblasti centromery). Vlákna jsou mikrotubuly tvořené proteinem tubulinem. ál elům m a dal řen

6 Metafáze V metafázi jsou chromosomy maximálně kondenzované. Aktivní činností dělícího aparátu jsou rozmístěné v ekvatoriální rovině. Sesterské chromatidy se oddělují a zůstávají spojené jen v místě centromery. Anafáze Sesterské chromatidy se oddělují, každá se pohybuje k protilehlému pólu buňky. Od té chvíle se chromatidy chovají nezávislé dceřiné chromosomy. Telofáze Dceřiné chromosomy (chromatidy) jsou seskupeny u protilehlých pólů, mizí mikrotubuly dělícího aparátu, začíná tvorba jaderného obalu. ál elům m a dal řen

7 Cytokineze Chromosomy začínají dekondenzovat. Obnovuje se jadérko. Kolem dceřiných jader je jaderná membrána. Jádro přechází do stádia interfáze. Obrázky převzaty z otevřené encyklopedie Wikipedia Mitóza je mechanismus, který zajišťuje genetickou identitu somatických buněk. Apoptóza Apoptóza, geneticky řízená buněčná smrt. Je to fyziologický proces, který udržuje rovnováhu mezi buněčnou proliferací a smrtí buněk. Geneticky programovanou buněčnou smrtí je regulováno množství buněk tkání během ontogeneze i postnatálního života, uplatňuje se při morfogenezi a podílí se na přirozené obměně buněk v tkáních. Apoptózou jsou odstraňovány nepotřebné, změněné nebo poškozené buňky. U dospělého organismu má apoptóza nezastupitelnou úlohu v tkáních, které prodělávají cyklické změny například vlivem kolísání hladiny hormonů (endometrium, prsní žlázy, prostata) a i ve tkáních, ve kterých dochází k pravidelné obměně buněk (například střevní epithel, lymfocyty). Je nedílnou součástí procesu stárnutí a smrti organismu. Její základní úlohou je udržování homeostázy v tkáních. Průběh apoptózy můžeme rozdělit na tři fáze: 1) signál, kterým je buňka nevratně odsouzena k zániku; 2) kaskáda nitrobuněčných dějů. V buňce jsou aktivovány enzymy kaspasy, dochází k rozpadu cytoskeletu, zániku enzymů nutných pro replikaci a reparaci DNA a k aktivaci endonukleasy, která specificky štěpí DNA mezi nukleosomy (základními strukturními jednotkami eukaryotních chromosomů). Fragmenty DNA mají charakteristickou délkou, přibližně 180 párů bází a násobky této délky. V elektroforetickém gelu, mají typické uspořádání - tzv. apoptotický "žebříček". 3) zanikající buňka se odděluje od sousedních buněk. Rozpadající se buňky jsou formovány do apoptotických tělísek, která jsou odstraňována fagocytózou bez poškoz okolí. Při programované buněčné smrti nedochází k zánětlivé reakci. ál elům m a dal řen

8 Obrázek převzat z otevřené encyklopedie Wikipedia Pochop a následné využití znalostí o regulaci průběhu buněčného cyklu a navoz apoptózy jsou v současné době jednou z priorit molekulární farmakologie, zejména při vývoji léčiv s protinádorovými účinky. V kapitole zabývající se problematikou vzniku maligních nádorů (viz Onkogenetika) vysvětlíme, proč právě cílené zásahy do regulace buněčného cyklu včetně navoz apoptózy jsou v současnosti předmětem výzkumu a vývoje nových protinádorových farmak. Meióza Meióza je typ děl, kdy z diploidních zárodečných buněk vznikají haploidní gamety. Primordiální zárodečné buňky (embryonální buňky, ze kterých gamety vznikají) se začínají diferencovat ve stěně žloutkového vaku. V šestém týdnu embryonálního vývoje z něho migrují do urogenitálních lišt. Podílí se spolu se somatickými buňkami na vzniku primitivní gonády. Primitivní gonády se diferencují v souhlasu s heterochromosomální výbavou na testes (XY) nebo ovaria (XX). Primordiální zárodečné buňky dospějí po řadě mitotických děl do stádia primárních spermatocytů a nebo oocytů. Z nich meiotickým dělm vznikají gamety. Vznik samičích a samčích gamet se li zejména v časovém průběhu. Nejprve se budeme zabývat vlastním meiotickým dělm. Meióza je děl, při kterém je redukován počet chromosomů z diploidního (2n) na haploidní (n). Gamety vznikají po dvou následných dělch; meióze I a meióze II, mezi ál elům m a dal řen kterými je krátká interfáze (interkineze), ale nedochází k replikaci DNA. Pro meiózu I je

9 charakteristické párování homologních chromosomů v profázi I a jejich rozchod v anafázi I. Meióza I je tedy vlastní redukční děl. Meióza II se podobá mitotickému děl. V anafázi II dochází k rozchodu sesterských chromatid k pólům buňky. První meiotické děl (meióza I) Profáze I a její stádia Leptotén - u chromosomů n ještě možné rozlišit jejich sesterské chromatidy. Zygotén - párují se homologní chromosomy a podélně k sobě přiléhají. Jsou spojeny trojvrstevným proteinovým synaptonemálním komplexem, což je specializovaná struktura, která leží mezi vlákny chromatinu. Pachytén - každý chromosomový pár tvoří bivalent s dobře rozlišitelnými všemi čtyřmi chromatidami (tetráda). Mezi chromatidami může docházet k překříž (crossing-overu) a výměnám úseků genetického álu (rekombinacím). Výměnou homologních úseků mezi nesesterskými chromatidami (viz Vazba genů) může u potomků dojít ke změně v postav alel (jiné kombinaci) na homologních chromosomech, než jaké bylo na chromosomech rodiče. Výměna homologních úseků mezi sesterskými chromatidami uspořádání alel neovlivňuje. Diplotén - homologní chromosomy se uvolňují z bivalentu. Sesterské chromatidy stále drží pospolu centromera. Diakineze - chromosomy se maximálně spiralizují (zkracují). Metafáze I Na počátku metafáze I mizí jaderný obal. Tvoří se dělící vřeténko. Párové chromosomy jsou přiřazené k sobě a leží v ekvatoriální rovině. Anafáze I - dvouchromatidové chromosomy jednotlivých homologních párů se pohybují pomocí mikrotubulů dělícího vřeténka k protilehlým pólům buňky. Počet chromosomů je tak redukován na polovinu. Po rozděl má tedy každá buňka haploidní počet chromosomů. Rozchod párových chromosomů je náhodný. Dochází k nezávislé segregaci a kombinaci chromosomů v gametách. Z toho vyplývá, že původně paternální a maternální chromosomy se dostávají do náhodných kombinací. Možný počet kombinací chromosomů v gametách člověka (23 párů) je Telofáze I - pro telofázi I je charakteristické seskup haploidní sady chromosomů v protilehlých pólech buňky. ál elům m a dal řen

10 Cytokineze Po telofázi I se buňka dělí na dvě haploidní dceřiné buňky a vstupuje do interfáze. Při spermatogenezi je cytoplasma rozdělena mezi dceřiné buňky rovnoměrně. Při oogenezi je rozděl cytoplasmy nepravidelné. Jeden produkt děl - sekundární oocyt, získá téměř všechnu cytoplasmu a druhá buňka se stane prvním polárním tělískem. Interfáze (interkineze) Interfáze trvá krátce. Chromosomy jen částečně dekondenzují. Nenastává S fáze. Následující obrázek schematicky znázorňuje průběh prvního meiotického děl. ál elům m a dal řen

11 Profáze I leptotén zygotén pachytén diplotén diakineze Meióza I - metafáze Meióza I - anafáze Druhé meiotické děl (meióza II) Meióza I interkineze (despiralizace) Meióza I - telofáze ál elům m a dal řen

12 Průběh druhého meiotického děl (meioza II) je obdobný děl mitotickému. Vznikají čtyři haploidní buňky (viz následující obrázek). Meióza zajišťuje procesem rekombinací a náhodnou segregací chromosomů maternálního a paternálního původu variabilitu genetického v gametách ve srovnání s genomy rodičů. Profáze II Metafáze II Anafáze II Gamety ál elům m a dal řen

13 V anafázi I i II může dojít k chybám při rozchodu chromosomů k pólům buňky. Během anafáze může též dojít ke ztrátě chromosomu, např. při nesprávné koordinaci napoj vlákna dělícího vřeténka ke kinetochoru. Porucha rozchodu (nondisjunkce) homologních chromosomů v anafázi I nebo chromatid v anafázi II, nebo ztráta chromosomu, je příčinou numerických chromosomálních odchylek (numerických aberací). Gamety se změněným počtem chromosomů mohou být příčinou potratů nebo vzniku vývojových vad (viz Cytogenetika - syndromy podmíněné numerickými odchylkami chromosomů). Následující obrázek znázorňuje disjunkci (rozchod) a nondisjunkci jednoho páru homologních chromosomů v meióze I a v meióze II. Maternální chromosom je zbarven červeně, paternální modře. K nondisjunkci dochází většinou při oogenezi. Anafáze I rozchod homologních chromosomů Nondisjunkce 1. meiotické děl Anafáze II rozchod sesterských chromatid Nondisjunkce 2. meiotické děl ál elům m a dal řen

14 Gametogeneze Spermatogeneze Spermie vznikají v semenných kanálcích testes od počátku pohlavní dospělosti. Kanálky jsou vyplněny spermatogoniemi, které jsou v různých stádiích vývoje. Tyto buňky se vyvinuly po sérii mitóz z primordiálních zárodečných buněk. Poslední typ vývojové řady je primární spermatocyt. Primární spermatocyt prodělává první meiotické děl. Vznikají dva haploidní sekundární spermatocyty. Sekundární spermatocyty ihned přecházejí do druhého meiotického děl. Z každého vznikají dvě spermatidy, které se diferencují (bez dalho děl) do spermií. Oogeneze Oogeneze je na rozdíl od spermatogeneze zahájena před narozm. Vajíčko se vyvíjí z oogonií (buněk kortexu ovaria), které vznikly z primordiálních zárodečných buněk sérií přibližně 30ti mitóz. Každé oogonium je obaleno vrstvou folikulárních buněk. Do třetího měsíce prenatálního vývoje se oogonia postupně diferencují na primární oocyty. Nesynchronně vstupují do profáze meiózy I. V době naroz jsou všechny v profázi I. V profázi I je meiotické děl přerušeno (stadium zvané dictyotén) a oocyty v tomto stádiu setrvávají do sexuální dospělosti. V sexuální dospělosti jednotlivé folikuly dozrávají, nastává ovulace. Oocyt pokračuje v meióze I, rozdělí se na sekundární oocyt s většinou cytoplasmy a organelami a na polární tělísko. Ihned začíná meióza II, která během ovulace dospěje do metafáze. Meióza II je dokončena ze po oplodnění (fertilizaci). Až po fertilizaci je druhé meiotické děl ukončeno, vznikne vajíčko a druhé polární tělísko. Chromosomy vajíčka a spermie vytvoří prvojádra obalená jadernou membránu. Prvojádra fúzují a vznikne diploidní zygota. Chromosomy zygoty se replikují a zygota se následně mitoticky rozdělí na dvě dceřiné buňky. Tím je zahájen embryonální vývoj. ál elům m a dal řen