MORFOLOGICKÉ ZMĚNY U ARTEMIA SALINA PŮSOBENÍM ZÁŘENÍ GAMA MORPHOLOGICAL CHANGES ABOUT ARTEMIA SALINA BY THE EFFECT OF GAMMA RADIATION Dvořák, P.,Beňová, K.*, Kunová, V., Kratochvíl, B., Šalplachta, J. Ústav biochemie, chemie a biofyziky, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno, Palackého 1-3, 612 42 *Katedra životného prostredia, UVL Košice, Komenského 73, 041 81 SOUHRN Směrnice Rady Evropy požadují snížení počtu laboratorních obratlovců v biologických pokusech. Jednou z možností je použití biotestů II. generace mezi které patří i testy na Artemia salina. Dosud publikované testy však hodnotily pouze letalitu v závislosti na dávce, expozici a době přežívání. Tato práce dokladuje možnost sledovat výrazné morfologické změny, které spočívají v retardaci vývoje naupliových stádií v závislosti na dávce záření gama 60 Co. ABSTRACT Direction Council of Europe require restriction of laboratory vertebratea in biological experiments. Once by possibilities is using biological test II. generation among which belongs to and test for Artemia salina. Still this time published test however value only lethality in dependence on dose, exposition and time survival. This work document possibility watch of expressive morphological changes, which consist in retardation development brine shrimps stage in dependence on dose gamma radiation 60 Co. ÚVOD Volba testů vhodných pro sledování nízkých aktivit ionizujícího záření představuje vždy kompromis. Očekávané změny jsou totiž na tak malé úrovni, že mohou být překryty jak vlivy prostředí, tak i intravitální variabilitou. Z tohoto pohledu je tedy třeba požadovat maximální 28
standardizaci a co nejjednodušší model. Zdálo by se, že nejvhodnější jsou studie na subcelulární nebo celulární úrovni (aktivita enzymů, změny na nukleových kyselinách, tkáňové kultury atd.). Zde je totiž možné vytvořit uzavřený systém, případně se přiblížit izolovanému systému, a tím výrazně snížit variabilitu. V poslední době se však právě především v radiobiologii ukázalo, že poznatky získané na celulární nebo i na tkáňové úrovni jsou jen velmi obtížně aplikovatelné na celý organizmus. Ten je vybaven celou řadou kontrolních a reparačních systémů, které výsledný efekt působícího faktoru výrazně ovlivní. S rozvojem přírodních věd a tedy i medicíny úzce souvisí otázka použití zvířat v experimentu. Tomu odpovídá zvýšená spotřeba zvířat v experimentu včetně vzniku legislativy na jejich ochranu. Završením těchto snah bylo schválení Evropské konvence o ochraně obratlovců používaných pro pokusné a jiné vědecké účely v roce 1986, ve které je jedním z hlavních požadavků omezit počet pokusů na zvířatech na minimum. Proto je samozřejmá snaha hledat jiné alternativní testy, využívající bezobratlé živočichy, rostliny nebo tkáňové kultury. Tyto testy jsou využívány převážně ke stanovení akutní popř. subakutní toxicity chemických látek. Testů existuje celá řada, avšak jejich nevýhodou je často metodická náročnost jak na čas, tak i na kvalifikaci personálu, proto jsou většinou neúměrně drahé. Řešením by mohly být alternativní biotesty II. generace, neboli mikrobiotesty, a to především testy na principu Toxkitů, které umožňují vylíhnout testovací organismy do několika desítek hodin před zahájením testu. Tento typ testů je založen na využívání klidových stadií, jako jsou cysty nebo epifia, čímž se vyhneme časově i prostorově náročné kultivaci živých organismů. Calleja a Persone (1992) uvádějí, že předpověď screeningového potenciálu baterie testů (Artemia salina, Streptocephalus proboscideus, Brachionus plicatilis a Brachionus calyciflorus) na orální toxicitu člověka byla nepatrně lepší než údaje z konvenčních testů na potkanech. Tyto výsledky pak byly získány v rámci programu Multicentre evalution of in vitro toxicity (MEIC), kde byla u řady chemických látek hodnocena letalita a toxické efekty, vyjádřené jako hodnoty LC 50/24. V roce 1995 (Dvořák) byl na konferenci v Milenovicích představen 5 denní test na Artemia salina (A. salina), kdy byl pokus ukončen úhynem kontrolních skupin vlivem hladovění. Prodloužit délku života A. salina v prostředí Petriho misek by bylo možné pouze dodáním energie z potravy. Vzhledem k charakteru pokusů je kladen maximální požadavek na standardizaci, čemuž opět nejvíce vyhovuje statický test. Takto představený test však hodnotil pouze jediné kvalitativní kritérium, a to mortalitu. Cílem této práce bylo zjistit, 29
zda ionizující záření způsobuje dobře patrné morfologické změny v průběhu vývoje A.salina, závislé na dávce ionizujícího záření. Artemia salina (Leach 1814)- žábronožka solná, jediný zástupce čeledi Artemiidae, patří mezi žábronožky (Anostraca) (přehledné zobrazení žábronožek uvádí Sládeček a kol.1997), tvořící samostatnou vyhraněnou skupinu korýšů ze třídy lupenonožců (Phyllopoda) s místem výskytu ve slaných kontinentálních vodách (Wohlgemuth 1998). Larvy známé pod označením brine shrimps jsou vhodné pro sledování toxicity, neboť mají vysokou citlivost vůči celé řadě chemických látek i ionizujícímu záření (Dvořák 1999, Dvořák a Beňová 2002). Larvy se líhnou z trvalých vajíček označovaných jako cysty, které jsou v klidovém stadiu (diapauze). Nákup cyst (krmivo akvarijních ryb) umožňuje velmi levně získat několik desítek milionů jedinců vysoké homogenity, na rozdíl od drahých komerčně vyráběných malokapacitních Toxkitů. Důležitým faktorem je také primární čistota cyst a jejich možná kontaminace rizikovými prvky. Mezi faktory přímo ovlivňující líhnutí patří teplota, neustálý pohyb cyst a dostatek kyslíku. METODA A JEJÍ VÝSLEDKY Složení mořské vody (chemikálie čistoty p.a.) je uvedeno v Tab.č. 1. Další podmínky jsou shodné jako bylo uvedeno u pětidenního testu (Dvořák 1995, Dvořák a Beňová 2002 ), kdy se počítání uhynulých A. salina provádí po 24 h intervalech. Tab. č. 1: Složení mořské vody používané k líhnutí a pokusům na Artemia salina Látka Koncentrace (g. l -1 ) NaCl 23,900 MgCl 2. 6H 2 O 10,830 CaCl 2. 6H 2 O 2,250 KCl 0,680 Na 2 SO 4. 10 H 2 O 9,060 NaHCO 3 0,200 30
SrCl 2. 6H 2 O 0,040 KBr 0,099 H 3 BO 3 0,027 Čerstvě vylíhlá (za 24 h při teplotě 25 o C) naupliová stadia Artemia salina byla transportována do průmyslové ozařovny (Bioster Veverská Bitýška). PE lahve o objemu 1000 ml byly naplněny 500 ml mořské vody vody, ve které plavaly A. salina. Z celkem 5 lahví byly 4 ozářeny 60 Co dávkami 0,5; 1; 2 a 4 kgy, pátá představovala kontrolní skupinu. Dávkový příkon 3,3 kgy.h -1. Za 24 h a 96 h po ozáření byly organismy usmrceny formaldehydem a následně mikroskopicky pozorovány morfologické změny. Na obr.č. 1 je schématicky uvedeno, které morfologické změny můžeme u několikadenního naupliového stádia sledovat. Výsledné morfologické změny za 24 h po ozáření ukazuje obr.č.2. V závislosti na dávce si můžeme všimnout změn v délce a tvaru těla, počtu, tvaru a velikosti tykadel, zbarvení těla a podobně. Za 96 h již přežívaly pouze kontrolní skupina a skupina ozářená dávkou 500 Gy. Tento výsledek je v souladu s naší dřívější prací (Dvořák a Beňová 2002). Na obr. 4 (500 Gy 96 h po ozáření) a obr. 3 (kontrola za 96 h po čase ozáření) můžeme sledovat již velmi významné morfologické rozdíly. To dává naději na možnost sledovat tyto změny i při nižších dávkách ionizujícího záření, aniž by bylo nutné dosáhnout LD 50 96 h po expozici. Ta leží v intervalu 600 700 Gy (Dvořák a Beňová 2002), což odpovídá fylogenetickému zařazení Artemia salina. LITERATURA Dvořák, P.,1995: Modifikovaný test s A. salina pro sledování vlivu interakcí cizorodých látek. In Toxicita a biodegradabilita odpadů a látek významných ve vodním prostředí (sborník). Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický a Aqachemie, Milenovice. s. 25-29. Dvořák, P., 1999: Sledování interakcí nízkých expozic ionizujícího záření a cizorodých látek pomocí biotestu s Artemia salina. /habilitační práce/. FVHE VFU Brno 194 s. Dvořák, P., Beňová, K., 2002: An investigation of the interactions of low doses of ionizing radiation and risk factors by means of the Artemia salina biotest. Folia veterinaria 46, 4: 195-197. EU directive of Nov. 24, 1986. on the approximation of legal and administrative regulations of member states concerning protection of animals used for experimental and other scientific purposes 86/609/EWG, 39pp.. 31
Sládeček, V., Sládečková, A., Ambrožová, J. 1997: Thamnocephalus platyurus jako testovací mechanismus. In: Toxicita a biodegradabilita odpadů a látek významných ve vodním prostředí.(sborník referátů). Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický Vodňany a Aquachemie Ostrava, 1997, s.97-99. Wohlgemuth, E. 1998: Žábronožky sladkovodní a mořské. Akvárium terárium 41, č.5, s.20-22. Obr.č.1 Morfologie a vývoj A.salina Obr.č. 2 Naupliová stadia 24 h po ozáření 60 Co, celkové stáří 27 h od vylíhnutí 32
Obr.č.3 Kontrolní skupina (96 h od ozáření pokusných), celkové stáří 99 h od vylíhnutí Obr.č.4 Pokusná skupina 500 Gy 96 h po ozáření 33