Mikrobiologie Mikrobiologie Katedra potravinářských biotechnologií a kvality z.produktů Mikrobiologie míkros bios logos mikroorganismy (mikroby) - pozorování mikroskopem - všudypřítomné (ubikvitární) - velmi rozmanité - původci nemocí (patogenní m.) cca 3 % - většina je nepatogenní řada s významným užitkem pro člověka Význam produkce O 2 (více než 50 %) rozklad org.hmoty, koloběhy prvků mikrobiota lidí, zvířat, rostlin výroba potravin výroba léčiv 1
Nebuněčné formy života a buněčné organismy (pro- a eukaryotické) Nebuněčné formy života Viry, viroidy, priony Není buněčný typ organizace Závislost na živé buňce Onemocnění Viry DNA nebo RNA (= genom viru) obalená bílkovinným pláštěm (kapsidou) = nukleokapsida rozlišení dle NK = DNA a RNA viry dle hostitele na bakteriální (bakteriofágy), rostlinné, hub, živočišné (bezobratlí, obratlovci) submikroskopické nm (= 10-9 m) 2
Viroidy objeveny 1971 Th. Dienerem jednořetězcová RNA bez proteinového pláště (asi 240-360 nukleotidů) nekóduje žádný protein (x viru) lokalizace v jádře h.buňky přenos šťávou, roubováním onemocnění rostlin (zakrslost, deformace listů) dosud 36 viroidů viroid vřetenovitosti hlíz brambor, viroid zakrslosti chmele aj. Priony proteinová částice bez NK postihují nervové buňky změna normálního proteinu (PrP C ) = α-helix v prionový (PrP Sc ) = β- skládaný list rozpustný ve vodě, štěpitelný proteázami nerozpustný ve vodě, není štěpitelný proteázami 3
smrtelné neurodegenerativní choroby u lidí např. kuru, Creutzfeld-Jacob, u zvířat např. scrapie (klusavka), bovinní spongiformní encefalopatie ( nemoc šílených krav ) vzácná on. projevy: ztráta motorických funkcí, změny osobnosti, zmatenost, nespavost, demence NC v oblasti fyziologie a medicíny 1976 Daniel Carleton Gajdusek výzkum kuru 1997 Stanley Prusiner výzkum prionů 4
Veškerý buněčný život na Zemi je zahrnut ve 3 doménách prokaryotické organismy Buněčné organismy Prokaryotické jednobuněčné organismy s jadernou hmotou bez membrány Doména Archaea výskyt v extrémních podmínkách extrémofilové buněčná stěna obsahuje pseudomurein, ale neobsahuje peptidoglykan (murein) Doména Bacteria člení se dle charakteru buněčné stěny grampozitivní, gramnegativní a bez buněčné stěny (mykoplazmata) buněčná stěna obsahuje peptidoglykan Buněčné organismy Eukaryotické jedno nebo více jader s membránou Houby (Fungi) Řasy (Algae) Prvoci (Protozoa) ---------------------------------- (Animalia a Plantae) 5
Některé rozdíly mezi prokaryotickou a eukaryotickou buňkou CHARAKTERISTIKA PROKARYOTA EUKARYOTA BACTERIA ARCHEA Velikost (µm) 0,5-10 0,5-5 10-100 Jaderná membrána ne ano Organely ne ano Vnitřní uspořádání jednoduché složité Buněčná stěna murein pseudomurein variabilní Počet chromozómů 1 kruhový (1 kopie každého genu haploidní) Ribozómy 70 S 80 S více lineárních (2 kopie každého genu diploidní) Stavba bakteriální buňky Leenwenhoekůvmikroskop a jeho nástupci 6
Velikost bakterií 80 x 600 µm v µm rozpětí 0,2 (1x2) - 750 µm Mycoplasma pneumoniae 0,2 µm Escherichia coli 1x2 µm Thiomargarita namibiensis 750 µm Rickettsia prowazeki 0,2 µm Tvarová rozmanitost bakterií Různé způsoby USPOŘÁDÁNÍ bakteriálních buněk diplokok kok streptokok sarcina stafylokok 7
pleomorfní (mnohotvárné) bakterie Proč mají bakterie určitý tvar? fyziologická adaptace Vznik vláknitých forem př. Actinomycesisraelii absence P, cysteinu, glutathionu Tvorba endospor (Bacillus sp.), cyst, heterocyst (Azotobacter sp.) apod. Dimorfismus v životním cyklu Caulobacter crescentus 8
Co chtějí? základy života na Zemi Buněčná stěna bakterií mechanická role - ochrana stálý tvar vyrovnává osmotický tlak antigenní role je místem působení některých antibiotik diagnostická role: barví se Gramovým barvením Organismy v doméně Bacteria se rozlišují: G+ bakterie s buněčnou stěnou G- bakterie s buněčnou stěnou bakterie bez buněčné stěny Hans Christian Gram na konci 19.st. vyvinul barvení, později metoda dle Grama či Gramovo barvení (1853 1938) Teprve v roce 1963 popsal M. R. J. Salton princip tohoto barvení (viz dále) 9
Významnou složkou BS bakterií je peptidoglykan (murein) Základem jsou dva sacharidy N-acetylglukosamin NAG a kyselina N-acetylmuramová NAM propojené beta-1,4 glykosidickými vazbami do vláken ta jsou k sobě spojena pomocí řetízků tetrapeptidů NAM NAG NAM NAG NAM NAG Glykosidické vazby štěpí je lysozym Buněčná stěna GRAMPOZITIVNÍHO typu K. teichoová K. lipoteichoová NAM NAG 90 % BS peptidoglykan (20-80 nm) transmembránový protein Zástupci: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Clostridium, Bacillus aj. Cytoplazmatická membrána Buněčná stěna GRAMNEGATIVNÍHO typu LIPOPOLYSACHARID = LPS porin VNĚJŠÍ membrána biomembrána lipoproteiny NAM 10 % BS peptidoglykan NAG PERIPLAZMATICKÝ PROSTOR (periplasma gelová konzistence) chemoreceptory enzymy Cytoplazmatická membrána 10
na odlišné stavbě a složení BS bakterií je založeno BARVENÍ PODLE GRAMA diferencuje bakterie do dvou skupin G+ a G- LIPOPOLYSACHARID = LPS u G- bakterií Core polysacharid O-antigen VNĚJŠÍ membrána Lipid A pouze u G- bakterií nejprozkoumanější u salmonel Polysacharidová část - antigenní schopnost Lipidová část = lipid A (endotoxin) toxicita G- poutá LPS do vnější membrány LPS patří mezi nejtoxičtější mikr. produkty horečka, ovlivnění bílých krvinek Rozdíly mezi G+ a G- bakteriemi - shrnutí G+ G- barva po obarvení dle Grama Modrá/fialová Červená/růžová peptidoglykanv buněčné stěně Silná vrstva Tenká vrstva teichoováa lipoteichoovákyselinav buněčné stěně + - lipopolysacharidv buněčné stěně - + 11
Bakterie BEZ buněčné stěny přirozeně mykoplazmata nesyntetizují peptidoglykan nejmenší bakterie (0,2 µm) původci onemocnění plic ztráta během života = tzv. L-formy bakterií tj. za normálních okolností BS mají, ale mohou o ni přijít L-formy bakterií (CWD bacteria cell wall-deficient) 1935 Lister institute (Londýn) L pouze bakterie, které za normálních podmínek BS mají a ztratily ji během života (působení různých faktorů) vzhled BS určuje tvar u L-forem odlišný proti původnímu získání L forem možné -in vitro inhibicí syntézy peptidoglykanu (antibiotika) nebo jeho degradace (lysozym) Bacillus subtilis(s BS) Bacillus subtilis L-formy L-formy bakterií (CWD bacteria cell wall-deficient) význam: rezistence k antibiotikům, k imunitnímu systému hostitele (přežívání ve fagocytech) možná příčina chronických či recidivujících chorob? 12
Cytoplazmatická membrána tenká (cca 6-8 nm) bariéra odděluje cytoplazmu od okolí nezbytná selektivní permeabilní bariéra základní struktura dvojvrstva fosfolipidů: hydrofobní (MK) a hydrofilní (glycerolfosfát) složka vnořeny membránové proteiny transportní funkce CM má tekutý charakter V elektronovém mikroskopu: CYTOPLAZMA Hydrofilní oblast Hydrofobní oblast Hydrofilní oblast Cytoplazmatická membrána Hopanoidy specifické lipidové látky v CM někt.zástupců Bacteria zesilují CM adaptace na extrémní podmínky prostředí vysoká t, nízké ph, vysoká koncentrace někt.látek aj. např. uzymomonasmobilis (hopanoidy tvoří až 50 % z lipidů) ochrana před působením vysoké koncentrace etanolu Klíčové funkce CM pro buňku izoluje (hydrofobní zóna), zároveň je propustná ukotvení mnoha významných proteinů (např. enzymy katalyzující bioenergetické reakce) přeměna energie respirační řetězec vzniká zde tzv. protonový gradient H + poháněná síla zajišťuje fungování mnoha na energii závislých činností transport pohyb biosyntéza ATP 13
Povrchové struktury jen u některých nebo jen v určitém prostředí produkce slizových či lepivých látek na buněčném povrchu složení polysacharidy, proteiny pouzdro (kapsula) rigidní, těsně na BS slizová vrstva (slimelayer) deformovatelná, volně připojená Funkce těchto struktur: přilnutí (adheze) k povrchům: patogenní b. průnik formování biofilmu váží vodu zabraňují vyschnutí zásoba některých živin shromažďování odpadních látek ochrana před imunitním systémem ( maskování - obtížné rozpoznání, fagocytóza) zodpovídají za patogenitu (škodlivost) některých bakterií např. pouzdro u Streptococcus pneumoniae Fimbrie a pili vláknité struktury bílkovinného charakteru, vyčnívají z povrchu buňky Fimbrie adheze k povrchu formování pelikul formování biofilmů fimbrie při infekčním procesu využívá např. Salmonella sp. 14
Pili delší většinou 1 výměna genet.materiálu - konjugace (donorová a recipientní bakterie) adheze patogenních bakterií Pili IV typu adheze tzv. twitching motility typ klouzavého pohybu (viz dále) např. u rodu Pseudomonas Biofilm společenství mikroorganismů obalené extracelulární polymerní matrix (tvořeno hlavně z polysacharidů; slizová hmota) tvoří se na povrchu neživých i živých povrchů Pro bakterie zajišťuje: výživu: v matrix kanálky (voda, živiny) ochranu Vznik biofilmu 1. volné (planktonické) bakterie 2. přilnutí k podkladu (dostatek živin) 3. syntéza a uvolňování polysacharidů do prostředí = hlenová matrix - 4. dělení Quorum sensing = způsob komunikace MO v biofilmu - chem.signály (různé molekuly) zjišťují hustotu populace, je-li příliš hustá (5.) část buněk se uvolní a vytvoří biofilm na jiném místě (kolonizace) brání se zhuštění populace 15
Proč bakterie (ale i jiné mikroorganismy) tvoří biofilmy? Odolnost vůči dezinfekčním l., antibiotikům, imunitnímu systému, ph, vyschnutí aj. Mechanismus, jak zůstat ve výhodné oblasti (např. v lidském/zvířecím těle) buňky v biofilmu vyšší metabolická aktivita využití např. při čištění odpadních vod K.K.Jefferson, 2004 Kde se tvoří biofilmy? - méně dostupná místa ve výrobnách (např. v potravinářství) kolena, záhyby, rýhy, těsnění aj. - hrubé povrchy (X hladké povrchy menší adheze) Zubní biofilm je prospěšný umožňuje přilnutí běžným MO dutiny ústní nesmí být přerostlý čištění zubů a omezení sacharidů ve stravě 16
Biofilmy lze i vhodně využít např.: Na povrchu střevní sliznice (i dalších površích) vytváří mikroorganismy biofilmy Nejnovější probiotika 4. generace = biofilmová p. ZDROJ: http://www.pharmabiotech.cz Biofilmové infekce implantáty chirurg.pomůcky oční čočky Antibiofilmové strategie 1. Prevence vzniku biofilmu 2. Odstranění již vytvořeného biofilmu 17
Buněčné inkluze časté Zásoba C při nadbytku syntetizovány zdroj stavebních l., E Zásoba P P často limitující živinou v prostředí tvorba zásob = výhoda k syntéze NK, fosfolipidů, ATP Magnetozómy částice magnetitu (Fe 3 O 4 ) magnetotaxis orientace v magnetickém poli Země Plynové vesikuly u mnoha zástupců Bacteria i Archea vřetenovité útvary počet od několika po několik set/buňku umožňují pohyb ve vodním sloupci udržení na vodní hladině hl. fototrofní org. = optimální intenzita světla (sinice tvorba květů na vodních hladinách) Endospory vegetativní buňka nepříznivé podmínky = = SPORULACE (hodiny) klidová (dormantní) buňka určitý impuls = = GERMINACE (minuty) vegetativní buňka 18
Struktura endospory výrazně odlišná od veget.b. zejména mnoho vrstev a specifické sloučeniny coat(plášť) vrstvy pro sporu specifických proteinů Cortex (kůra) vrstvy peptidoglykanů Exosporium proteinový obal Core ( dřeň ) obaleno buněčnou stěnou, cytoplazm.m., uvnitř cytoplazma, nukleoid atd. naprosto specifická kyselina dipikolinová jen u dormantní b. ve dřeni Vysoký obsah Ca 2+ - tvoří komplex s k.dipikolinovou (chelát) cca 10 % hmoty endospory vazba volné vody = resistence makromolekul inaktivace enzymů Germinace, uvolnění veg.b. vegetativní buňka Zdvojení a rozdělení chromozomu Lýza sporangia, uvolnění spory Buňka rozdělena na sporangium a presporu Dozrání spory Sporangium pohlcuje presporu Vznik kůry a pláště spory Sporangium syntetizuje obalové vrstvy spory Charakteristika spor extrémní odolnost t, ph, UV a jiná záření, vyschnutí, chemické látky Vegetativní buňka - 70 C Spora Clostridium tetani 100 C 90 min Cl.botulinum až 5 hodin Spolehlivá likvidace autoklávování (121 C 2 atm, 20 min) téměř nulový metabolismus vysoká životaschopnost nesnadné barvení 19
Jak dlouho přežívají? spolehlivě se ví několik dekád Některé dokonce i několik tisíciletí věk endospor může limitovat řada faktorů hlavní kosmické záření (kumulativní efekt v čase). mohou však být chráněny.. stovky miliónů let Rozdíly mezi vegetativní a dormantní buňkou charakteristika vegetativní dormantní Obsah vápníku nízký vysoký Dipikolinová kys. - + Enzymatická aktivita vysoká nízká Úroveň respirace vysoká nízká či chybí Syntetická aktivita + - Odolnost k t nízká vysoká Odolnost k záření nízká vysoká Odolnost k chemikáliím nízká vysoká lysozym citlivost rezistence Obsah vody vysoký (80-90 %) nízký (10-25 %) Morfologie bakteriálních spor (tvar, velikost a umístění) terminální (Clostridium paraputrificum) subterminální (Clostridium botulinum) centrální (Clostridium novyi) 20
Pohyb bakterií plaváním a klouzáním Bičík (flagellum, pl. flagella) plavání pomocí rotace ( lodní šroub ) tlačí/táhne buňku tekutým prostředím tenký 15-20 nm vlákno hák motor bičíkusložen z: 1 2 3 1 - Centrální osy 2 - Systému prstenců 3 motorických proteinů 21
Pohyb pomocí bičíku: Bičík = malý rotační motor: Rotor = centrální osa a prstence Stator= motorické proteiny otáčí c.osou a prstenci - - točivý moment na vlákno - - - pohyb Energie protonový gradient protony skrz kanálky v Mot proteinech cca 1000 protonů na rotaci Rychlost pohybu: - bičík nerotuje konstantní rychlostí zvyšuje/snižuje se dle síly proton.gradientu - až 300 otáček/sec - až 60 buněčných délek/sec Klouzavý pohyb bakterií (gliding motility) pohyb po pevném podkladu proti plavání pomalejší a hladší styl rychlost cca 10 µm/sec různé mechanismy tohoto pohybu Př. sinice produkce polysachar.slizu na vnějším povrchu buňky twitching motility pili IV typu opakuje se prodloužení a retrakce pilů táhne bakterii za sebou Mikrobiální taxe Chemotaxe Absence chem.gradientu: náhodný pohyb vpřed ( běh ) a následuje prudké zastavení a změna směru ( kotrmelec, otočka ) - opět náhodný Přítomnost atraktantu (repelentu) cílený pohyb runs jsou delší a zastavení méně časté Bakterie se pohybují ve směru k atraktantu či od repelentu vnímáno řadou membránových proteinů (chemoreceptory) váží chem.l. jakýsi senzorický systém bakterií (analogie se smyslovým vnímáním NS zvířat) 22