COMPARISON OF VOLATILE OIL CONTENT EVALUATION METHODS OF SPICE PLANTS SROVNÁNÍ METOD STANOVENÍ OBSAHU SILICE V KOŘENINOVÝCH ROSTLINÁCH Růžičková G. Ústav pěstování a šlechtění rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail: gruz@mendelu.cz ABSTRACT The spice plants are cultivated for fruits production (achenes) which content a volatile oil as the main substance. One of the main criteria of achenes quality is volatile oil content. Volatile oil content is evaluated by steam distillation methods. The results of the evaluations of one sample in various laboratories are different. The differences range from ten to hundred percents. Within the project of the Ministry of education of the Czech Republic in 2003 Comparison of methods of spice plants quality evaluation the problematic of the steam distillation is solved. The aim of the project is to compare the steam distillation methods, to chose and optimalize of the method for common using in laboratories. The sample of caraway as the model plant was sent to chosen laboratories for the results comparison. Keywords: volatile oil content, quality, steam distillation, spice plants, caraway ABSTRAKT Kořeninové rostliny se pěstují pro produkci plodů dvounažek, které obsahují silici, jejíž obsah je jedním z hlavních a používaných kritérií kvality produkce. Obsah silice se stanovuje většinou destilací s vodní parou podle různých metod. Výsledky stanovení u stejného vzorku v jednotlivých laboratořích se liší. Rozdíly se pohybují od deseti do několika set procent. V rámci projektu Fondu rozvoje vysokých škol pro rok 2003 Srovnání metod stanovení kvality koření se řeší používání destilačních metod stanovení obsahu silice v kořeninových rostlinách. Cílem projektu je srovnat destilační metody stanovení obsahu silice, vybrat a optimalizovat metodu pro obecné použití v laboratořích. Pro srovnání výsledků stanovení byl rozeslán do vybraných laboratoří kontrolní vzorek modelové plodiny - kmínu kořenného (Carum carvi L.). Klíčová slova: obsah silice, kvalita, destilace s vodní parou, kořeninové rostliny, kmín kořenný ÚVOD Kořeninové rostliny řadíme mezi maloobjemové minoritní plodiny. Pěstují se na omezených plochách závislých na potřebách zpracovatelů, kterými podniky potravinářského a farmaceutického průmyslu. Získávané drogy získávané působí jako spasmolytika, sekretolytika 1
a karminativa. Mezi nejdůležitější kořeninové rostliny pěstované v České republice patří kmín kořenný (Carum carvi L.), koriandr setý (Coriandrum sativum L.) a fenykl obecný (Foeniculum vulgare subsp. vulgare Mill.). Kvalita jednotlivých druhů používaných ve farmaceutickém průmyslu se řídí požadavky platného Českého lékopisu 2002, zatímco pro potravinářský průmysl obsah silice specifikuje vyhláška č. 331/1997 Sb. ve znění vyhlášky č. 419/2000 Sb. zákona č. 110/1997 Sb. O potravinách a tabákových výrobcích po úpravě zákonem č. 306/2000 Sb. Z toho vyplývá, že podnik zabývající se farmaceutickou výrobou by se měl řídit výhradně požadavky lékopisu a metodami v něm uvedenými, stejně tak potravinářský provoz se řídí doporučeními zákona o potravinách. Jednotlivé podniky si kontrolují kvalitu suroviny, kterou odebírají od obchodníků nebo prvovýrobců. Využívají kapacity jak vlastních, tak ostatních laboratoří. Tyto laboratoře by měly být akreditovány a měly by používat jen akreditované metody zkoušení. V rámci optimalizace sítě laboratoří dozorových orgánů se všechny analytické postupy kontrolují a posuzuje se jejich vhodnost k danému stanovení. Při ověřování metod může dojít k určitým úpravám doposud používaného postupu. Tím vznikají další změny, například ve výtěžnosti, reprodukovatelnosti apod. Po jakékoliv úpravě se zkušební metoda musí znovu akreditovat, jinak ji kontrolní laboratoř nemůže používat. Ze zkušenosti víme, že se tomu tak neděje. Výsledky stanovení u stejného vzorku v jednotlivých laboratořích se liší. Rozdíly se pohybují od deseti do několika set procent, což má vliv na rozhodování při obchodních jednáních a vyvstává zde otázka zda vůbec produkce dodaná prvovýrobcem nebo obchodníkem vyhovuje požadavkům na kvalitu. V rámci projektu Fondu rozvoje vysokých škol pro rok 2003 Srovnání metod stanovení kvality koření se řeší používání destilačních metod stanovení obsahu silice v kořeninových rostlinách. Cílem tohoto projektu je srovnat destilační metody stanovení obsahu silice, pomocí vhodného statistického hodnocení najít metodu, která poskytuje nejpravděpodobnější výsledky, tj. přibližně stále stejné, metodu optimalizovat pro obecné použití v laboratořích a po skončení projektu ji doporučit k zapracování do předpisů v potravinářském a farmaceutickém sektoru. METODIKA Pro srovnání výsledků stanovení byl rozeslán do vybraných laboratoří kontrolní vzorek. Jako modelová plodina byl zvolen kmín kořenný (Carum carvi L.) jako tradiční a nejvíce pěstovaná kořeninová rostlina v České republice. Byly osloveny laboratoře farmaceutických a potravinářských podniků, státních institucí, univerzit a ostatní laboratoře v České republice, jejichž služeb některé organizace využívají. Jedno pracoviště se nachází ve Slovenské republice (Tab. 1). Dále byla podrobnější stanovení prováděna na Ústavu pěstování a šlechtění rostlin. 2
Vzorek byl zajištěn v zemědělském podniku zabývajícím se dlouhodobě pěstováním kmínu kořenného. Pochází ze sklizně roku 2002. Každému pracovišti byl vzorek zaslán v množství cca 200 g, balený v papírovém obalu a dalším ochranném obalu. Na vyžádání byl vzorek zaslán v plastovém obalu. Se vzorkem byl zaslán dotazník, který blíže charakterizuje použitou metodu stanovení v jednotlivých krocích: metoda, mletí/nemletí vzorku, typ použitého mlýnku, přibližná velikost částic, typ destilačního přístroje, způsob zahřívání, kalibrace přístroje, přídavek chemikálií, ukončení destilace a odečet objemu. Tab. 1: Pracoviště účastnící se porovnávání výsledku pořadové číslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Pracoviště Ústav pěstování a šlechtění rostlin AF MZLU v Brně Ústav chemie a biochemie AF MZLU v Brně ÚKZÚZ, laboratorní odbor Brno LEROS, s r. o. Praha MEGAFYT-R, s. r. o. Praha Benkor, s. r. o. Mělnická Vrutice První Jílovská, divize EXAR Jílové u Prahy VÚRV Genová banka Olomouc Ústav zelinářství a květinářství ZF MZLU v Brně MVDr. Pavel Mikuláš laboratoř potravin Brno Katedra farmakognosie FF UK Hradec Králové Katedra ekológie, fak. humanitných a prírodných vied Prešovská univerzita, Prešov, Slovenská republika EKOCENTRUM laboratoř Ostrava ANALAB Praha, spol. s. r. o. Praha používaná metoda (destilace s vodní parou) v normě ČsL 4 ČSN 58 0110 metodiky ÚKZÚZ ČsL 4, ČL 1997 ČL 2002 ČsL 4 podniková metodika ČsL 4 ČsL 4, ČL 1997 ČSN 58 0110 ČL 2002 ČSN 58 0515 laboratoř nedodala výsledky laboratoř nedodala výsledky Tab. 2: Metody stanovení obsahu silice destilace s vodní parou označení normy Československý lékopis 4, 1987 ČsL 4 Díl I., Zkoušení drog čl. 4.6.15. Stanovení silic ČL 1997 norma, struktura platnost použití Český lékopis 1997 Díl I., Farmakognostické metody čl. 2.8.12. Stanovení silic v rostlinných drogách neplatná nahrazený článek v ČL 2002, totožný postup farmacie farmacie 3
ČL 2002 ČSN 58 0110 ČSN ISO 6571 Český lékopis 2002 Díl I., Farmakognostické metody čl. 2.8.12. Stanovení silic v rostlinných drogách Zkoušení koření, 1964 39. 42. Silice, destilace vodní parou (odměrná) orientační metoda Koření, kořenící látky a byliny Stanovení obsahu těkavých olejů (silic), 1995 platná nahrazený článek v ČSN ISO 6571 platná farmacie potravinářství potravinářství žádná z oslovených lab. ji nepoužila Tab. 3: Závazné postupy pro farmaceutický a potravinářský průmysl Obor předpis metoda farmacie ČL 2002 destilace vodní parou, přídavek xylenu, upřesnění v jednotlivých článcích pro drogy Zákon doporučuje použití metod zkoušení uvedených v technických potravinářství zákon č. 419/2000 Sb. normách (ČSN ISO 6571) a metody, které jsou použitelné stejným způsobem pro různé skupiny komodit. Pokud jsou pro jednotlivé metody zkoušení uvedeny alternativní postupy, může být vzorek analyzován kterýmkoliv z těchto postupů. VÝSLEDKY Výsledky budou zpracovány do tabulek a zhodnoceny statistickými metodami založenými na testování hypotéz o náhodných výběrech. Prostřednictvím hodnocení budeme chtít zodpovědět otázku, která metoda dává nejpravděpodobnější, tj. stále podobné výsledky stanovení a kterou bude možné doporučit pro obecné použití v laboratořích. Jedná se o maximální vyloučení chyb způsobených subjektivní prací operátora, použitím rozdílných přístrojů na homogenizaci vzorku a subjektivním odečítáním objemu nadestilované kapaliny. Výsledky měření obsahu silice v kmínu se dají považovat za vícerozměrný náhodný výběr. Měření byla prováděna nezávisle na sobě, a to jak nezávisle na firmách, tak i na metodách. V případě, že variabilita je způsobena především měřicí chybou, mívá náhodná veličina normální rozdělení. Dostáváme tedy vícerozměrný náhodný výběr, kde se jednotlivé třídy výsledků (rozdělení např. podle laboratoře, metody nebo navážky) řídí normálním rozdělením, obecně s různými parametry. Samotné základní statistické charakteristiky nedokáží zodpovědět otázky kladené při hodnocení metod. Pomocí testových statistik tak můžeme testovat hypotézy o parametrech normálního rozdělení v jednotlivých skupinách. V této práci se použijí zejména testy o shodě středních hodnot a o shodě rozptylů mezi dvěma skupinami pozorování. Bude se pracovat s tzv. rizikem 4
alfa, typicky rovným 10 %, 5 % nebo 1 %. Toto riziko určuje pravděpodobnost, s jakou zamítneme hypotézu, i když je reálně pravdivá. Postup 1. Vyloučit extrémní výsledky (hypotéza, že firmy dávají stejné výsledky) 2. Testovat závislost výsledků na úrovních parametrů stanovení (na mletí, navážce atd.) 3. Testovat míru variability mezi výsledky daných úrovních parametrů stanovení Pro hodnocení výsledků mezi jednotlivými laboratořemi budou pokusně použity způsoby stanovení hodnot přesnosti dle přílohy 2 k vyhlášce č. 339/2001 Sb. Způsob stanovení hodnot přesnosti zákona o potravinách. Nejčastěji používané hodnoty přesnosti: 1) R = mez reprodukovatelnosti, hodnota u níž lze předpokládat, že s pravděpodobností 95 % bude pod ní ležet nebo jí bude rovna absolutní hodnota rozdílu mezi dvěma výsledky zkoušek získanými za podmínek reprodukovatelnosti (tj. stejný materiál ze zúčastněných laboratoří, použití stejné zkušební metody), R = 2,8 x s R 2) S R = směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, vypočítá se z výsledků získaných za podmínek reprodukovatelnosti 3) RSD R = relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti, vypočítá se z výsledků získaných za podmínek reprodukovatelnosti, RSD R = [(s r /X) x 100] POUŽITÁ LITERATURA Alterová, L., 2003: Unie sází na bezpečnost. Zemědělec, 41/2003. s. 4. Česká potravinová legislativa. Soubor právních předpisů ve znění změnových předpisů. 1. část,. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 2000. Česká norma, 1995: ČSN ISO 6571 Koření, kořenící látky a byliny. Stanovení obsahu těkavých olejů (silic). Český normalizační institut, Praha. Československá státní norma, 1964: ČSN 58 0110 Metody zkoušení koření. Stanovení silic. ÚNM, Praha. Československý lékopis IV., Léčivé a pomocné látky. SZN, Praha, 1987. Český lékopis 1997, 1. Díl, Obecná část. Grada Publishing, s. r. o. Praha, 1997. s. 276-278. Český lékopis 2002, 1. Díl, Evropská část 1., Grada Publishing, a. s. Praha, 2002. s. 388-390. Hay, K., Waterman, P. G., 1993: Volatile Oil Crops: their biology, biochemistry and production. Longman Scientific Technical. Harlow, England. Kocourková, B., Sedláková, J., Lojková, L., Růžičková, G., 2001: Obsah silice rozhodující kritérium pro jakost koření pěstovaného v České republice (Carum carvi L., Coriandrum 5
sativum L.). Sborník referátů z konference s mezinárodní účastí Aktuální poznatky v oblasti jakosti zemědělské a potravinářské produkce, Brno, 7. 8. 11. 2001. s. 93-98. Novotný, F., 2000: Metodiky chemických rozborů pro hodnocení kvality odrůd. III. díl, Jednotné pracovní postupy. Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský v Brně. Quality control methods for medicinal plant materials. World Health Organisation. Geneva, 1998. p. 34-37. Růžičková, G., Kocourková, B., 2003: Quality of the spice plants cultivated in the Czech Republic. Proceedings of Scientific Conference with International Participation Sustainable Agriculture and Rural Development, SPU Nitra, 25. 26. 9. 2003. p. 493. Sedláková, J., 2003: Vliv vnějších faktorů na obsah silic v rostlinách. Disertační práce, MZLU v Brně, Brno. Sedláková, J., Kocourková, B., Kubáň, V., 2001: Determination of Essential Oil Content and Composition in Caraway (Carum carvi L.). Czech Journal of Food Sciences, 19 (1): 31-36. Tomko, J. et al., 1999: Farmakognózia. Osveta, Martin. Úplné znění zákona č. 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích po úpravě zákonem č. 306/2000 Sb. Praktická příručka. Agrospoj, Praha, 2001. Vyhláška č. 339/2001 Sb. o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků za účelem zjišťování jakosti a zdravotní nezávadnosti potravin nebo surovin určených k jejich výrobě a jakosti tabákových výrobků. 6