Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Reprodukční cyklus feny Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Petr Řezáč, CSc. Vypracovala: Hana Pěčková Brno 2013
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Reprodukční cyklus feny vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MENDELU v Brně. Dne.. Podpis bakaláře...
PODĚKOVÁNÍ Ráda bych velmi poděkovala vedoucímu své bakalářské práce doc. Ing. Petru Řezáčovi, CSc. za odborné vedení, čas, který mi věnoval, a za rady při zpracování bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat rodině a přátelům za podporu během studia.
ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá shrnutím poznatků o reprodukčním cyklu fen. Endokrinní posloupnost v cyklu fen není odlišná od mnoha jiných savců, včetně výběru ovulačního folikulu zvýšeným pulzačním vylučováním LH, výskytu říjového chování a v jeho průběhu vzestupu estrogenů a poklesu progesteronu, výrazné preovulační luteinizaci a luteotropních funkcí LH a prolaktinu. Důležité je rozpoznání reprodukčních dysfunkcí, jako například dělené říje a nedostatečné luteální fáze. Mohou se také objevit abnormality pohlavního vývoje, které v mnoha případech způsobují neplodnost a chovatelé by měli být informováni o genetických důsledcích těchto poruch. Proto se v případě výskytu abnormalit pohlavního vývoje doporučuje kastrace zvířat. Klíčová slova: fena, říje, LH, progesteron, estrogeny ABSTRACT The bachelor thesis deals with a summary of knowledge about reproductive cycle of the bitches. Endocrine cycle in bitches is not different from many other mammals, including the selection of ovulatory follicle by increased LH pulsation, the occurrence of estrus behavior, increase estrogens and fall progesterone, significant preovulatory luteinisation and luteotrophic function of LH and prolactin. Important is the recognition of reproductive dysfunction, such as split heat, insufficient luteal phase etc. Abnormalities of sexual development may cause infertility and breeders should be aware of the implications of genetic disorders. Therefore, in the case of abnormalities of sexual development is recommended dog neutering. Key words: bitch, estrus, LH, progesterone, estrogens
OBSAH 1 ÚVOD... 7 2 CÍL PRÁCE... 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1 ENDOKRINOLOGIE FOLIKULÁRNÍ A LUTEÁLNÍ FÁZE ZMĚN NA VAJEČNÍCÍCH... 10 3.1.1 Proestrus... 11 3.1.2 Estrus... 12 3.1.3 Metestrus (diestrus), anestrus... 13 3.1.4 Plodnost psů... 14 3.1.4.1 Folikulární fáze... 14 3.1.4.2 Ovulace... 15 3.1.4.1 Periovulační endokrinologie a preovulační vlna LH... 16 3.1.4.2 Luteální fáze a sekrece progesteronu... 18 3.1.4.3 Luteotropiny... 19 3.1.4.4 Progesteron... 20 3.1.4.5 Březost... 20 3.1.4.6 Vývoj mléčné žlázy a pseudogravidita... 21 3.2 NEOBVYKLÉ A ABNORMÁLNÍ CYKLY, PŘÍČINY NEPLODNOSTI FEN... 22 3.2.1 Anovulace... 22 3.2.2 Pomalý růst koncentrací preovulačního progesteronu... 23 3.2.3 Prodloužený meziříjový interval (déle než 10 měsíců)... 24 3.2.3.1 Tichá říje... 24 3.2.4 Krátký meziříjový interval (méně než 4 měsíce)... 24 3.2.4.1 Spontánní krátký meziříjový interval... 25 3.2.4.2 Dělená říje... 25 3.2.5 Nedostatečná luteální fáze... 26 3.2.6 Prodloužený proestrus a říje... 26 3.2.7 Perzistentní říje... 27 3.2.8 Abnormality pohlavního vývoje... 28 4 ZÁVĚR... 29 5 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY... 30
1 ÚVOD Pes domácí (Canis lupus familiaris) je jedno z nejdéle domestikovaných zvířat. Psi hrají v lidském životě odedávna velmi důležitou úlohu. Dříve byli využíváni jak v kulturním, tak i v hospodářském směru. Dnes mají psi úlohu spíše společenskou a sportovní, ale i tak se některá plemena využívají jako pracovní, ať už pro náročnou nebo nenáročnou práci. Sportovní využití psů se stává velmi populárním u mladých i starších lidí. Kynologické sporty upevňují vztah mezi psem a jeho pánem a také velmi zlepšují vzájemnou komunikaci. Hlavní činností v tomto směru je v poslední době agility, které se stává čím dál populárnější. Agility je sport, ve kterém pes překonává překážkovou dráhu. Velmi podobný agility je cross, kdy v přírodních podmínkách běží se psem i psovod a překonávají přírodní i umělé překážky společně. Populární je také dog dancing neboli tanec se psem, mushing (závody psích spřežení) a spousta dalších sportů. Je velmi podstatné ze sportu udělat zábavu pro psa a také například u mushingu si uvědomit, že je určen pouze pro některá plemena. Psi jsou dnes také využíváni pracovně pro záchranářskou činnost (vyhledávání lidí při různých živelných katastrofách). Dále jako služební psi (vyhledávání drog, výbušnin či zadržení pachatelů), lovečtí psi (zahrnují ohaře, barváře, honiče, slídiče a norníky), pastevečtí psi (hlídání a nahánění skotu, koní či ovcí), laboratorní psi. Neméně se uplatňují vodící psi či psi využívaní pro canisterapii, kteří musí být klidní, bez negativní zpětné reakce na rušivé či neznámé podněty. Všichni pracovní psi musí být perfektně vycvičeni a musí mít ideální vlastnosti pro práci, kterou budou vykonávat. I přesto, že jsou psi dnes v největší míře využíváni jako společenská zvířata, je důležitá i jejich reprodukce. Reprodukce je podstatná především z chovatelského hlediska u čistokrevných plemen, kdy je důležité znát zdravotní stav a původ feny i psa, abychom mohli daný typ plemene rozmnožovat bez výskytu nežádoucích vlastností u potomstva. Při výskytu nových dědičných zdravotních problémů jsme vyřazením jedince z chovu schopni zajistit, aby se tyto problémy nerozšiřovaly. Samozřejmě reprodukcí se nám přenáší i vlastnosti, které chceme v chovu mít a které jsou například pro pracovní využití psa podstatné. ~ 7 ~
Různé fáze reprodukčního cyklu i samotnou možnost reprodukce můžeme ovlivňovat použitím hormonů a dalších látek. Můžeme jimi zamezit i samotné ovulaci či březosti. Pokud samice nemá určitých hormonů ve správné době dostatek, nemusí i bez našeho zásahu a vědomí k ovulaci vůbec dojít, nebo může zabřeznout, ale z důvodu například poklesu hladiny progesteronu po dobu březosti nastane abort. Bohužel s reprodukcí a s ní spojenými pochody v těle souvisí i rizika různých nemocí či dysfunkcí, které mohou být příčinou neplodnosti a mohou někdy vést až k nezbytnosti odstranění dělohy. Proto je nutné se psem navštěvovat veterináře a každý možný symptom s ním řešit. Hlavní úlohou reprodukce samců i samic je však předávání jejich genetických dispozic na potomstvo a tím i zachování druhu, čehož v dnešní době člověk umí velice dobře využít a vyšlechtit si zvíře tzv. na míru. ~ 8 ~
2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo formou literárního přehledu shrnout dosavadní poznatky o vývoji folikulů, ovulaci a vývoji žlutých tělísek na vaječnících fen. ~ 9 ~
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Endokrinologie folikulární a luteální fáze změn na vaječnících Analýza steroidů vyvinutá pro skot a člověka byla upravena pro sérum a plazmu psů použitím extrakce vzorku nebo přímou analýzou vzorků ovariektomovaných zvířat pro kontrolu nespecifických vlivů. Luteinizační hormon (LH), folikuly stimulující hormon (FSH) a prolaktin jsou analyzovány použitím, buď heterologních analýz založených na antiséru hormonů přežvýkavců nebo hlodavců, nebo homologických analýz s vyčištěným hormonem psů používaným jako standardu. Ovulace nastává jako odezva na nárůst gonadotropinů představovaný 1-3 denním zvýšením hladiny LH a 1-4 denním zvýšením hladiny FSH. K ovulaci dochází asi 48-60 hod. po nárůstu LH. U fen, na rozdíl od většiny ostatních savců, dochází jako u lišky asi 2 dny po ovulaci k dozrání oocytů v distální části vejcovodu. U lidí a mnoha hlodavců je preovulační zvýšení produkce folikulárního progesteronu doprovázeno růstem periferního progesteronu užitečného pro načasování ovulace, což je u fen podobné. Rovněž feny, jako mnoho hlodavců, potřebují navíc k LH jako luteotropinu i prolaktin. Feny nemají žádný akutní luteolytický mechanismus a hysterektomie nemá žádný vliv na funkci žlutého tělíska (Olson et al., 1984). Příliš dlouhá luteální fáze má za následek detekovatelné zvětšení mléčné žlázy, která v poměru k velikosti feny může mít za následek v klinickém stavu zjevnou pseudograviditu, charakterizovanou velkým zvětšením mléčné žlázy doprovázeným laktogenezí a laktopoezou. Březost je charakterizována zvýšenou sekrecí progesteronu, která je ovlivněna s březostí spojenou zvýšenou hladinou prolaktinu po implantaci embrya, snad v odpovědi na zvýšenou hladinu relaxinu. Porod nastupuje v reakci na náhlý vzestup hladiny prostaglandinu F2α (PGF 2α ), který má luteolytické účinky, těsně před porodem (Concannon, 2011). ~ 10 ~
3.1.1 Proestrus Proestrus začíná, když jsou patrné první vnější příznaky zvyšující se estrogenizace jako je otok (edém) vulvy, obvykle doprovázený serózním výtokem z vulvy. Proestrus trvá průměrně 9 dní a je charakterizován progresivním nárůstem velikosti a napětím vulvy, proliferací vaginálního epitelu, rohovatěním a edémem, počtem epitelových buněk ve výtěru z vagíny a vaginální sekrecí feromonů vábících samce. Profily epitelových buněk při výtěru z vagíny se mění od stavu, kdy dominují parabazální buňky (doprovázené proměnlivým počtem neutrofilů) až po stav, kdy postupně dominují malé intermediární ploché buňky, velké intermediární buňky, a poté velké zrohovatělé buňky, až nakonec tvoří téměř 98-100 % zrohovatělé buňky a v podstatě chybí neutrofily, které neprocházejí zesíleným epitelem. Vrchol rohovatění se vyskytuje 1-6 dnů před vlnou LH. Krvavý výtok zahrnuje serózní tekutinu obsahující nedotčené a lýzované erytrocyty a jejich hemoglobin. Krvinky pronikají do dělohy procesem, který se nazývá diapedéza (tj. pronikání krvinek stěnou neporušené cévy do mezibuněčného prostoru). Nebyly zjištěny žádné charakteristické změny v jejich počtu či vzhledu. Vaginoskopicky se sliznice jeví edematózní, mění se progresivně z narůžovělé na bílou, s vně patrným krvavým výtokem a má prohloubené vaginální záhyby, které se stávají výraznějšími v obou osách, a které mají vzhled hladkých dlažebních kostek (Jeffcoate and Lindsay, 1989). Samčí přitažlivost zahrnuje sekreci feromonů. Metyl p-hydroxylbenzoát z vaginálního sekretu říjných fen byl identifikován jako sexuální atraktant. Jeho malé množství aplikované na ochod feny navozuje u samců vzrušení. Studie s malým mikrogramovým množstvím musely být přerušeny z důvodu nadměrné reakce kolonie psů. Hladina estradiolu se zvyšuje z přibližně 20-55 až na maximum 150-450 pmol/l (s průměrem 255 pmol/l). Proestrus končí se začátkem receptivního chování, které se obvykle objevuje 0,5-3 dny po dosažení maximální hladiny estradiolu a v době preovulační vlny LH. Z endokrinologického hlediska fyziologický proestrus končí s preovulační vlnou LH (Concannon, 2011). ~ 11 ~
3.1.2 Estrus Říjové chování je charakterizováno aktivní ochotou k páření při naskakování samce na fenu a zvýšenou vyhledávací aktivitou samců. Trvání říje vykazuje variabilitu, slábne pomalu nebo rychle po 5.-10. dnu od nástupu začátku říje (průměr 9 dnů), ale může přetrvávat dlouho po 8. dnu, kdy končí plodné období. Klinicky definováno říje trvá až do doby, kdy poševní epitel již nedosahuje maximálního rohovatění, ale spíše dochází k rozsáhlému odlupování epitelových buněk, jehož následkem dochází k odkrytí v epitelu hlouběji uložených nezrohovatělých buněk, ke ztenčování epitelu a k migraci neutrofilů do poševní dutiny. Tyto změny se obvykle vyskytují 6-11 dnů (v průměru 8 dní) po preovulační vlně LH. Fyziologický začátek říje nemá zřetelné cytologické korelace, ale anatomicky jej odráží počátek tvoření záhybů a vroubkování endoskopicky viditelné vaginální sliznice ± jeden den od preovulační vlny LH, jako odezva na prudký pokles poměru estrogenů ku progesteronu. Maximální vroubkování se vyskytuje 4.-5. den. V některých případech se v průběhu plodného říjového cyklu s normálním endokrinním profilem může vyskytovat začátek říjového chování již 2 dny před preovulační vlnou LH anebo až za 6 dní po preovulační vlně LH nebo vůbec nenastane. Nedostavení se říje bylo zdokumentováno v plodných říjových cyklech pomocí správně načasované inseminace, jež měla za následek graviditu. Určitá proměnlivost v počátku nebo výskytu říjového chování v rámci nebo mezi fenami zahrnuje proměnlivost v reakcích na odlišné samce, v chování hodnoceném v nepřítomnosti versus přítomnosti samců, a v určení začátku říje ovlivněném receptivními reflexy, reflexem nehybnosti, zasunutí pyje a první ejakulační kopulací nebo kopulačním svázáním, které se v některých případech všechny vyskytují v jednom dni a v jiných případech se vyskytují kompletně nebo nekompletně v posloupnosti během několika dní. Estradiol pokračuje v poklesu od maximální hodnoty na konci proestru do úrovně středních hodnot kolem 40-90 pmol/l. Hladina progesteronu se prudce zvyšuje nad 3-6 nmol/l během preovulační vlny LH, a ihned (nebo po 1-3 denní pauze) se opět prudce zvyšuje a dosahuje asi 30-80 nmol/l 10. den cyklu, tj. na konci nebo krátce po skončení říje. Říje se u fen objevuje v reakci na pokles estradiolu, který normálně začíná krátce před preovulační vlnou LH a pokračuje během říje. Začátek říje je usnadněný synergistickým působením rychle narůstající hladiny progesteronu indukované preovulační vlnou LH. Při objektivním hodnocení říjového chování vyvolaného podáním exogenních estrogenů fenám ~ 12 ~
kastrovaným za účelem odstranění endogenních ovariálních estrogenů, bylo zjištěno, že říje je mnohem intenzivnější, rychlejší a zesynchronizovaná, když byl v době odnětí endogenních ovariálních estrogenů podáván progesteron (Concannon et al., 1979). 3.1.3 Metestrus (diestrus), anestrus Metestrus, poříjová část luteální fáze, byla původně definována jako chování, které nastupuje, když končí říjové chování. Použitím morfologických kritérií, metestrus začíná, když je v 6.-11. dni poprvé zaznamenán metestrální vaginální stěr nebo je poprvé detekována metestrální vaginální sliznice. Metestrus trvá, dokud nejsou příznaky luteální fáze zanedbatelné. Konec metestru a začátek anestru jsou definovány různě, jednak jako prodělávání histologické obnovy endometria, dále jako ústup zvětšení mléčné žlázy a v posledních letech jako pokles hladiny progesteronu pod asi 3-6 nmol/l. Hladina progesteronu se zvyšuje na maximum 50-250 nmol/l mezi 20. a 35. dnem cyklu, poté pomalu klesá a dostává se pod asi 3 nmol/l mezi 55.-90. dnem (v průměru 70. dnem). Hladina estradiolu je proměnlivá při středních hodnotách 50-110 pmol/l s profily odpovídajícími tomuto progesteronu, vyšší ve střední luteální fázi a pak klesající. Název diestrus je používán v některých veterinárních textech jako náhražka a synonymum pro metestrus u fen. Použitím diestrus napříč druhy ve vazbě na období luteální funkce se vyhýbají možné mylné představě, že se metestrus možná týká jen krátké periody po estru, jako v popisu cyklu u sudokopytníků a hlodavců (Concannon, 2011). Anestrus u psa (Okkens a Kooistra, 2006) zahrnuje nepřítomnost známek aktivity na vaječnících a závazně se vyskytuje minimálně 7 týdnů po poklesu hladiny progesteronu pod 1-2 ng/ml, průměrně trvá 18-20 týdnů. To je možná důležité pro normální obnovu endometria, která je kompletní za 120-130 dní. Apoptický index a procento degenerovaných epiteliálních buněk endometria jsou vysoké během střední luteální fáze a nízké v raném anestru a nepřítomné za 120 dní (Chu et al., 2002). Vaginální cytologie ukazuje malý výskyt parabasálních buněk (a degenerované ploché buňky) a proměnlivé, ale skromné počty neutrofilů. Vaginální sliznice se jeví jako tenká a červená s viditelnými kapilárami; povrch je lehce traumatizován a vaginální cytologie je obtížně sledovatelná bez krvácení s rušivými erytrocyty ve výtěru. Hladina estradiolu je uváděna jako variabilní, ale obvykle nízká 15-35 pmol/l. Bazální hladina LH je nízká (pod 1-2 ng/ml), s proměnlivou výškou a často velkými pulzy (3-30 ng/ml) ~ 13 ~
v intervalech 7-18 hod. nebo delších. FSH je vysoké (50-400 ng/ml, průměrně 140) mezi sporadickými pulsy mírně zvýšenými nad bazální hladinu, které když jsou detekovatelné, jsou typickým průvodním jevem s LH pulzy. Hladina progesteronu zůstává pod 4 nmol/l, s nejnižší hodnotou přibližně 1500 pmol/l 30-40 dní před proestrem (Concannon et al., 1993). 3.1.4 Plodnost psů Jak bylo experimentálně potvrzeno, primární oocyty jsou ovulovány 48-60 hod po preovulační vlně LH, následně prodělávají zrání 96-108 hod. v distálním úseku vejcovodu a sekundární oocyty zůstávají životaschopné po dalších 24-48 hod. (5.-6. den) u většiny fen, 72-96 hod. u některých fen (7.-8. den), a 120-144 hod. (9.-10. den) v extrémních případech. Plodnost po jednom krytí je maximální od preovulační vlny LH (0. den) do 5. dne a rychle slábne během dalších 3 dnů, částečně kvůli cervikálnímu uzávěru v 7.-8. den. Procento zabřeznutí po nitroděložní inseminaci 9.-10. den po preovulační vlně LH je v průměru 60 % (Tsutsui et al., 2009) oproti zabřezávání nižšímu než 10 % při vaginální inseminaci. Oplozené vajíčko se 21. den uhnízdí a dále se vyvíjí. Porod nastává 65 ± 1 den po preovulační vlně LH, nejdříve 55 dní a nejpozději 68 dní po krytí (Concannon et al., 2001a,b). Psí sperma přežívá v děloze do 7 dní. Inseminace spermatem se špatnou kvalitou nebo zmraženým spermatem je nejvíce úspěšná, když je provedena 5. den nebo 6. den po preovulační vlně LH, tj. po dozrání oocytů. Psí oocyty jsou čistě bílé, obsahují lipidy s větší densitou než prasečí, a lipidy nemohou být centrifugovány na periferii; ale zrání oocytů in vivo je používáno pro klonování samců a samic psů pomocí přenosu jádra z tělních buněk (Hong et al., 2009). Normální velikost vrhu se pohybuje v rozmezí 2-16 štěňat, v průměru kolem 7 štěňat, průměr mezi plemeny kolísá od 5 do 8 štěňat a má pozitivní korelaci s velikostí plemene. 3.1.4.1 Folikulární fáze Folikulární fáze představuje skupinu 2-8 folikulů detekovatelných na vaječníku jako viditelné 3 mm velké měchýřkovité folikuly 6-10 dní před preovulační vlnou LH, které však nevyčnívají nad povrch vaječníku, a je charakterizována vylučováním dostatečného množství estradiolu pro vyvolání změn na pohlavním ústrojí, které jsou typické pro proestrus. Je spouštěna předcházejícím zvýšením frekvence pulzů LH s intervaly delšími než 7 hodin v době anestru až po intervaly kratší než 2 hodiny ~ 14 ~
(Concannon et al., 1993; Tani et al., 1999). Denní průměrná hladina LH je tím zvýšená po dobu asi 6-10 dnů v 1-3 týdnech před nástupem proestru. Odhadovaná délka je založena na denních nebo častějších měřeních v období před proestrem, včetně stanovení intervalů mezi pulzy v 7 hodinovém vybraném období odběru vzorků každých 15-20 minut, a na 8-9 denním podávání agonisty gonadotropiny uvolňujícího hormonu (GnRH) potřebného pro vyvolání plodného proestru u fen během anestru (Concannon, 1993; Concannon et al., 2006). Nárůst frekvence pulzačního vylučování LH je doprovázen pulzy FSH a méně výrazným zvýšením průměrné hladiny FSH, která nemusí být průkazná. Zvýšení hladiny LH je rozhodujícím faktorem pro selekci ovulační vlny folikulů. Podání purifikovaného prasečího LH, ale ne FSH, má za následek předčasný plodný proestrus (Verstegen et al., 1997). Pulzační podávání GnRH každých 90 minut indukuje plodný proestrus, který má za následek spontánní preovulační vlnu LH a plodnou ovulaci (Concannon et al., 1997). Nicméně pulzační ošetření není nezbytné a dlouhodobé zvýšení hladiny LH po dobu 7-9 dní nebo po delší období pomocí trvalého uvolňování agonisty GnRH z implantátu také vyvolává plodný cyklus (Concannon, 1989). Průměr folikulů se zvětšuje na 6-9 mm před preovulační vlnou LH a dále se zvětšuje na 9-12 mm mezi preovulační vlnou LH a ovulací. Růst folikulů a ovulace může být monitorována ultrazvukem (England et al., 2009a). 3.1.4.2 Ovulace Určení času ovulace je často rozhodující při zapouštění, načasování inseminace, monitorování indukované ovulace a reprodukčním experimentování. Když přístup k rychlému stanovení hladiny LH není možný, potom k ovulaci dochází asi 2 dny po prvním náhlém vzestupu progesteronu nad 0,5 ng/ml a dosažení asi 0,9 ng/ml, ke kterému dochází časově shodně s preovulačním nárůstem LH ve více jak 95% cyklů. Pokud brzké a časté měření není možné, potom první den s koncentrací nad 5 ng/ml je často považován za ukazatel ovulace. Rychlé zmenšení otoku vulvy vlivem preovulačního poklesu poměru hladiny estradiolu ku progesteronu naznačuje, že ovulace buď právě začíná, nebo probíhá. Ovulaci signalizuje i silné vroubkování vaginální sliznice vlivem snižující se hladiny estradiolu, které nastává maximálně 2-3 dny po ovulaci a poté ustupuje. Ultrazvukovým vyšetřením vaječníků se také může se značnou přesností určit čas ovulace na základě přechodného 1-2 denního zřetelného zvýšení echogenity v době ovulace u dříve neechogenních folikulů, které je následováno návratem do neechogenního stavu 4. den přítomnosti antrálních žlutých ~ 15 ~
tělísek na vaječnících (Reynaud et al., 2006). Není známo, zdali je echogenita během ovulace způsobena vlivem krvácení, folikulárním kolapsem nebo změnou ve složení folikulární tekutiny. Interval od preovulační vlny LH do ovulace je charakterizován rychlou luteinizací folikulárních buněk, nárůstem theky a krevních cév, náhlým vzestupem hladiny progesteronu a 17-dihydroxyprogesteronu (17-OH progesteronu) a typickým dalším snižováním estradiolu (Concannon et al., 2009). Je pravděpodobné, že zvýšení produkce folikulárního progesteronu úzce souvisí s ovulací, podobně jako je tomu u jiných živočišných druhů. Účast progesteronu v pozitivní zpětné vazbě kaskád zahrnujících produkci prostaglandinu E2 (PGE 2 ) a oxytocinu a zvýšení tvorby metaloproteáz, jak bylo zkoumáno u krav (Fortune, 1994; Fortune et al., 2009), nebyla u fen studována. Detaily zrání oocytů (asi 48-54 hodin po ovulaci), oplození a raný embryonální vývoj byly podrobně popsány Reynaudem et al. (2006). Periferní buňky cumulus oophorus se před ovulací překvapivě přeměňují na buňky produkující hlen, ale přeměna kompaktních nejvnitřnějších vrstev cumulus oophorus na buňky produkující hlen a jejich rozšíření ze zony je po ovulaci 24-36 hodin nebo i více opožděné a naznačuje cytoplazmatické zrání oocytu. 3.1.4.3 Periovulační endokrinologie a preovulační vlna LH Vzrůst hladiny estradiolu v proestru je doprovázen zvýšením androstendionu a testosteronu, kteří dosahují maximální koncentrace přibližně 1100 až 3000 pmol/l, pravděpodobně jako prekurzory estrogenů se vyskytují v přebytku. Není známo, zda jsou příčinou samčího pohlavního chování (např. naskakování jiné feny), které je někdy pozorované v proestru. Folikulární sekrece estradiolu v pozdním proestru může být semiautonomní a samolimitující. Současně se vzrůstem estradiolu, jsou LH a FSH postupně potlačovány, často na nejnižší koncentraci během cyklu s výjimkou bezprostředně po preovualční vlně LH a dosahují méně než 1 ng/ml v prvním případě a méně než 50 ng/ml v druhém případě, vlivem negativní zpětné vazby estradiolu a inhibinu. Hladina progesteronu odráží histologicky detekovatelné ojedinělé skvrny luteinizace folikulu, které se zvětšují velmi nepatrně během většiny proestru, vzrůstají z 0,2-0,4 ng/ml po 0,6-0,8 ng/ml 1-2 dny před vzrůstem hladiny LH, možná pouze jako nadbytek steroidního prekurzoru. Preovulační vlna LH může být definována jako první detekovatelný vzrůst nad 200 % předcházejících průměrných koncentrací a větší než 50 % maximální koncentrace u často odebíraných vzorků. Den počátku preovulační ~ 16 ~
vlny LH se buď shodoval se dnem maxima LH (70-80 %) nebo to byl jeden den před tím. Preovulační vlna LH je pravděpodobně klíčovým ukazatelem. Prahové zvýšení LH je dostatečné k vyvolání ovulace nezávisle na dalším vzrůstu. Preovulační vlna LH v plodných cyklech je značně variabilní, typicky se pohybuje v rozmezí od 3 do 40 ng/ml, v průměru 13 ng/ml, a jen zřídka je nezjistitelná nebo nesplňuje výše uvedená kritéria. LH je typicky zvýšený nad 2 ng/ml po 1-3 dny, v průměru 2 dny, obvykle je maximální v prvních 12-18 hodinách. Vlna FSH je stejně výrazná, koncentrace vzrůstá zároveň s LH z méně než 50 ng/ml a dosahuje maxima 100-600 ng/ml 0-2 dny po LH maximu a klesá pak pomaleji než LH. Začátek preovulační vlny LH nastává 0-3 dny (v průměru 1 nebo 2 různě dle studie) po maximu estradiolu. Tudíž estradiol zpočátku klesá před vzestupem hladiny LH a v některých cyklech do druhého vrcholu během nebo po preovulační vlně LH. V mnoha vzorcích, začátek preovulační vlny LH nemůže být časově oddělen od počátečního náhlého zvýšení hladiny progesteronu (při odběrech vzorků v 6-8 hodinových intervalech) nebo u 17-OH progesteronu (v 12-24 hodinových intervalech). Hladina progesteronu stoupá z 0,5-0,8 ng/ml na 0,9-2,2 ng/ml v průběhu, nebo několik hodin před začátkem preovulační vlny LH. Vzrůst hladiny 17-OH progesteronu je stejný, pokud není silnější. Nárůst hladiny 17-OH progesteronu může být synergický s progesteronem ve stimulování preovulační vlny LH a říjového chování, protože je také ligandem pro progesteronový membránový receptor detekovaný v hypotalamu a hypofýze jiných živočišných druhů. U fen má proestrální potlačení LH vliv na rychlost nárůstu hladiny estradiolu během preovulační vlny LH. Počáteční zvýšení progestinů slouží k usnadnění rychlosti a rozsahu preovulační vlny LH (Concannon et al., 1979, 1993, 2009). U ovariektomovaných fen s estradiolovými implantáty řada injekcí estradiol benzoátu způsobuje postupné zvyšování hladiny estradiolu na hodnoty 2-4 násobné normální maximální hodnotě a slouží k potlačení LH. K preovulační vlně LH dochází v období poklesu hladiny estradiolu po zastavení injekcí nebo u některých fen po vrcholu estradiolu, který se vyskytuje i přes pokračující podávání estradiolu v důsledku jeho zvýšeného odbourávání. U stejně ošetřovaných fen podání progesteronu v době, kdy byly estradiolové injekce přerušeny, způsobí, že preovulační vlny LH začínají dříve a jsou více zesynchronizované a mají dvojnásobnou velikost, než když nejsou ošetřené progesteronem. Synergismus progesteronu naznačuje stimulující roli zvyšující se hladiny progestinu bezprostředně před nebo během preovulační vlny LH v pozdním ~ 17 ~
proestru. U fen podobně jako u ovcí, zvyšování estradiolu může způsobit na dávce závislé potlačení sekrece GnRH hypotalamem, zahrnující velké zmenšení velikosti pulzů navzdory zvýšení frekvence pulzů a výsledkem je potlačení hladiny LH (Evans et al., 1994). Bezprostřední potlačení uvolňování gonadotropního LH v tom také může hrát určitou roli. Pokles v rychlosti vzestupu hladiny estradiolu v pozdním proestru, která spouští preovulační vlnu LH, pravděpodobně vyplývá ze zvýšeného odbourávání periferního estradiolu a rovněž z toho, že folikuly dosahují konečnou zralost (Concannon et al., 2009). 3.1.4.4 Luteální fáze a sekrece progesteronu Dynamika růstu žlutých tělísek a jejich pomalé odbourávání u psů není odlišná od té, kterou lze pozorovat u hysterektomovaných jedinců polyestrických živočišných druhů, u kterých rychlá luteolýza závisí na produkci PGF 2α dělohou. V obou případech se luteální fáze prodlužuje nebo se blíží normální délce trvání březosti. Růstová fáze zahrnuje vyšší regulaci produkce prostaglandin syntetázy, cyklooxygenázy 2 a PGE 2. Zvýšená hladina PGE 2 má pravděpodobně jako u jiných druhů mitogenní, angiogenní, antiapoptické, vazodilatační, luteoprotektivní a luteotropní účinky. Histologické studie periovulačních folikulů psů a raných žlutých tělísek naznačují změny zahrnující ztrátu granulózy a rychlý nárůst buněk theca interna a krevních cév během a po preovulační vlně LH Dosud není známo do jaké míry se granulóza a theka podílí na formování žlutých tělísek. Průměry luteálních buněk jsou 25-55 µm (v průměru 36 µm) v polovině metestru, v nebo krátce po maximální hladině progesteronu (Dore, 1989). Ultrastrukturálně je patrný jen jediný typ steroidogenních buněk s vlastnostmi podobnými jako u velkých luteálních buněk přežvýkavců, včetně hojného hladkého endoplazmatického retikula, vysokého obsahu mitochondrií a nápadného Golgiho aparátu. Luteální buňky psů mohou být podobné těm popsaným u potkanů (Stocco et al., 2007), u nichž se menší a větší luteální buňky liší málo, pokud vůbec, v původu buněk a funkci a jsou bez odlišností pozorovaných u přežvýkavců a primátů. U potkanů, jako u psů, není známo, zda luteální buňky mají původ z granulózy nebo buněk thecy. Větší luteální buňky potkanů se liší schopností exprese PRAP (protein spojený s prolaktinovým receptorem), pro nějž je zajímavé, že jeho exprese probíhá pouze v buňkách thecy zrálých folikulů. U fen se pravděpodobně theca významně podílí na tvorbě žlutých tělísek, a žlutá tělíska fen jsou závislá na prolaktinu. LH a prolaktin, a možná progesteron, mají luteotropní účinky. PGF 2α má luteolytické účinky, ale není ~ 18 ~
produkován v množství, které ovlivní funkci žlutého tělíska během normálního cyklu. PGF 2α podávaný dvakrát denně po dobu 4-8 dní může mít vliv na přechodnou nebo trvalou luteolýzu a ukončení březosti. Pomalá regrese žlutých tělísek přes 1-2 měsíce se jeví, že se týká klíčových funkcí luteálních buněk a nezahrnuje žádný úbytek LH nebo prolaktinu nebo jejich receptorů (Fernandes et al., 1987). To vyžaduje pomalou, ale zřetelnou apoptickou aktivitu bez patrného zvýšení nízké produkce endogenního PGF 2α (Luz et al., 2006; Concannon, 2009). Buňky žlutého tělíska psů, které podléhá regresi, jsou gigantické buňky v podobě mnohojaderného soubuní (Dore, 1989). 3.1.4.5 Luteotropiny LH a prolaktin mají od 2. týdne a možná i dříve luteotropní účinky. Oba jsou potřebnými luteotropiny od 25. dne a později u zabřezlých i nezabřezlých fen (Concannon et al., 1993, 2009). Potlačení produkce LH podáním antagonisty GnRH má už od 10. dne negativní dopady na žlutá tělíska a na sekreci progesteronu (Concannon et al., 2009; Valiente et al., 2009). Prolaktin snižující dávky antagonisty dopaminu už od 13. dne dramaticky snižuje hladinu progesteronu. Dávky antagonisty GnRH, které snižují hladinu LH, nebo prolaktin potlačující dávky dopaminového antagonisty podané po 27. dni způsobují přechodné nebo trvalé přerušení funkce žlutých tělísek a udržují koncentraci progesteronu pod 1-2 ng/ml v celém průběhu ošetřování a často i poté. Vysoce účinné antiserum LH přechodně potlačuje po 42. dnu koncentraci progesteronu (Kowalewski et al., 2008). Při pokusech in vitro přidání LH nebo dibutyrylu (fosfodiesterového inhibitoru) cyklického adenosinmonofosfátu (Concannon et al., 1993), ale ne prolaktinu nebo FSH, ve střední luteální fázi zvýšilo produkci progesteronu luteálními buňkami. Ester cholesterolu a s ním souhlasná plazma měly jak stimulační účinky jako LH in vitro, tak aditivní účinky s těmi vyvolanými LH. Tohle naznačuje, že exogenní cholesterol je chronickým rychlost limitujícím faktorem. Možná zvýšený příjem cholesterolu je mechanismus, pomocí něhož má prolaktin stimulační in vivo účinky. Prolaktin zvyšuje absorpci lipoproteinu žlutými tělísky u hlodavců. Nevýrazné in vivo účinky po ošetření prolaktinem nebo LH značí, že funkce luteálních buněk se po celou dobu blíží maximu a je citlivá na potlačení, ale ne na stimulaci. Podobně jako u hlodavců mohou další luteotropní účinky prolaktinu zahrnovat zvyšování receptorů pro LH, membránové receptory pro progesteron (s endogenním progesteronem majícím luteotropní účinky), expresi steroidogenních ~ 19 ~
enzymů a protein přenášející steroly, a snižování obsahu receptorů pro PGF 2α, ale tyhle účinky jsou dosud u psích luteálních buněk neobjasněny. Jako u potkanů má u psů progesteron pravděpodobně luteotropní nebo antiluteolytické účinky. Antagonista progesteronu podaný fenám v luteální fázi potlačuje funkce ovariálních cév, způsobuje zánětlivé invaze makrofágů ve žlutých tělíscích, snížení sekrece progesteronu, urychlení regrese žlutých tělísek a zkrácení délky cyklu (Concannon, 2009). 3.1.4.6 Progesteron Progesteron je jedinečně účinný steroid u fen. Během anestru nebo u ovariektomovaných fen může bez předchozího ošetření estrogeny vyvolat proliferaci děložní sliznice a hyperplazii mléčné žlázy v podobném rozsahu jako při předchozím ošetření estrogeny. Progesteron v průběhu cyklu může u starších fen způsobit příznaky podobné akromegalii, včetně hypertrofie kůže a dalších měkkých tkání a nadměrným růstem některých kostí a chrupavek. Vyskytuje se jako odpověď na progesteronem vyvolanou hypersekreci růstového hormonu tkáněmi mléčné žlázy a rovněž hypofýzy, a vede ke zvýšení hladiny koncentrace inzulínu podobnému růstovému faktoru-1 (Concannon et al., 1980; Mol et al., 1996; Stovring et al., 1997). Zvýšení hladiny progesteronu může také způsobit inzulínovou rezistenci, působící buď přímo, nebo prostřednictvím zvýšené tvorby růstového hormonu. Diabetické feny často potřebují zvýšené podávání inzulínu ve vazbě na ovariální cykly a graviditu, které mohou způsobit diabetické stavy u fen, které k nim mají dispozice. Syntetické progestiny mohou způsobit nádory mléčné žlázy, akromegalii a diabetické stavy fen a v některých případech v rámci doporučené dávky mohou mít antikoncepční účinky. Nadměrné dávky nebo dlouhodobé podávání některých progestinů způsobily adenokarcinom mléčné žlázy (Concannon, 2011). 3.1.4.7 Březost Progesteron během březosti je pouze luteálního původu. Průměrná hladina progesteronu v době březosti versus nebřezí feny se vzácně průkazně liší mezi studiemi, i když ve většině případů je vyšší po 25.-30. dnu březosti. Očividné sekundární zvýšení po 25. dnu nastává u většiny březích fen, ale nikoliv u nebřezích jedinců. Jiná pozorování ukazují, že sekrece progesteronu je velmi zvýšená v průběhu březosti. Hematokryt začíná klesat mezi 25. a 30. dnem, dosahuje minimální hodnotu, která činí ~ 20 ~
asi 40 % z hodnoty v době porodu a anémie není vyřešena dříve než 1-2 měsíce po porodu. Hladina progesteronu během březosti zůstává také vysoká i přes zvýšený metabolismus a odstraňování v játrech, které má za následek dvakrát vyšší obsah progesteronu ve výkalech oproti nebřezím fenám (Gudermuth et al., 1998). Obsah testosteronu a estrogenů se ve výkalech také zvyšuje, což naznačuje zvýšenou luteální sekreci těchto steroidů i během březosti. Zvýšená sekrece progesteronu je pravděpodobně následkem zvýšené sekrece prolaktinu, začínající 25.-28. den březosti, průměrná hladina prolaktinu je průkazně vyšší od 32. dne březosti. Hladina prolaktinu se zvyšuje zároveň s detekovatelným nástupem a zvyšující se koncentrací relaxinu v plazmě ve 25.-27. dni gravidity. Maxima dosahuje relaxin uprostřed březosti a zůstává zvýšený až do doby porodu, klesá během porodu, a jeví se, že má původ pouze z placenty. Různé další endokrinní a neendokrinní změny byly zjištěny během gravidity, včetně zvýšené insulinové rezistence (Concannon et al., 1989), zvýšeného obsahu fibrinogenu a c-reaktivního proteinu, změny u zánětlivých a koagulačních faktorů, zvyšení FSH v pozdní březosti, předporodní vlny kortizolu, PGF 2α a prolaktinu, a uvolňování oxytocinu do krve během porodu (Concannon et al., 1989, 2006b; Günzel-Apel et al., 2006, 2009). 3.1.4.8 Vývoj mléčné žlázy a pseudogravidita Nemoci mléčné žlázy a dělohy jsou mnohem častější u psů než u jiných domestikovaných druhů zvířat možná vlivem citlivosti k progesteronu, absenci pravidelné březosti či použitím progestinů při antikoncepci. Luteální progesteron nebo exogenní progesteron mohou vyvolat značnou hyperplazii endometria, a dokonce i cystickou hyperplazii endometria (CEH), která může podporovat příležitostnou infekci a pyometru. Bylo zjištěno, že progesteron potlačuje periferní buněčnou imunitu v metestru (Sugiura et al., 2004). Přechod CEH do pyometry je jedním z nejčastějších zdravotních problémů fen a obvykle je řešen operativně (ovarihysterektomie). V každém normálním cyklu způsobuje opakované vystavení estrogenům a progesteronu průkazný růst mléčné žlázy a její zvětšení detekovatelné palpací. Zjevná nebo klinická pseudogravidita zahrnuje nadměrnou odezvu mléčné žlázy, včetně laktogeneze a laktopoezy a občas i laktace. Prolaktin-závislou stimulaci mléčné žlázy napodobující stav v březosti lze pozorovat na konci střední luteální fáze. Výskyt onemocnění mléčné žlázy během pseudogravidity může u některých plemen dosáhnout 10-20% nebo i více, ale je téměř zanedbatelný u jiných plemen (např. bíglů). Průměrná hladina prolaktinu je ~ 21 ~
vyšší a progesteronu nižší u fen se zvětšenou mléčnou žlázou ve srovnání s normálními cykly (Tsutsui et al., 2007). Ovariektomie provedená v průběhu luteální fáze vyvolá často zjevnou pseudograviditu (Concannon, 2009). Klinická pseudogravidita je často doprovázena změnami chování, které jsou podobné jako u fen v období před porodem (např. hrabání, tvorba hnízda a obranné chování). Klinické ošetření je pomocí snižování hladiny prolaktinu dávkami agonistů dopaminu. Podání progestinů navozuje opětovné zvětšování mléčné žlázy. 3.2 Neobvyklé a abnormální cykly, příčiny neplodnosti fen Preovulační koncentrace progesteronu jsou často měřeny pro určení vhodné doby pro inseminaci. Nicméně profily progesteronu, které se liší od očekávaného nárůstu v období kolem inseminace, určují zda-li je cyklus normální nebo abnormální. Pokud není inseminace správně načasována nebo je cyklus abnormální, mohou nastat podstatné finanční ztráty, zejména pokud se používá dodávané sperma. Je důležité určit koncentraci progesteronu v preovulačních krevních vzorcích pro odhadnutí dne preovulační vlny LH, nejen pro přesný čas inseminace a určení doby porodu, ale také pro zjištění abnormálních nebo neobvyklých cyklů, které signalizují ovariální dysfunkci. Neobvyklé nebo abnormální cykly, které mohou být detekovány měřením preovulačních koncentrací progesteronu, zahrnují: anovulaci, pomalý vzestup preovulačního progesteronu, dělenou říji a perzistující říji. Mimoto, nedostatečná luteální fáze může být detekována monitorováním koncentrací progesteronu během říje a diestru. Tyto poruchy pravděpodobně představují přetrvávající ovariální dysfunkci, od mírné po těžkou (Meyers-Wallen, 2007). 3.2.1 Anovulace Anovulace může být definována jako porucha koncentrace progesteronu, která nepřekročí 2 ng/ml, během říje. Ačkoli vaginální cytologie postoupila k nezrohovatělým epiteliálním buňkám, zvýšená koncentrace progesteronu charakteristická pro diestrus se nedostavila a následoval anestrus. Anovulační cykly byly dříve uváděny jako méně časté (tj. u 1,2% fen používaných k rozmnožování (Arbeiter, 1993)). Anovulace může být detekována stanovením vaginální cytologie a zjišťováním koncentrace progesteronu. ~ 22 ~
Anovulace může být způsobena selháním vaječníků pro dodání dostatečného estrogenního signálu k vyvolání nárůstu hladiny LH, selháním hypotalamu pro sekreci dostatečného množství GnRH nebo hypofýzy pro sekreci dostatečného množství LH, nebo selhání vaječníků v reakci na normální preovulační LH vlnu. Feny se můžou navrátit do normálního cyklu během normálního meziříjového intervalu nebo dříve během 1 nebo 2 měsíců; viz. dělená říje. Nedoporučuje se žádná léčba pro tento typ cyklu, pokud říje není zakončena ovulací, protože to může být dočasná ovulační dysfunkce (Arbeiter, 1993). 3.2.2 Pomalý růst koncentrací preovulačního progesteronu Pomalý nárůst progesteronu je definován jako plató hladiny progesteronu na 1-2 ng/ml, v rozsahu 3 a více dní během říje, následovaný rychlým růstem charakteristickým pro ovulační cyklus. Pomalý růst indikuje, že cyklus je neobvyklý, s možným zpožděním v odpovědi vaječníků na preovulační vlnu LH nebo na ovulaci. Preovulční vlna LH se může vyskytnout na začátku, na konci nebo během plató pomalého nárůstu koncentrací progesteronu. Příčiny pomalého nárůstu mohou být podobné jako příčiny anovulace: selhání vaječníků v dodání dostatečného estrogenního signálu k vyvolání nárůstu hladiny LH, selhání hypofýzy pro sekreci LH ve vhodném čase nebo amplitudě, nebo zpožděná folikulární odpověď na vzestup hladiny LH. V těchto případech denní měření koncentrací LH může pomoci k identifikaci příčiny a napomáhat chovatelskému managementu. V mnoha (ale ne ve všech) případech, byl den 0 na konci plató hladiny progesteronu. Nejméně v jednom případě, byly odhady dne 0 na začátku plató. Rozpoznání pomalého nárůstu umožnilo přizpůsobení se, aby bylo dosaženo březosti. Datum porodu byl předpovězen od nejdřívějšího a nejpozdějšího odhadu dne 0 (zjevně méně přesné než předpovědi na základě normálního růstu progesteronu). Naštěstí měření plodu získaná transabdominální ultrasonografií do 39. dne gravidity mohou mnohem přesněji předpovědět datum porodu. Je pozoruhodné, že předpověď je přesnější pokud se provádí 30. den gravidity (Kutzler et al., 2003). ~ 23 ~
3.2.3 Prodloužený meziříjový interval (déle než 10 měsíců) U fen začíná normální říjový cyklus jednou za 4,5 až 10 měsíců. Dochází k variacím v délce meziříjového cyklu a některá plemena, speciálně basenji a kříženci vlka, mají tendenci cyklovat jednou ročně (Feldman a Nelson, 1996). Starší feny mají také tendenci méně často cyklovat a mohou mít meziříjový interval 10 až 12 měsíců (Barton, 1987). Rozdílné diagnózy pro prodlužující se meziříjový interval zahrnují tichou říji, základní onemocnění, nefunkční ovariální cysty a ovariální neoplazii (Grundy et al., 2002). 3.2.3.1 Tichá říje Většina majitelů se spoléhá na přítomnost krvavého výtoku z pochvy k detekci nástupu proestru a tudíž ke zjištění nástupu říjového cyklu. Jestliže je samec dostupný, vnímavost samice se běžně používá k určení posunu do plodného období. Vzdor proměnlivosti reprodukčního chování, detekce estru je obvykle přímočará (Wildt et al., 1981; Christie and Bell, 1972). Jestliže detekce proestru či říjového cyklu zůstává sporná, majitelům by mělo být doporučeno, aby fenu ubytovali se zdravou cyklující samicí a každý týden předkládali vzorky vaginální cytologie k potenciálnímu hodnocení ovariální aktivity pro následné zhodnocení. Nedostatek superficiálních buněk ve vaginální cytologii a pokračující bazální hladina progesteronu (méně než 1-2 ng/ml) po dobu 12 měsíců potvrzuje pokračující anestrus (Feldman a Nelson, 1996). Další hodnocení selhání cyklu by mělo být dokončeno jako u normálního cyklu, včetně kompletního krevního obrazu, chemického rozboru, abdominální ultrasonografie a rozboru funkce štítné žlázy. Jestliže ve všech případech je vyloučeno selhání cyklu, můžeme se pokusit vyvolat říji. 3.2.4 Krátký meziříjový interval (méně než 4 měsíce) Průměrná fena cykluje jednou za 4,5 až 10 měsíců (Feldman a Nelson, 1996). Nepravidelnost cyklu je také častěji zaznamenána u mladších fen do 3 let věku (Feldman a Nelson, 1996). Pro obnovu děložní sliznice během anestru jsou potřeba přibližně 3 měsíce (Johnston et al., 1985; Al-Bassam et al., 1981). Pokud je cyklus fen krátký, proestrus může začít před dokončením obnovy děložní sliznice a následkem toho může nastat neplodnost. ~ 24 ~
3.2.4.1 Spontánní krátký meziříjový interval Diagnóza spontánního krátkého meziříjového intervalu slouží pro vyloučení všech ostatních příčin. Ovulace by měla být dokumentována pro každý říjový cyklus (hladina progesteronu nad 2 ng/ml v diestru) v přidružení ke zkrácenému meziříjovému intervalu. V minulosti léčba spočívala v podávání miboleronu pro vyvolání normální délky anestru po dobu 6 měsíců. Miboleron není dlouho dostupný a ve Spojených Státech nejsou žádné bezpečné alternativní terapie. Jeho účinnost nebyla nikdy zdokumentována. Provedení přesného načasování ovulace a použití osvědčeného plodného samce jsou nejlepší metody optimalizace početí v těchto případech. Pokud je k dispozici, může biopsie dělohy identifikovat cystickou hyperplazii endometria (Grundy et al., 2002). 3.2.4.2 Dělená říje Dělená říje se týká říjového cyklu, který začíná normálním folikulárním vývojem a sekrecí estrogenů, ale nenastává ovulace. Výsledkem je regrese ovariálních folikulů a říjové chování se ukončí a je následováno návratem do říje za 1 až 10 týdnů (obvykle 1 až 3 týdny) spolu s novou vlnou ovariálních folikulů (Feldman a Nelson, 1996). Druhá říje je často spojena s ovulací a je obvykle plodná. Je běžné pro majitele interpretovat počáteční folikulární aktivitu a sekundární vlnu vývoje folikulů jako dva odlišné cykly. Dělené říje jsou často běžné pro feny na prvním nebo druhém cyklu. Méně často k nim dochází u psů starších 24 měsíců (Feldman a Nelson, 1996). Při detekci ovulace budou mít zvířata vykazující tichou říji bazální koncentraci progesteronu (pod 2 ng/ml) i vzdor ukončení říjového chování. Léčba není nutná. Rutinním hodnocením progesteronu se zajistí, že se inseminace provede ve vhodnou dobu. Tento jev může být způsoben stresem. Dělená říje může být také definována jako abnormálně krátký proestrus a říje, doprovázená hladinou progesteronu charakteristickou pro anovulaci, která byla za 1-2 měsíce následována jiným říjovým cyklem. Tento sekundární cyklus může být normální ovulační cyklus. Anovulace může být první fází dělené říje. Tedy když se nedostaví nárůst koncentrace progesteronu, tak den 0 nemůže být určen a doporučuje se zrušit plánovanou inseminaci. Další cyklus zpravidla může nastat během 1-2 měsíců. Když je zjištěn následný proestrus, monitorování progesteronu je znovu zahájeno, ~ 25 ~
a pokud je cyklus normální, tak je fena ve vhodnou dobu inseminována (Meyers-Wallen, 2007). 3.2.5 Nedostatečná luteální fáze Nedostatečná luteální fáze může být definována jako snížená koncentrace progesteronu pod 2 ng/ml před běžným ukončením diestru. K abnormálnímu snížení koncentrace progesteronu může docházet v pozdní fázi říje (po ovulaci) nebo v jakékoli době během diestru. Nedostatečná luteální fáze nemůže být zjištěna pomocí běžného načasování ovulace prostřednictvím měření hladiny progesteronu, pokud není odběr vzorků prodloužen do pozdní říje a diestru. Pro detekci nedostatečnosti luteální fáze se doporučuje odběr vzorků, dokud koncentrace progesteronu neklesne pod 5 ng/ml. Poté týdenní odběr vzorků v diestru může být třeba k rozpoznání začátku nedostatečnosti luteální fáze (Meyers-Wallen, 2007). Náležitá pozornost by měla být věnována ještě před zahájením substituční terapie progesteronem během březosti feny, protože to může vyvolat pyometru a maskulinizaci samičích plodů (34.-46. den). Proto léčba během brzké březosti (před 46. dnem) není pravděpodobně bez záruky. Pokud je léčba luteální nedostatečnosti zahájena, je nezbytné přesné stanovení data porodu (stanovením koncentrace progesteronu nebo ultrazvukovou metodou) (Freshman, 2000). Bez ohledu na použitou metodu náhrady progesteronu, majitelé by měli být připraveni na dokrmování štěňat mléčnou směsí, pokud bude laktace opožděna. Mimoto, štěňatům by mělo rovněž být umožněno sát u matky pro stimulaci sekrece prolaktinu a laktace (Meyers-Wallen, 2007). 3.2.6 Prodloužený proestrus a říje K nástupu proestru a říje dochází pod vlivem estrogenů. Proestrus a říje trvající déle než 4 týdny jsou abnormální (Feldman a Nelson, 1996). Perzistující proestrus či říje může nastat jako výsledek pokračujícího působení pouze estrogenů, ačkoli je častější po působení estrogenů a progesteronu z endogenních nebo exogenních zdrojů. Vaginální cytologie, odhalující především svrchní epiteliální buňky, je rychlým a jednoduchým indikátorem vlivu estrogenů. Kompletní krevní obraz by měl být rovněž dokončen u každého zvířete vykazujícího známky prodloužené říje k posouzení suprese kostní dřeně a sekundárně pro posouzení chronické expozice k estrogenům. ~ 26 ~
Diferenciální diagnostika pro prodloužený proestrus nebo říji obsahuje folikulární cysty, tumory buněk granulózy a podávání exogenních estrogenů (Grundy et al., 2002). 3.2.7 Perzistentní říje Ačkoli perzistentní říje může být vyvolána léčbou exogenními gonadotropiny nebo estrogeny, perzistentní říje nastává spontánně z důvodu endogenní produkce estrogenů (Meyers-Wallen, 1992). Spontánní perzistentní říje je abnormálním jevem. Je obvykle důsledkem abnormální funkce vaječníků; nicméně, abnormální folikuly nebo folikulární cysty jsou zřídka detekovány ultrasonograficky (Olson et al., 1989). Perzistentní říje může být definována jako říje, která trvá déle než 21 dní, pokud je monitorována opakovanou vaginální cytologií (90 a více % zrohovatělých buněk). Koncentrace estrogenů je často těžko měřitelná a interpretovatelná. V normálních cyklech, rohovatění vaginálního epiteliálního nad 90% začíná po vrcholu hladiny estrogenů působících v pozdním proestru a přetrvává po několik dní, během nichž je pouze bazální sekrece estrogenů (Concannon et al., 1975). Koncentrace progesteronu během perzistentní říje se pohybuje v preovulačním rozsahu (méně než 2 ng/ml) (Olson et al., 1989). Perzistentní říje může být vyvolána tumorem buněk granulózy, což může být považováno za typ dysfunkce vaječníků, které nereagují na gonadotropiny. Nicméně, v některých případech perzistentní říje byla následována méně závažnými ovariálními dysfunkcemi, jako je anovulace nebo pomalý nárůst progesteronu. Úspěšná léčba perzistentní říje jiná než ovarihysterektomie není dosud dobře zdokumentována. V některých případech perzistentní říje zaniká bez léčby, o čemž svědčí vzhled nezrohovatělých buněk ve vaginální cytologii a návrat k anestru. Nicméně obecně feny, které projevovaly perzistentní říji, měly špatnou prognózu pro návrat plodnosti. Proto se doporučuje ošetření fen s říjovým chováním delším než 21 dnů, aby se zabránilo vývoji hypoplazie kostní dřeně či pyometry. V některých případech je jednou za 3 dny podáván lidský choriový gonadotropin (hcg) s cílem přeměnit perzistentní říji na diestrus nebo anestrus (Olson et al., 1989). Toto ošetření nevyvolá ovulaci, a proto se nedoporučuje tyto feny inseminovat. Úspěšná léčba je zjištěna pomocí vaginální cytologie charakteristické pro diestrus nebo anestrus s nebo bez nárůstu hladiny progesteronu a může být zaznamenána přibližně po 1-2 týdnech léčby. Nicméně léčba je problematická, protože má často za následek pyometru, proto je většinou nezbytná ovarihysterektomie. ~ 27 ~
Pokud říje není spontánně ukončena, protože léčba pomocí hcg neuspěje, a pokud se perzistentní říje opakuje, potom jako možná diagnóza, kterou bychom měli zvážit, může být tumor buněk granulózy. Tento typ tumoru je diagnostikován u fen mladších 2,5 roku (Purswell et al., 1999). Pokud říje přetrvává hodně dlouho, může následovat úhyn feny díky hypoplazii kostní dřeně (aplastická anémie, leukopenie a trombocytopenie) nebo díky pyometře. Proto je doporučována ovarihysterektomie s následným histologickým vyšetřením k určení tumoru buněk granulózy nebo folikulárních abnormalit. 3.2.8 Abnormality pohlavního vývoje Poruchy diferenciace pohlaví mohou být rozděleny do tří hlavních kategorií: (1) abnormality pohlavních chromozomů, (2) abnormality pohlavního ústrojí, (3) abnormality fenotypu pohlaví (Feldman a Nelson, 1996). Zdraví psi mají charakteristickou řadu chromozomů, včetně těch, které určují pohlaví. Matka přispívá chromozomem X a otec buď chromozomem X nebo Y. Normální karyotyp pro fenu je 78, XX a pro psa 78, XY. U samic (XX) se gonády vyvíjí ve vaječníky, a nedostatek testosteronu ovlivňuje vývoj samičího pohlavního ústrojí z Müllerových vývodů. V přítomnosti chromozomu Y se vyvíjí varlata a produkuje se testosteron a látka potlačující vývoj Müllerových vývodů (Feldman a Nelson, 1996). Výsledkem je, že se Wolfovy vývody vyvíjí v samčí pohlavní ústrojí a Müllerovy vývody atrofují. Typ gonád, které se vyvíjí, určuje pohlavní typ daného jedince. Například pokud zvíře vyvíjí vaječníky, tak pohlavím typem je samice. Fenotyp pohlaví se týká vnějšího vzhledu zvířete (tj. fenotyp samice vypadá exteriérově jako samičí). Fenotypová pohlavní diferenciace se vyskytuje jako konečná fáze pohlavního vývoje (Feldman a Nelson, 1996). Abnormality se mohou objevit v jakémkoli čase během těchto vývojových fází. Abnormality pohlavních chromozomů jako jsou chromozomy XXY, X0, nebo XXX, se vyskytují i u psů. Tito psi se jeví jako normální samci nebo samice s málo vyvinutými pohlavními orgány (Feldman a Nelson, 1996). Abnormality pohlavních chromozomů mohou být detekovány pouze karyotypizací. ~ 28 ~