CELLS AND MEDIUM SEPARATION FROM SUSPENTION FOR BIOCHEMICAL ANALYSES SEPARACE BUNĚK A MÉDIA ZE SUSPENZE PRO BIOCHEMICKÉ ANALÝZY Richterová L., Klemš M., Havel L. Ústav botaniky a fyziologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail: LeLaR@mendelu.cz ABSTRACT Quantitative separation of BY-2 cells from culture medium using vacuum separator Dorcus (Tessek, Ltd. Czech Republic) was studied. The aim of study was to verify the viability of cells after separation with vacuum separator Dorcus for sample preparation without any contamination of cells by compounds contained in the medium (2,4-D, products of metabolism etc.). Effect of separation was compared using technic of rinse with subsequent separation or using of accumulation of 14 C-2,4-D and assay of 2,4-D in cells by ELISA method and assay of viabilty of cells. We observed that rinse with centrifugation decreased the content of 2,4-D in the medium, but centrifugation did not eliminates the rest of medium from cells. Dorcus separator eliminates medium from suspension completly with wellpreserved viability of cells. The ratio of 2,4-D and 14 C-activity of 14 C-2,4-D confirmed retention of 2,4-D in cells. ABSTRAKT Pomocí vakuového separátoru Dorcus (Tessek, s.r.o - ČR) bylo studováno kvantitativní oddělení buněk BY-2 suspenze od kultivačního média. Cílem práce bylo ověřit viabilitu buněk po použití této metody ve vztahu k přípravě vzorků pro biochemické analýzy a to tak, aby vzorky nebyly kontaminovány obsahem látek z média (2,4-D, produkty metabolismu atd.). Efekt separace byl pro srovnání studován za použití promývací techniky s následnou centrifugací, dále za použití akumulace 14 C-2,4-D a stanovení obsahu 2,4-D v buňkách ELISA metodou a ověřením viability buněk. Z naměřených hodnot bylo zjištěno že, promývání s centrifugací snižuje obsah 2,4-D v médiu, avšak samotná centrifugace zanechává v buněčné mase velký podíl tekutiny (média). Použití vakuového separátoru odstraňuje
médium ze suspenze dokonale při zachování viability buněk. Poměr obsahu 2,4-D a 14 C- aktivity pocházející ze 14 C-2,4-D potvrzuje retenci 2,4-D v buňkách. Klíčová slova: BY-2 buněčná suspenze, 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina, 14 C-aktivita, vakuový separátor, viabilita buněk ÚVOD Studium příjmu syntetických auxinů (např. 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina, 2,4-D) na protoplastech a buněčných suspenzích v posledních několika letech přineslo řadu objektivních výsledků k objasnění mechanismu transportu auxinů přes membrány buněk (DELBARRE et al. 1996, ZAŽÍMALOVÁ and PETRÁŠEK 2000). Retenci přijaté 2,4-D v buňkách lze bilancovat rozdílem mezi jejím příjmem a výdejem do média s ohledem na metabolismus, eventuelně degradaci. Jako modelová je používána tabáková buněčná suspenze BY-2 (Bright Yellow - 2) autorů NAGATA and KUMAGAI (1999), která má vysokou růstovou rychlost a viabilitu a za standardních podmínek je fenotypově stabilní. Neadheruje k podkladům, tvoří vícebuněčné řetízky, které spontánně nedisociují na jednotlivé buňky. Kultivace probíhá na médiu LINSMAIER and SKOOG (1964) s 1 µm 2,4-D (BY-2 je závislá na 2,4-D), přičemž zmnožení buněk za 1 týden je 80-100 násobné (z cca 80 000 buněk na 6,5 milionu/1 ml média). Studium příjmu 2,4-D buněčnou suspenzí vyžaduje optimalizovaný protokol kultivace suspenze (subkultivace, růstová křivka a viabilita). Při kultivaci suspenze je možno kontrolovat hustotu (počet) buněk orientačně za zachování sterility kultury pomocí sedimentace buněk přímo v kultivačních Erlenmayerových baňkách (BLOM et al. 1992). Nezbytný je však šetrný způsob odběru vzorku pro analytické stanovení, při němž nejsou buňky suspenze poškozeny či stresovány. Navíc by nemělo při odběru docházet k artefaktům - povrchová kontaminace buněk, absorpce zkoumaných látek apoplastem aj. Klasická sedimentace buněk s využitím centrifugace a promýváním suspenze byla používána ve výzkumu pro biotechnologické aplikace, provozní biotechnologické aplikace využívaly nejčastěji kontinuální výměnu média (WILSON et al. 1971), které od zbytků suspenze bylo filtrováno. Recentní práce spíše uplatňují filtraci buněčné masy různými způsoby s využitím speciálních filtrů (DELBARRE et al. 1998, PETRÁŠEK et al. 2002). Cílem práce bylo vyvinout a optimalizovat způsob odběru BY-2 buněk při němž dochází k dokonalému odstranění média ze suspenze za zachování viability buněk a to se současnou retencí 2,4-D v buňkách v průběhu procedury. Dalším cílem bylo umožnit odběr
většího počtu vzorků najednou s následným jednoduchým zpracováním či uchováním před vlastní biochemickou analýzou. MATERIÁL A METODY Buněčná suspenze BY-2 byla kultivována ve 100 ml Erlenmayerových baňkách na MS médiu (MURASHIGE and SKOOG 1962) s 1 µm 2,4-D po dobu 5 dnů. Kultivace probíhala na třepaččce INFORS AG CH-4103 při 96 rpm, při konstantní teplotě 25 C bez přístupu světla. Subkultivace byla prováděna pravidelně po 5 dnech (1:10). Vlastní separace buněk a média byla provedena dvěma způsoby pomocí centrifugace a dekantace média a filtrací za využití vakuového separátoru Dorcus. K experimentům byly použity následující metodické přístupy: měření počtu buněk a viability (Fuchs-Rosenthalova počítací komůrka, barvení fluoresceindiacetátem FDA a propidiumjodidem PI), purifikace metanolického extraktu 2,4-D z buněk s kvantifikací 2,4-D pomocí ELISA testu (FRÁNEK et al. 1994) a sledování retence 14 C-2,4-D (Sigma, specifická radioaktivita 1,147 GBq/mmol) v buňkách pomocí spalování vysušených vzorků v proudu kyslíku a následným stanovením metodou kapalné scintilace (KALA and PEŠKA 1980). K vlastní separaci pomocí vakuového separátoru Dorcus byla použita 5-ti denní suspenze (cca 1,7 mil. buněk na 1 ml suspenze). Do suspenze (obsah 1 µm 2,4-D) byla přidána 14 C-2,4-D v poměrech 0,01: 1; 0,1 : 1 a 0,5 : 1 a suspenze byla krátce inkubována. Pro stanovení retence 14 C-2,4-D v buňkách v průběhu procedury byla suspenze promývána čistým médiem bez obsahu 2,4-D a centrifugována při 1000 ot/min. Promývání suspenze bylo provedeno dvakrát. Separace na přístroji Dorcus připojeném na vodní vývěvu byla provedena za podtlaku -25 kpa (schéma na obr. č. 1). Do adaptérů na víku přístroje byly zasunuty injekční stříkačky bez pístu (typ zakončení Luer) s dvěma kolečky filtračního papíru Whatman. Do stříkaček byl pipetován 1 ml buněčné suspenze. Před zapnutím vodní vývěvy byly adaptéry nastaveny do polohy umožňující sběr média do zkumavky ve stojánku přístroje (druhá poloha odpad). Filtrát buněčné suspenze ve tvaru válečku byl ze stříkačky vytlačen tenkou kovovou tyčinkou. Buněčná masa byla zbavena filtračního papíru, zvážena, zmražena a lyofilizována.
Obr. 1: Schéma separace buněk a média pomocí podtlaku suspenze médium 1 ml suspenze vakuum Výsledky 14 C-aktivity naměřené v dpm (příjem či retence 14 C-2,4-D v buňkách) a obsahu 2,4-D v buňkách byly vyjádřeny na čerstvou hmotnost suspenze. Bylo provedeno vždy 5 opakování každého měření a statistická průkaznost byla hodnocena pomocí Studentova t-testu. VÝSLEDKY A DISKUSE Použití centrifugace suspenze s dekantací média nevedlo k uspokojivé separaci buněk téměř vždy došlo ke ztrátám buněk. Nepoužitelný byl tento způsob pro odběr vzorků na analýzy, naměřeny byly vždy odlišné hodnoty 14 C-aktivity. Kvantitativní analýza pak vykazovala vysoké stření chyby. Tento způsob odstranění média ze suspenze byl však použitelný pro další kultivaci suspenze za sterilních (aseptických) podmínek. Filtrací byla oddělena suspenze od média dokonale za zachování viability buněk v hodnotách 95 % 97 %. Nedocházelo ke ztrátám buněk ani média, buněčná masa nebyla kontaminována zbytky média. Vzhledem k tomu, že odebraná buněčná masa byla kompaktní bylo možné přímo stanovit čerstvou hmotnost vzorku buněk. Tento způsob rovněž umožnil další sterilní kultivaci suspenze. Při kombinaci s promýváním suspenze pomocí média neobsahujícího 2,4-D nedošlo ke snížení obsahu 2,4-D ani 14 C-2,4-D v různých koncentračních poměrech po předchozí inkubaci (viz obr. č. 2).
Obr. 2: Retence 14 C-aktivity (dpm) v buňkách při promývání a filtraci buněčné suspenze v různých koncentračních poměrech 14 C-2,4-D a 2,4-D v inkubačním médiu dpm/mg FW 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 aplikace 1.promývání 2.promývání 0,01:1 0,1:1 0,5:1 14 C-2,4-D:2,4D Obsah 2,4-D v buňkách 5-ti denní suspenze (0,7 ng/mg FW) byl po promývání stejný a nesnižoval se, zatímco s obměnou média se obsah 2,4-D v médiu snížil z hodnoty 10 ng /ml na hodnotu 0,1 ng/ml (obsah 2,4-D v čerstvém médiu byl 221 ng/ml). To jsou hodnoty potvrzující využití 2,4-D buněčnou suspenzí. Vzhledem ke skutečnosti, že 2,4-D je buňkami metabolizována a pasivní difůze z buněk je jen nepatrná (ZAŽÍMALOVÁ and PETRÁŠEK 2000) lze předpokládat, že při pomývání a filtraci buněk nedochází ke ztrátám 2,4-D z buněk. To dokazují hodnoty 14 C- aktivit v našem experimentu, včetně obsahu 2,4-D. Použití tohoto způsobu separace je tedy velmi vhodné pro přípravu kompaktního vzorku buněčné suspenze pro následující analytické zpracování. POUŽITÁ LITERATURA BLOM,T.J.M., KREIS,W., van IREN, F.and LIBBENGA, K.R.(1992): A non-invasive method for the routine-estimation of fresh weight of cells grown in batch suspension cultures. Plant Cell Rep., 11:146-149. DELBARRE, A.,MULLER, P., IMHOFF, V. and GUERN, V.(1996): Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension cultured tobacco cells.planta, 198:532-541.
DELBARRE, A., MULLER, P. and GUERN, J. (1998): Short-lived and phosphorylated proteins contribute to carrier-mediated efflux, but not to influx, of auxin in suspension-cultured tobacco cells.plant Physiol, 116:833-844. FRÁNEK, M., KOLÁŘ, V., GRANÁTOVÁ, M. and NEVORÁNKOVÁ, Z. (1994): Monoclonal ELISA for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid: Characterization of antibodies and assay optimization. J. Agric.Food Chem., 42: KALA, A. and PEŠKA, J. (1980): Preparation and use of scintillation gel based on polyethylene dispersion in toluene scintillation solution (in Czech).In:Peška J,Černý V. (eds) Use of Nuclear Methods and Ionizing Radiation in Genetics, Breeding and Plant Physiology (in Czech).Brno: Agr. Univ. Brno Press, pp 170-173. LINSMAIER, E.M. and SKOOG, F. (1964): Organic growth factor requirement of tobacco tissue cultures.physiol. Plant.,18:100-127. MURASHIGE, T. and SKOOG, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.physiol. Plant., 15:473-497. NAGATA, T. and Kumagai, F. (1999): Plant cell biology through the window of the highly synchronized tobacco BY-2 cell line.meth. Cell Science 21:123-127. PETRÁŠEK, J., ELČKNER, M., MORRIS, S.A. and ZAŽÍMALOVÁ, E. (2002): Auxin efflux carrier activity and auxin accumulation regulate cell division and polarity in tobacco cells.planta, 216:303-308. WILSON, S.B., KING, P.J. and STREET, H.E. (1971): Studies on the growth in culture of plant cells. XII A versatile systems for the large scalebatch or continuous culture of plant cell suspension. J. Exp. Botany 22: 177-207. ZAŽÍMALOVÁ, E. and PETRÁŠEK, J. (2000): Estimation of activity of auxin uptake and efflux carriers the cells of VBI-0 tobacco strain. Biologické listy 65 (3-4):253-257. Poděkování Tato práce byla financována z prostředků programu Výzkumného centra Signální dráhy u rostlin (LN00A081) a Interní grantové agentury MZLU Brno (IGA 4/4).