Téma: SAMČÍ GAMETOFYT Fosfolipidová signalizace ve vrcholovém růstu rostlinné buňky Praktikum z fyziologie rostlin (pro studenty odborné biologie) 1
Teoretický úvod: Samčí gametofyt (mikrogametofyt) krytosemenných rostlin, čili zralé pylové zrno, sestává (podle druhu) v okamžiku uvolnění z prašníku (anthese) ze dvou až tří haploidních buněk, které jsou potomky téhož produktu meioze (mikrospory) a nesou tudíž identický haploidní genom. Většinu hmoty pylového zrna představuje vegetativní buňka. U mnoha krytosemenných rostlin (včetně tabáku Nicotiana tabacum) je zralý pyl dvojbuněčný: do vegetativní buňky je zanořena buňka generativní, která se až po opylení dělí na dvě buňky spermatické. U některých skupin rostlin, včetně brukvovitých, kam patří modelový huseníček Thalův (Arabidopsis thaliana), dochází k dělení generativní buňky již během zrání pylu v prašníku, zralý pyl je trojbuněčný. Pylová zrna v průběhu zrání (maturace) hromadí zásobní materiál (včetně např. skladovaných specifických mrna, které mohou být při klíčení pylu rychle využity k nastartování proteosyntézy bez nutnosti nové transkripce), ztrácejí vodu a budují buněčnou stěnu s tlustou a precizně strukturovanou vnější vrstvou (exinou), k níž kromě polysacharidů, lipidů a proteinů vylučovaných vlastní vegetativní buňkou gametofytu přispívají též produkty vnitřní výstelky prašných pouzder (tapeta). Pylová zrna jsou často obalena lepkavou vrstvou s vysokým obsahem lipidů, lipoproteinů a karotenoidů (tzv. Pollenkitt), produkovanou tapetem, která pylu udílí charakteristickou barvu a texturu. Zralý dehydratovaný pyl je obvykle velmi odolný vůči vyschnutí a jiným fyzikálním vlivům. Pylová zrna si např. mohou zachovat životaschopnost i po několik let při skladování v -20 o C. Po styku s povrchem blizny se pylová zrna rychle hydratují klíčí aperturou (zeslabeným místem exiny) prorůstá ze ven pylová láčka výběžek vegetativní buňky, který obsahuje i její jádro a v němž jsou vchlípeny obě buňky spermatické. Láčka, pokrytá speciálním typem buněčné stěny, v níž převládá polysacharid kalóza, prorůstá čnělkou (někdy až do délky několika desítek centimetrů např. u kukuřice nebo ocúnu) a spermatické buňky putují generativní buňky cytoplasmou až na místo určení (t.j. k vajíčku a k centrální buňce zárodečného vaku, s nimiž po prasknutí láky spermatické buňky splynou). Živá cytoplasma vegetativní buňky, v níž probíhá intenzivní cyklóza (proudění cytoplasmy) a která uvnitř nese buňky spermatické, přitom přetrvává pouze ve vrcholové části exina láčka vegetativní buňka rostoucí láčky, která se od pylového zrna a starších částí láčky periodicky odděluje kalózovými zátkami. a zrna její 2
Pylové láčky lze u řady druhů pěstovat in vitro mimo bliznu ve vhodném médiu, takže mohou sloužit jako snadno experimentálně dostupný model pro studium vrcholového růstu rostlinných buněk. Při tomto způsobu růstu, který s láčkami sdílejí také kořenové vlásky, expanduje buněčný povrch pouze na vrcholu rostoucího výběžku. Vrcholový růst (tip growth) tedy soustředění buněčného růstu (expanze povrchu) do přesně vymezené oblasti na špičce prodlužující se láčky či kořenového vlásku je výsledkem precizní souhry řady signalizačních i výkonných drah. Na rostoucí špičce dochází k intenzivní exocytóze (výlevu) membránových váčků odvozených od endomembránových kompartmentů, které vesměs nepřímo pocházejí z endoplasmatického retikula. Zdrojem váčků je zejména Golgiho aparát, ale zřejmě jím mohou být i některé typy endosomů. Váčky přinášejí jednak novou cytoplasmatickou membránu, která splývá s membránou stávající, jednak materiál určený k zabudování do buněčné stěny. Vzhledem k malému objemu exocytotických váčků (jejichž průměr bývá kolem 0,1 mikrometru nejsou tedy vidět v běžném optickém mikroskopu) se při dopravě stěnového materiálu na povrch nutně dostává více membrány, než kolik jí pojme expandující plasmalema. Proto ve vrcholové oblasti rostoucí láčky současně s exocytózou probíhá i intenzivní endocytotická recyklace membránových váčků. Exocytóza a endocytóza hrají významnou úlohu nejen ve vrcholovém růstu rostlinné buňky, ale i při růstu difusním, ať již je isodiametrický, dlouživý, nebo lokalizovaný (nikoli však vrcholový např. při vývoji vzájemně propojených buněk listové epidermis). Vrcholová oblast rostoucí láčky se vyznačuje vysokou koncentrací exo- a endocytotických váčků, které prakticky vytěsňují organely a ostatní kompartmenty. Špička rostoucí láčky se proto v běžném optickém mikroskopu jeví jako "jasná zóna" (clear zone), v níž nejsou viditelné žádné struktury a nezasahuje do ní cyklóza. Ustane-li růst láčky, aniž by životaschopnost buňky jinak byla narušena (např. v důsledku specifické inhibice některého regulačního procesu), jasná zóna se zkracuje a oblast intenzivního proudění cytoplasmy se posouvá směrem ke špičce. Na vrcholovém růstu pylové láčky (a obdobně i kořenového aktin vlásku) se kromě již zmíněných kompartmentů sekreční a endocytotické dráhy významně podílí také cytoskelet. Rostoucí okrsek buněčného povrchu na špičce láčky je vymezen mikrotubuly prstencovitou zónou, v níž probíhají neustálé přestavby jemných aktinových vláken. Ve starších částech láčky aktinová vlákna splývají v tlustší (a méně dynamické) podélné kabely. O úloze aktinového cytoskeletu při utváření pylové láčky vypovídá deformace rostoucí láčky nebo (při větších dávkách) zástava jejího růstu po rozrušení 3
aktinových struktur specifickými inhibitory, jako je např. latrunculin B nebo cytochalazin D. Naopak role mikrotubulů ve vrcholovém růstu je zřejmě méně významná. V difusně rostoucích rostlinných buňkách s "klasickou" převážně celulózovou buněčnou stěnou je pořadí významu dvou hlavních cytoskeletálních systémů často obrácené pro lokalizaci a směr expanze povrchu jsou obvykle rozhodující kortikální mikrotubuly, které ovlivňují směr vkládání nových mikrofibril celulózy a tudíž také směr expanze buněčné stěny. Za koordinaci rozmanitých procesů, jejichž úhrnným výsledkem je vrcholový růst, se podílí celá řada regulačních a signálních drah. Na expandující, exocytoticky aktivní oblast buněčného povrchu (aktivovanou kortikální doménu) můžeme pohlížet jako na specifický funkční modul, který integruje funkce kompartmentů endomembránového systému, cytoskeletu, a povrchových struktur buňky (membrány a stěny). Významnou roli zde hrají malé GTPázy, zejména z genových rodin Rab (účastní se regulace transportu membránových váčků) a Rop ("Rho of plants", GTPázy podílející se na kontrole uspořádání aktinového cytoskeletu), ale i specifické enzymy modifikující fosfolipidy samotné plasmalemy a tím ovlivňující funkce periferních či integrálních membránových proteinů. Fosfolipidová signalizace v membráně rostoucí špičky pylové láčky zahrnuje především signální působení fosfoinositidů a kyseliny fosfatidové. Kyselina fosfatidová (phosphatidic acid, PA) vzniká štěpením strukturních fosfolipidů membrány fosfolipázami třídy D (phospholipase D, PLD). PLD jsou enzymy, které hydrolyzují fosfoesterovou vazbu v molekule fosfolipidu (vazba označená šipkou na schématu). Hydrolýzu je možno formálně popsat jako přenos zbytku kyseliny fosfatidové na molekulu vody. Protože substrátová specifita PLD není absolutní, můžeme enzymu místo vody "podstrčit" nějaký primární alkohol, například 1-butanol (n-butanol), který je účinným inhibitorem signalizace závislé na PLD. Abychom odlišili specifický vliv 1-butanolu zprostředkovaný PLD od nespecifických efektů této látky např. na tekutost membrány, je vhodné v experimentech používat jako kontrolu isomery butanolu, které nemohou sloužit jako substráty pro PLD (t.j. sekundární a terciární butanol). PLD O - R O P O C 3 O C O CO R 1 C O CO R 2 O významu fosfatidové kyseliny generované PLD pro růst pylových láček tabáku svědčí, kromě dalších důkazů, také inhibiční účinek 1-butanolu na klíčení i růst láček v kultuře. Následující praktiková úloha je zjednodušenou verzí jednoho z experimentů z publikované práce M. Potockého et al. (Planta 217:122-130. 2003), v níž byla role PLD a PA v růstu láček poprvé demonstrována. 4
Úkol: Založte kulturu pylu tabáku in vitro a ověřte účinek 1-butanolu na klíčení a růst pylových láček. Úvod: Inhibiční účinek 1-butanolu na klíčení i růst pylových láček, který je důsledkem inhibice signalizace zprostředkované fosfolipázou D, lze snadno ověřit jeho přidáním do média pro klíčení pylu. K vyloučení nespecifických účinků přitom můžeme použít kultury v médiu obsahujícím 2-butanol, který fosfolipázu D neinhibuje. Materiál a potřeby: Pyl tabáku (Nicotiana tabacum cv. Samsun) uchovávaný v -20 C. Kvůli porovnatelnosti výsledků je důležité používat pyl z téže zkumavky. Pyl z tabáku sbíráme ve vegetační sezóně (nejlépe během 2. poloviny léta). Za suchého počasí sebereme z rostlin poupata s růžovými špičkami korun těsně před otevřením (mohou být i pootevřená, ale prašná pouzdra musí být dosud uzavřená t.j. hladká, vzhledu bochánků). Pomocí pinzety vybereme prašná pouzdra na filtrační papír položený na hodinovém skle nebo Petriho misce, a necháme vysychat, dokud většina prašných pouzder nepraskne a neobrátí se na ruby (obvykle od rána do odpoledne nebo přes noc, ne déle). Pak prašníky sesypeme do skleněné trubičky beze dna uzavřené kouskem silonové punčochy a vložené do širší skleněné zkumavky (viz obrázek). Zkumavku s trubičkou intenzivně vortexujeme, a průběžně pomocí špachtle odebíráme do eppendorfek pyl, který propadl punčochou (vnitřní trubičku je během vortexování nutno dobře držet). Sklizený pyl uchováváme v -20 C. Médium pro kultivaci pylových láček: PEG 3660 (Sigma) nebo PEG 4000 (Fluka) 200 g/l, kyselina boritá 1.6 mm v destilované vodě. Čerstvě připravené médium není třeba sterilizovat, lze je krátkodobě (1-2 týdny) uchovávat v chladničce, ale nutno zkontrolovat absenci viditelné mikrobiální kontaminace. Pro delší uchovávání lze médium buďto sterilizovat filtrací, nebo zmrazit. Skleněné scintilační lahvičky 5
Primární butanol (1-butanol, n-butanol) a sekundární butanol (2-butanol). Pipety, špičky, párátka, popisovače k označení lahviček, parafilm, nůžky, podložní a krycí sklíčka. Přístrojové vybavení: mikroskop, žádoucí, avšak nikoli nezbytná je orbitální třepačka (100-200 rpm). Postup: Označíme scintilační lahvičky dle rozpisu a do každé lahvičky napipetujeme 1 ml média. Podle rozpisu přidáme butanol do požadované koncentrace: kontrola bez butanolu 0.2% 1-butanol 0.4% 1-butanol 0.2% 2-butanol 0.4% 2-butanol Do každé lahvičky tupým koncem párátka nabereme hrudku pylu zhruba velikosti poloviny skleněné špendlíkové hlavičky a pečlivě resuspendujeme v médiu. Na každou lahvičku použijeme čerstvé párátko. Lahvičku zavřeme parafilmem a umístíme na orbitální třepačku. Začneme měřit čas. Po 2-3 hodinách odebereme pipetou s ustřiženou špičkou vzorky suspenzí pylu na podložní sklíčka a pozorujeme přítomnost a vzhled láček a cyklózu (proudění cytoplasmy) v láčkách. Porovnáme délku a vzhled láček opůsobených 1-butanolem ve srovnání s 2-butanolem a kontrolou bez butanolu. Zhodnotíme výsledek experimentu a zaznamenáme jej do protokolu. 6