5. ineia reace enzyu se subsráe e paraery li ( ) a M, jejich ýzna odození ronice Michaelise a Menenoé eody sanoení paraerů MM ronice sofware pro enzyoou ineiu inegroaná fora MM ronice Rychlos ( ( ) cheicé reace A + B AB [A][B] jednoy rychlosi: ol l - s - ineicá rychlosní onsana, jednoy různr zné (s -, ol - l s - ) - a, aby ždy yšly sprán né jednoy pro rychlos b c a signál sar ěří se počáe eční rychlos (a) je sprán ně čas
Cheicá ronoáha A B [A][B] + AB [AB] ronoáha: [ A][B] [AB] ineicá ronoážná asociační onsana: ineicá ronoážná disociační onsana: A [AB] [A][B] [ A][B] D A [AB] Řád d reace a oleularia. řádu. řádu. řádu c c c nebo c A c B onooleulárn rní bioleulárn rní A A + B nebo A + A pseudoonooleulárn rní např.. A je oda A + B poud A >> B
Enzyoá reace rychlos záisz isí na oncenraci subsráu u poud se za obylých podíne ([E]( ~ nm, ~. až M) ěří ole 6 s, a spořeba subsráu u dosáhne pouze něoli n procen - počáe eční rychlos enzyoé reace Reace enzyu s jední subsráe e + S E ES E + P nejpre zniá oplex enzy-subsr subsrá ES, erý se následnn sledně rozpadá - buď za zniu produu, nebo zpě do ýchozího sau zajíá nás s rychlos zniu produu: znáe ale pouze ýchozí oncenrace [E] a, oncenraci [ES] neznáe předpolad: zni usálen leného sau d[es] (seady-sae), sae), dy se oncenrace ES čase neění (ale neíe, jaá je ); zaedli 95 Briggs a Haldane plaí, že e rychlos zniu ES je sejná jao rychlosi rozpadu: [ES] + 3
Je usálený sa oprán něný? ný? c (M) dc/ c/ (M/s) siulace: 6 M - s - - s - s - [E] - 7 M. M (s) po rá é přechodoé době ( s) ano aže po dosazení: zážen ení láoé bilance enzyu: osaosanění [ES]: [ E] [ES] [ES] + [ E] [E] [ES] ([ E] [ES] ) ( )[ES] [ES] ( )[ES] + [ E] + + ( + ) [ E] [ES] + [E] [E] [ES] + + + + a dosazení do ronice pro rychlos zniu produu: iáln lní rychlos [E] [ES] + + Michaelisoa onsana 4
poud je rozpad ES na produ liiující roe, j. plaí << -, a se blíží ýrazu - /, což je lasně disociační onsana D pro oplex ES (neplaí o ale přílip liš obecně ) Ronice Michaelise a Menenoé + 93 Leonor Michaelis a Maud Meneno oá položili zálady eorie reace enzyu se subsráe e pro dosááe úpraou / pro << plaí lineárn rní záislos ( / ) pro >> je rychlos onsanní (saurace enzyu subsráe) e) se časo nazýá ca poěr ca / reprezenuje specificiu daného enzyu, lasně á ýzna rychlosní onsany: ca [ E] 5
Záislos počáe eční rychlosi enzyoé reace na oncenraci subsráu u li li hyperbola (asypoy pro a - ) [,] M li liiní rychlos (občas alernaině) iáln lní rychlos ( -)( +) ronice hyperboly Enzyy a difuse 4πN ( D + D )( r + r dif A E S E S + pro ýraz / je liiující rychlos zniu oplexu ES, j. onsana a je zase liioána čenosí sráže ezi oleulai enzyu a subsráu, u, danou onsanou dif něeré enzyy dosahují aalyicého ia ) 6
Ja urči paraery MM ronice ze záislosi z počáe eční rychlosi na (počáe eční) ) oncenraci. 5. chyba.4 5.5. 6.4 8...6 3. 9.5.5 5. 3. 5 7. 3.9.6. 4.8. 5 naěř ěřená a znázorn zorněná daa lasicé "graficé" " eody ransforace MM ronice na ronici příy p ya+bx eoda dle Lineweaera a Bura - dojnásobný reciproý ýnos - přerácená MM ronice + + + y úse sěrnice x 7
Další ransforace Eadie a Hofsee (Scachard) [ S] Hanes a Woolf (reciproá MM ronice x ) + Woolf, Augusinson a Hofsee (recipro (reciproá MM x ) Příý ýnos (Cornish a Bowden) 5 paraery a odpoídaj dají -x-oé a y-oy oé souřadnici ediánu průse sečíů 5 5 8
Nelineárn rní regrese progray pro zpracoání ědecých da zadají se naěř ěřená daa, zadá se hodný odel progra určí paraery a, aby ypočen ená záislos byla co nejblíže e naěř ěřený daů (eoda nejenší ších čerců) přío ipleenoáno no enzyologicých prograech 5 5 Daa: Daa_C Model: Hyperbl Equaion: y P*x/(P + x) Chi^/DoF.47 R^.9876 P 9.547 ±.8686 P.86976 ±.38 9.5 ±.87.87 ±.3 5 Sofware pro enzy. ineiu Dynafi - NLLS analýza ineiy (enzy, che., ligand-recepor) - supní daa (,(, ),, nebo přío časoé záznayznay zadá se přío p odel procesu čen eně rychlosních onsan: Monoer + Monoer <> Enzye : Enzye + Inhibior <> Coplex : 3 4 Enzye + Subsrae <> ReacieX : 5 6 ReacieX --> > Produc + Enzye : 7 8 progra onsany určí,, pod Windows, na bázi b sripů aadeicá licence zdara hp://bioin.co/dynafi/index.hl 9
Enzye ineics!pro hp://www.chesw.co/69.h (3 USD, lze deo) další EZ-Fi hp://www.jlc.ne/~fperrell/webps4.h 5 USD Sysan - enzy. odul pro SigaPlo hp://www.sysa.co/downloads/?secd isualenzyics (SofZyics) hp://sofzyics.co/index.h - 35 USD Enzye Lab - iruáln lní enzyoá laboraoř,, J. Che. Educ. hp://jcheed.che.wisc.edu/jcesof/issues/series_d/5d/pro g-5d.hl "ádina" s pufre, enzye a subsráe, e, íchadlo a fooer INSIM (siulace) a FITSIM (hledání paraerů) hp://www.bioche.wusl.edu /cflab/essage.hl
Sronání eod jeden soubour naěř ěřených hodno (,)( byl yhodnocen různýi eodai, nalezené paraery: Meoda (uol l - in - ) (M) Lineweaer-Bur / - / Woolf, Augusinson, Hofsee, - / Hanes a Woolf / - Nelineárn rní regrese 9 ± 5 (5),3 ± 4,9 (4) 7,3 ± 5,4 () 5,4 ± 4, (6) zpracoání á li na přesnos p i sprános,9 ±,6 (55),7 ±,6 (35),6 ±,7 (7),33 ±,55 (4) dyž probíhá zpěn ná reace E + S eq ES E + P [ES] [E][P] [E] + [P] + + za ronoáhy : r [P] eq /, S s / M, P / / M, P Haldanů zah - souislos ezi erodynaiou a ineiou enzyoé aalysy, S [P] r s, S [P] +, S, P, P [P] +
dyž není onsanní úbye subsráu u průběhu ěř ěření nelze zanedba (>( cca 5%) - neěř ěří se počáe eční rychlos dyž reace běžb ěží ireerzibilně (neprobíhá zpěn ná reace), lze sledoa úbye oncenrace subsráu u - označí se x (plaí lasně x [P] při p i sechioerii :) sar x x sleduje se oninuáln lně oncenrace subsráu u (např. barený fooericy) reační sěsi si s enzye určiých ineralech se zaznaená jeho úbye ýslede ěř ěření - soubor hodno (( i, x i ) x čas Inegroaná MM ronice do MM zahu se dosadí auáln lní oncenrace subsráu u pro daný oaži: dx diferenciáln lní ronice, řeší se inegrací (separace proěnných, eze počáe [,] aža po obecně [,x]) x + dx x [ x ln([ S] x) + ] [ ] ln + x x ( x) + ( x) ln + [P] [P] alernainí fora, záěna z x [P]
Ineg. MM pro určenu ení paraerů proede se linearizace: ln x x dosae bodů se zísz sá průběhu jediného ěř ěření / -/ (sěrnice) (/)ln[( )/( -x)] Další apliace Ineg. MM - "pláno noání" " enzyoé reace - řešení oáze ypu za ja dlouho zreaguje požadoan adoaná čás subsráu, u, [,] oli enzyu se usí přída, aby za daný čas s danou aiiou a zreagoalo žádané nožs sí S - zah aiia a. rychlos: x/ Presacionárn rní ineia užiečná při řešení složi iějších echanisů [ S]([E] [ES]) d[p] d[es] [ES] [E] ( + + d [P] d[es] [E] ( + + d [P] d[p] + ( [ S] + + ) poud ons., a lze inegroa lag + + [ S] [P] [E] ) [ES] )[ES] prodlea 3