Biochemie krevních elementů II leukocyty a trombocyty, koagulace Josef Fontana
Obsah přednášky 1) Biochemie trombocytů a koagulace definice základních pojmů trombocyty přehled koagulačních faktorů tvorba trombu antikoagulační mechanismy fibrinolýza koagulační testy 2) Biochemie leukocytů (využití glukózy, tvorba reaktivních forem kyslíku a dusíku, proteolytické enzymy)
Hemostáza Fluidita (tekutost) krve a neporušený (a nesmáčivý) povrch endotelií jsou předpoklady plynulé cirkulace Poškození integrity cévního systému nastartuje hemostázu - zástavu krvácení Negativní efekt hemostázy: 1) na povrchu ateromových plátů se mohou tvořit krevní sraženiny tromby infarkt 2) dysbalance hemostázy u sepse, nádorů
Hemostáza x hemokoagulace Hemostáza je širší pojem zahrnuje všechny fáze zástavy krvácení: 1) reflexní vazokonstrikce 2) aktivace a agregace destiček tvorba primární zátky (překrytí rány) 3) vlastní hemokoagulace vytvoření fibrinové sítě (fixace krytí rány obvazem) 4) trombolýza (odstranění obvazu)
Hemostáza x hemokoagulace Hemokoagulace (srážení krve) je proces přeměny rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin Katalyzuje trombin Kaskáda koagulačních faktorů Vzájemná aktivace faktorů parciální proteolýzou
Destičky - trombocyty Bezjaderné fragmenty megakaryocytů 150-400 x 103 / µl Centrální zona s granuly granulomera a periferní světlejší hyalomera Hyalomera: invaginace membrány tvoří systém kanálků význam pro sekreci (obsahuje enzymy pro tvorbu eikosanoidů)
Destičky - trombocyty 3 typy granul: δ densní tělíska ATP, ADP, Ca2+ a serotonin α fibrinogen, PDGF, FGF, vwf, destičkový faktor 4 (fosfolipidy) λ lyzosomy Obsažené látky se uplatní při vazokonstrikci v místě poranění, hemokoagulaci a následné reparaci
Metabolismus trombocytů Bezjaderné žádná proteosyntéza Organely (MIT, GA) - intenzivní metabolismus Zdroj energie je glukóza - aerobní glykolýza Cytoplazma obsahuje mikrotubuly, aktin a myosin kontrakce destiček uvolnění obsahu granul, retrakce trombu Fosfolipidy nezbytné pro aktivaci některých koagulačních faktorů
Trombocyty a hemostáza Zodpovídají za primární hemostázu 1) Adheze: vazba na poraněním obnažený subendoteliální kolagen von Willebrandův faktor (vwf) váže kolagen a GP Ib (na destičkách) aktivace
Trombocyty a hemostáza 2) Aktivace destičky aktivuje obnažený kolagen, trombin, ADP, PAF, TXA2 exprese receptorů GP IIb/IIIa (až 100 000 na jednom trombocytu) sekrece aktivních látek - TXA2 změna tvaru (kontraktilní bílkoviny a cytoskelet) z diskovitého na ameboidní agregace
klidový stav aktivace
Trombocyty a hemostáza 3) Agregace destiček vlivem trombinu a dalších látek propojení díky fibrinogenu (aktivace destiček vede k expresi receptorů GP IIb/IIIa) 3a) Primární (reverzibilní) agregace nutná pro stále se tvořící skuliny v endotelu a zacelování malých defektů 3b) Sekundární (irreverzibilní) agregace je spojena s uvolňovací reakcí degranulací
Trombocyty a hemostáza 4) Degranulace - uvolňovací reakce sekrece obsahu granul 5) Tvorba bílého (destičkového) trombu (provizorní hemostatická zátka) rozpad a splynutí destiček viskózní metamorfóza 6) Propojení s koagulací exprese destičkových fosfolipidů (DF 3) na povrchu 7) Hojení poranění látky s proliferativními účinky PDGF (Platelet Derived Growth Factor)
Trombocyty a hemostáza Obrázek převzat z: http://patf.lf1.cuni.cz/stumat/hemostaza.pdf
Starý a nový model koagulace Starý model - porozumění in vitro měření kaskádovitá aktivace koagulačních faktorů vnitřní a vnější cesta, společná část zdůrazňuje význam vnitřního systému Nový (revidovaný) model - platí in vivo vychází ze starého modelu 3 fáze: iniciace, amplifikace a propagace klíčová role vnějšího systému a trombinu
Koagulační faktory Označované římskými číslicemi 1) serinové proteázy 2) bílkoviny sloužící jako kofaktory 3) Ca 2+ 4) fibrinogen 5) transglutamináza f. XIII
Koagulační faktory I fibrinogen VIII antihemofilický II protrombin*1) IX Christmasův*1) III tkáňový tromboplastin X Stuart-Prowerové*1) IV vápenaté ionty XI PTA1) V proakcelerin XII Hagemanův1) VII prokonvertin*1) XIII fibrin stabilizující * vitamin K dependentní faktory 1) proteázový zymogen
Vitamin K dependentní faktory Faktory II, VII, IX a X a antikoagulační faktory protein C a S Tvorba v játrech (neaktivní zymogeny) Karboxylace 10 12 zbytků kyseliny glutamové na γ-uhlíku vzniká γkarboxyglutamát (Gla) Gla váže Ca2+ - připoutání faktorů k fosfolipidům membrány
Hemokoagulace má 2 fáze 1) Aktivace protrombinu na trombin a) vnitřní cestou b) zevní cestou Obě cesty se spojují v místě faktoru X 2) Společná fáze tvorba nerozpustného fibrinu a jeho stabilizace
The in vitro contact system (intrinsic pathway) The in vivo pathway (extrinsic pathway) Contact Tissue damage (e.g. with endoth) Tissue factor VIIa PL Ca2+ XIIa XIa IXa XI Platelets IX VIIIa, PL, Ca2+ X + + Xa Va, PL, Ca2+ II (Prothrombin XII + XIII Ca2+ IIa (Thrombin) XIIIa Fibrinogen Fibrin Stabilised fibrin
Zevní cesta (extrinsic pathway) Iniciována vyplavením tkáňového tromboplastinu (f. III, tkáňový faktor) Směs proteinů a fosfolipidů uvolněných z poškozených buněk, popř. ho exprimují aktivované endotelie a leukocyty Rychlý nástup hemokoagulace - za 12 sekund po přidání in vitro Tkáňový faktor aktivuje faktor VII na VIIa
Zevní cesta (extrinsic pathway) TF-VIIa s fosfolipidy a Ca2+ tvoří vnější tenázu aktivace f. X na Xa VIIa aktivuje i faktor IX z vnitřní cesty Zevní cesta je důležitá pro začátek krevního srážení Pro amplifikaci hemokoagulace je důležitá vnitřní cesta
Vnitřní cesta (intrinsic pathway) Zahájena kontaktní fází Negativně nabitý povrch poraněním obnažený kolagen a membrány trombocytů Vazba faktoru XII přeměna na XIIa XIIa přeměňuje prekalikrein na kalikrein (za přítomnosti vysokomolekulárního kininogenu HMWK) Kalikrein posiluje přeměnu f. XII na XIIa pozitivní zpětná vazba!
Vnitřní cesta (intrinsic pathway) XIIa aktivuje faktor XI XIa aktivuje faktor IX Faktor IX je aktivován i zevním systémem IXa je součástí vnitřního tenasového komplexu
Vnitřní tenasový komplex 1) substrát f. X 2) enzym f. IXa 3) kofaktory enzymu VIIIa, destičkové fosfolipidy a Ca2+ Faktor VIII se aktivuje trombinem Produktem tenasového komplexu je Xa Xa se stává součástí analogického protrombinasového komplexu
Protrombinasový komplex 1) substrát protrombin (f. II) 2) enzym f. Xa 3) kofaktory enzymu Va, destičkové fosfolipidy a Ca2+ Faktor V opět aktivován trombinem Produktem protrombinasového komplexu je trombin
Trombin Centrální postavení v celé hemostáze koagulaci, antikoagulaci, regulaci fibrinolýzy i aktivaci celulárních složek Štěpí fibrinogen na fibrin
Trombin aktivuje Destičky a endotelie Neutrofily i monocyty exprese TF Faktor XIII stabilizace fibrinové sítě Faktory V, VIII a XI amplifikace koagulace Protein C (předtím nutná vazba trombin trombomodulin) antikoagulace TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) (předtím nutná vazba trombin trombomodulin) inhibice fibrinolýzy
Jak je to ve skutečnosti Třífázový model hemokoagulace: Iniciace Amplifikace Propagace
Iniciace Koagulaci startuje tkáňový faktor (TF) a VIIa Malé množství VIIa stále přítomno v krvi setkání s TF (uvolněn při poranění, zánětu) VIIa autoaktivuje další molekuly f. VII Komplex TF-VIIa aktivuje f. IX a f. X Xa aktivuje další molekuly f. VII a generuje vznik malého množství trombinu nestačí k tvorbě fibrinového koagula přebírá ale vedení koagulace fáze amplifikace
Amplifikace Trombin aktivuje f. V, VIII, XI XIa aktivuje další molekuly f. IX IXa Trombin aktivuje trombocyty a leukocyty exprese negativně nabitých fosfolipidů na povrchu vazba IXa, VIIIa a Va Trombin aktivuje endotelie přeladění do prokoagulačního stavu
Amplifikace - výsledek vznik většího množství trombinu vytvoření reakčních povrchů s navázanými molekulami aktivovaných faktorů pro komplementaci komplexů vnitřní tenázy a protrombinázy
Propagace Vazba f. X na komplex vnitřní tenázy (IXa a VIIIa) Xa Xa vytvoří s Va komplex protrombinázy mohutná produkce trombinu trombin burst dostačuje k přeměně fibrinogenu na fibrin Nestabilní fibrin je stabilizován působením XIIIa
Fibrinogen Složen ze 3 globulárních domén (2 periferní - D a jedna centrální - E) Domény vzájemné spojeny 2 tyčinkami trojitými šroubovicemi (α, β, γ) 2 peptidové ocásky na centrální doméně fibrinopeptidy A a B (z α, β šroubovice) Trombin odštěpuje oba fibrinopeptidy vzniká fibrin-monomer spontánní polymerace fibrin-polymer
Zpevnění fibrinové sítě Nezpevněná síť není odolná pouze nekovalentní vazby riziko depolymerace Faktor XIII aktivován trombinem a Ca2+ XIIIa je transglutamináza - tvorba kovalentní příčné vazby mezi α a γ řetězci fibrinu Amidový zbytek glutaminu reaguje s NH2skupinou lysinu tvorba γ-glutamyl-ε-lysyl můstku a uvolnění amoniaku Zpevněná síť snese tlak krve
Zpevnění fibrinové sítě Obrázek převzat z http://oregonstate.edu/instruction/bb450/fall2011/stryer6/ch10/unnumberedfigurepg294.jpg
Koagulace je složitě regulována Rovnováha prokoagulačních a antikoagulačních dějů Hlavní antikoagulační faktory: 1) proud krve 2) produkty intaktního endotelu prostacyklin, NO a trombomodulin 3) antitrombin III 4) Protein C a protein S
Antithrombin III (AT III) α2-globulin, nejdůležitější inhibitor Patří mezi serpiny: inhibitory serinových proteáz Váže trombin, IXa, Xa, XIa a XIIa inaktivace faktorů Heparin (sulfatovaný glykosaminoglykan) zvyšuje schopnost AT III vázat faktory Vrozený deficit AT III trombofilní stav
Protein C a protein S Závislé na vitaminu K Protein S je kofaktorem proteinu C Protein C je aktivován komplexem endoteliálního trombomodulinu s trombinem aktivní protein C (APC) Po vazbě na fosfolipidy štěpí APC neenzymatické faktory Va a VIIIa Bez Va a VIIIa jsou nefunkční komplexy vnitřní tenasový i protrombinasový
Leidenská mutace faktoru V Mutací mizí jedno z důležitých štěpných míst pro APC Prodloužení poločasu Va Nejčastější vrozený trombofilní stav Pozor na kombinaci s dalšími prokoagulačními faktory hormonální antikoncepce, kouření
Antikoagulační látky v medicíně 1) Vyvázání Ca2+ - užití jen in vitro, odběr nesrážlivé krve citrát, EDTA (kys. Ethylendiaminotetraoctová) nebo oxalát 2) Heparin posiluje AT III vyvazuje trombin 3) Analoga vitaminu K - kumarinové preparáty (warfarin, pelentan) blok posttranslačních úprav závislých na vitaminu K (f. II, VII, IX, X, proteiny C a S)
Vrozené defekty koagulace Hemofilie A: XR, defektní syntéza f. VIII Podávání rekombinantního f. VIII Panovnické rody (potomci královny Viktorie, Romanovci) Hemofilie B: XR, defekt f. IX Hemofilie C: AR, nedostatek f. XI von Willebrandova nemoc: defekt vwf Nedostatečná adheze destiček a porucha funkce f. VIII
Fibrinolýza (trombolýza) Koagulum musí mít jen omezenou životnost Plasmin štěpí fibrin na rozpustné fibrin degradační produkty (Ddimery) Serinová proteáza specifická pro fibrin a fibrinogen Vzniká z plasminogenu
Fibrin degradační produkty (Ddimery)
Obrázek převzat z:http://en.wikipedia.org/wiki/plasminogen_activator_inhibitor-1
Měření hemokoagulace Vnitřní cesta: aptt (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) norma 26-50s Vnější cesta: 1) Quick test 14s = 100% 2) INR (International normalized ratio) = 80-120%
Leukocyty Granulocyty: neutrofily, eozinofily, bazofily Agranulocyty: monocyty makrofágy, lymfocyty (B, T) 4-9 x 103 / μl Leukocyty 47-75 % Neutrofily 1-4 % Eozinofily 0-1 % Bazofily 23-45 % Lymfocyty 2-11 % Monocyty
Reaktivní formy kyslíku (ROS) a dusíku (RNS) v krvinkách Erytrocyty: enzymy zajišťující deaktivaci ROS, vznikajících díky vysoké intracelulární koncentraci kyslíku Fagocyty: enzymy zajišťující produkci ROS a RNS, určených k ničení fagocytovaných částic
Neutrofily Vysoký obsah lyzosomů (hydrolázy) Málo mitochondrií Závislé na glukóze: produkce NADPH NADPH slouží k produkci reaktivních forem kyslíku zabíjení bakterií Po aktivaci: respirační vzplanutí zvýšená spotřeba O2 a glukózy
Produkce ROS v neutrofilech ClOObrázek převzat z http://courses.washington.edu/conj/bloodcells/radicals.gif (březen 2007)
Produkce NO v neutrofilech syntáza oxidu dusnatého NOS i Obrázek převzat z http://www.pigur.co.il/imgpku/no_synthesis.gif (březen 2007)
Proteázy a antiproteázy Proteolytické enzymy: elastáza, kolagenáza, katepsin G produkované fagocyty Inhibitory proteáz: α1-antitrypsin, α1antichymotrypsin, α2-makroglobulin plazmatické proteiny Poměr proteázy / antiproteázy má vliv na míru zánětu
Basofily obsahují heparin a histamin Negativně nabité funkční skupiny kyselý charakter Obrázky převzaty z http://life.nthu.edu.tw/~lslpc/biophytalk/heparin01.jpg a http://www.nottingham.ac.uk/~mqzwww/images/histamine.gif (březen 2007)