BENZO[a]PYREN, JEHO ZDRAVOTNÍ DOPADY A ZNEČIŠTĚNÍ NA OSTRAVSKU R. J. Sram Ústav experimentální mediciny AV ČR, Praha (sram@biomed.cas.cz) ARNIKA, Praha, 27. 11. 2013
AIR PARTICLES (< 10 µm) (Filtres from HiVol Samplers -Winter, Summer) DNA binding activities in vitroacellularassay 32 P -postlabelingand HPLC analysisofdnaadducts R. J. Sram 2013 Binkova et al. 1999
CONTRIBUTION OF THE MAJOR PAH-DNA ADDUCTS TO THE TOTAL DNA ADDUCTS LEVEL FROM URBAN SAMPLES PAH-DNA adducts derivedfrom 9-OH-B[a]P anti -BPDE B[b]F B[k]F B[j]F CHRY B[a]A I[c,d]P R. J. Sram 2013 Totalradioactivity fromalldna adducts detected approx. 50 % (Binkova et al. 1999)
B[a]P 2012
AIR POLLUTION 2012 (CHMI) Locality PM10 µg/m 3 PM2.5µg/m 3 B[a]P ng/m 3 Ostrava-Poruba 35.1±31.2 27.3±27.6 3.3±5.0 Ostrava-Radvanice 49.5±40.3 39.4±31.2 10.8±13.7 Karvina 45.8±44.7 X 8.2±11.1 Havirov 44.3±43.7 X X Prague-Smichov 30.2±15.6 14.8±8.8 X Prague-Libus 27.8±14.5 17.3±12.6 1.1±1.5 Ceske Budejovice 22.8±16.0 18.6±13.7 1.7±2.0 x -not measured R. J. Sram2013
VÝZNAM k-pau VE ZNEČIŠTĚNÉM OVZDUŠÍ výsledky plodnost respirační kardiovaskulární těhotenství mužů nemocnost dětí, onemocnění, (IUGR, LBW, psychický cukrovka, působí jako ED) vývoj nádory RIZIKO PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ R.J.Sram 2013
MECHANISM OF CARCINOGENIC ACTION OF PAHs Rundle, 2006
HUMAN STUDIES AND BIOMARKERS OF EXPOSURE, EFFECT AND SUSCEPTIBILITY PM2.5 Stationary monitoring DNA adducts by 32 P-postlabeling c-pahspersonalmonitoring Stationary monitoring VOC Cotinine Personal monitoring Stationary monitoring Triglycerids, Total, HDL and LDL cholesterol Chromosomal aberrations FISH, Oxidative damage micronuclei 8-oxodG, 15-F2T-isoP, proteins Genetic polymorphisms Gene expression VitaminsA, C, E R. J. Sram2013
PERSONAL MONITORING IN PRAGUE R.J. Sram 2013 (foto Ludvik Hradilek, Aktualne.cz)
AUTORADIOGRAPHS OF THIN LAYER CHROMATOGRAMS WITH DNA ADDUCTS PATTERN OF: DNA isolated from lymphocytes of subject sampled in January 2004 (1st sampling period) Water blank Positive control (DNA isolated from the lung of rats intraperitoneallytreated with 100 mg B[a]P/kg b.w.) R. J. Sram2013
CYTOGENETIC ANALYSIS FISH analysis R. J. Sram2013 t(ab);t(ab);t(ba) Three translocations betweenchromosome 1 andunpaintedchromosomes
R. J. Sram2013
R. J. Sram2013 MICRONUCLEI
R. J. Sram2013
REACTIVE OXYGEN SPECIES Endogenous sources Exogenous sources O 2 - SOD H 2 O 2 Catalase H 2 O + O 2 OH H 2 O R. J. Sram2013 Lipid peroxidation DNA oxidation Protein oxidation
Driven by: Pathway-1 surface reactivity OC-L PM Surface Reactivity Pathway-2 organiccompounds Phase I (Cyp1a1 ) OC-H PM ROS Oxidative Effect ROS Bioactivation Biotransformation ROS NFkB API Phase II (Gst, Ngo1 ) Conjugation Phase III Elimination R. J. Sram2013 Proinflammatoryresponse
100 SCSA -Acridine Orange Stained DNA Native DNA Stainability (green fluorescence) R. J. Sram2013 0 100 Fragmented DNA (red fluorescence)
? VÝSLEDKY MOLEKULÁRNĚ EPIDEMIOLOGICKÝCH STUDIÍ (genomová frekvence translokací-fish, mikrojadérka, fragmentace DNA ve spermiích) koncentrace >1 ng B[a]P/m 3 v ovzduší RIZIKO PRO LIDSKÉ ZDRAVÍ (WHO Bonn 6. 11. 2009) R. J. Sram 2013
Znečištěné ovzduší při koncentraci > 1 ng B[a]P/m 3 DNA adukty 32-postlabelling Genomovou frekvenci translokací Frekvenci jadérek Fragmentaci DNA ve spermiích R. J. Sram 2013
R. J. Sram 2013 VLIV ZNEČIŠTĚNÉHO OVZDUŠÍ NA VÝSLEDKY V TĚHOTENSTVÍ
PREGNANCY OUTCOME -RISK OF c-pahs AMBIENT EXPOSURE to15 ngc-pahs/m 3 /month (2.8 ngb[a]p/m 3 ) INDOOR EXPOSURE (50-60%) approximately to 9 ngc-pahs/m 3 /month (1.7 ngb[a]p/m 3 ) R. J. Sram 2013
DŮSLEDKY IUGR Dětská úmrtnost Dětská nemocnost Zpoždění vývoje Cukrovka Hypertenze Ischemická choroba srdeční R.J.Sram 2013
VLIV B[a]P NA EXPRESI GENŮ V TĚHOTENSTVÍ R. J. Sram 2013
Vývoj koncentrací polutantů (měsíce) B[a]P benzen 7 4 B[a]P (ng/m 3 ) 6 5 4 3 2 1 benzen (µg/m 3 ) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112 0 1 3 5 7 9 11 1 3 5 7 9 11 2008 2009 2008 2009 PM2.5 (µg/m 3 ) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 3 5 7 9 11 1 3 5 7 9 11 PM2.5 Praha České Budějovice R. J. Sram 2013 2008 2009
Výsledky stanovení DNA aduktů v žilní a pupečníkové krvi a v placentě (Porovnání -Praha a České Budějovice) Žilní krev matky Pupečníková krev Placenta Adukty/10 8 nukl. N Průměr ± S.D. B[a]P-like Celkové B[a]P-like Průměr ± S.D. Celkové Průměr ± S.D. B[a]P-like Celkové Praha 80 0.24±0.18 1.23±1.09 0.23±0.18 0.98±0.89 0.24±0.18 1.15±1.06 Čes. Budějovice 76 0.44*±0.39 1.59*±1.46 0.41*±0.41 1.40*±1.31 0.54*±0.48 1.94* #±1.46 R. J. Sram 2013 *p<0.001 významně vyššíhladiny celkových i tzv. B[a]P specifických DNA aduktů ve všech tkáních byly nalezeny u matek a dětí z Českých Budějovic #p<0.001 významně vyšší hladiny hladiny DNA aduktů v placentě než v žilní a pupečníkové krvi u matek a dětí z Českých Budějovic
MICRONUCLEI IN NEWBORNS PRAGUE (86) 2.17 MN/1000 BC CESKE BUDEJOVICE (92) 3.82 MN/1000 BC TOWN (40) 3.45 MN/1000 BC VILLAGES (52) 4.11 MN/1000 BC R. J. Sram 2013
Microarray analýza genové exprese -metodika Odběr vzorků -stabilizace expresního profilu (RNAlater, PAX system, LeukoLOCK) Izolace RNA a ověření kvality (Agilent Bioanalyzer) Gene expression profiling -přepis RNA do crna (Ambion) -hybridizace na HumanRef-8 Expression -skenování (Illumina ArrayReader) BeadArrays Statistická analýza dat (Illumina BeadStudio Software, R program) R. J. Sram 2013
Změny v transkriptomutěhotných žen v Praze vs. Českých Budějovicích Soubor: 35 nekuřaček z Prahy vs. 52 nekuřaček z Č. Budějovic -periferníkrev (PB), placenta(pl), pupečníkovákrev (UCB) Množství polycyklických aromatických uhlovodíků v ovzduší v Praze se začíná významně snižovat ZvýšenáhladinaDNA aduktů vevšech typechtkánímatekzč. Budějovic vporovnánísprahou Vyššíhladinaperoxidovaných lipidů u vzorků zprahy Cíl: srovnáníexpresních profilů vzorků PB, PL a UCB získaných odtěhotných žen zobou lokalit vzhledemkodlišnému působenígenotoxickýchlátekvtěchto lokalitách R. J. Sram 2013
DEREGULATION OF GENES Cord blood Change: 104 genes 37 67 CB Increased expression incb: genes related to metabolism of xenobiotics Decreased expression incb genes related to immuneresponse andautoimmunediseases
ZÁVĚRY 1. Detekce zvýšené exprese genů spojených s působením genotoxickýchlátek ve všech tkáních z ČB je v souladu s vyšší expozicí genotoxickýmlátkám naměřenou v této lokalitě. vysoká míra tkáňové specifity (zejména u pupečníkové krve) opačný trend deregulace některých buněčných drah mezi vzorky periferní a pupečníkové krve (specifické imunitní procesy a snimi asociované autoimunitní choroby aktivované u periferní a naopak suprimované u pupečníkové krve z ČB Periferní krev 384 7 27 0 91 Placenta 6 Pupečníková krev 1137 2.Vysokýpočetgenů detekovanýuplanaopaknízkýuucb,malýpřekryvderegulovanýchgenů mezi UCB a ostatními tkáněmi a opačná regulace imunitních procesů jsou známky, které poukazujíalespoň na částečnou detoxifikačnífunkciplacenty. R. J. Sram 2013
GAMETICKÉ MUTACE R. J. Sram 2013
POŠKOZENÍ GENOMU POČÁTEK NEMOCI NUTNOST PREVENCE! R. J. Sram 2013
PROGRAM OSTRAVA VÝSLEDKY VÝZKUMU
40
R.J.Sram 2013
ZDRAVOTNÍ STAV U DĚTÍ R. J. Sram 2013
Z. horních cest dýchacích + průdušek +hrtanu a průdušnice + plic + angína + z. středního ucha Incidence/dítě 7 6 5 4 3 2 1 1 st 2 nd 3 rd 4 th 5 th 6 th roky M.O. (413) Hrab. (595) Zábř. (348) Por. (313) R. a B. (154) roky R.J.Sram 2013
ASTHMA BRONCHIALE U DĚTÍ R. J. Sram 2013
Comparison of no asthma vs. asthma t-test results In the Venn diagrams shown below, the t-test results obtained using all experiments either with a p-value cutoff of 0.01 or a p-value cutoff of 0.01 and at least a 1.5 fold change are compared no asthma vs. asthma P-value 0.01 P-value 0.01 fold change 1.5 no asthma vs. asthma control region no asthma vs. asthma no asthma vs. asthma control region genes specific for asthma in Prachatice no asthma vs. asthma Ostrava genes specific for asthma in Ostrava no asthma vs. asthma Ostrava no genes common for both regions R. J. Sram 2013
Souhrn Asthma bronchiale na Prachaticku -alergický typ astmatu, odpověď na alergen. Asthma bronchiale vostravě -nealergický typ astmatu, vyvolán iritanty - znečištěné ovzduší, ETS, virové infekce. R. J. Sram 2013
Znečištěné ovzduší ovlivňuje metylaci DNA u dětí Studované skupiny Celkem 200 dětí (7-15 let): -100 - Ostrava Bartovice a Radvanice -100 Prachaticko -odběr krve - březen 2010 Znečištění B(a)P 3/2010 -stacionární monitoring: 10.1 ng/m 3 1.8 ng/m 3 Výsledky - Analýza 27 578 metylovaných míst ve více než 14 000 genech - 9 916 míst bylo rozdílně metylovaných
PERSONÁLNÍ ODBĚRY OSTRAVSKO 11. 28. 1. 2010 B[a]P 14.6 ng/m 3 R. J. Sram 2013
Koncentrace B[a]P ze stacionárního měření HiVol v Ostravě, Karviné, Praze a Třeboni ng/m 3 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1/2010 Ostrava-Bartovice 12/2009 Karviná 3/2010 Ostrava-Poruba 2/2010 Praha-Libuš (PM10) 12/2009 Třeboň 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 dny R. J. Sram 2013
PROGRAM OSTRAVA -NOVÉ POZNATKY Adaptivní odpověď lidského organismu na zátěž k-pau ze znečištěného ovzduší Jako reakce na znečištění ovzduší jsou u Ostravanů exprimované specifické geny, které přispívají se snížení negativního dopadu znečištění na genetický materiál (adaptivní odpověď). Rozdílná exprese genů u dobrovolníků v Ostravě a Praze může naznačovat i rozdílné spektrum znečišťujících látek. Naše laboratoř jako první ukázala, že lidský organismus je schopen reagovat na velmi vysoké koncentrace k-pau adalších škodlivých látek adaptivní odpovědí, která je však zdlouhodobého hlediska proorganismusškodlivá. R. J. Sram 2013
ArcelorMittal, Hamilton Canada kpau 1 16 ng/m 3 (B[a]P 0.2 2 ng/m 3 ) R. J. Sram 2013
R. J. Sram 2013
ZNEČIŠTĚNÍ OVZDUŠÍ V ČR (HODNOCENÍ RIZIKA) 1) 2) 3) 4) Koncentrace B[a]P > 1 ng/m 3 /rok(standard EU) jsou dlouhodobě překračovány u 60% populace ČR Proto lze zátěž populace B[a]Ppovažovat za nejvýznamnější riziko znečištěným ovzduším v ČR Pro většinu oblastí ČR představují největší zátěž B[a]Plokální topeniště, v Prazedoprava, pro MSK průmyslové zdroje Zdravotní rizika znečištěného ovzduší na zdraví populace by měla být hodnocena dle koncentrace B[a]P a nikoliv PM10 R.J.Sram 2013
ZNEČIŠTĚNÍ OVZDUŠÍ V ČR (HODNOCENÍ RIZIKA) 5) 6) 7) 8) Novým poznatkem jsou výsledky, které prokazují vliv B[a]Pna deregulaci genů u novorozenců (specificky genů ovlivňujících imunitu) Prokázaným důsledkem současného znečištění ovzduší je zvýšená nemocnost dětí předškolního věku, asthma bronchiale u dětí a kardiovaskulární úmrtnosti Zvýšené koncentrace B[a]Pbudou nepříznivě ovlivňovat současné a příští generace Proto by měl být přijat komplexní výzkumný program, který bude analyzovat vliv znečištěného ovzduší na populaci Moravskoslezského a Ústeckého kraje a navrhnout opatření, která by mohla zátěž populace snížit R.J.Sram 2013
PODĚKOVÁNÍ Podpořeno granty MŽP ČR Projekt AIRGEN (SP/1b3/8/08) MŠMT ČR Projekt ENVIRONGEN (2B06088) GAČR #P503/11/0084 GAČR #P30113-13458S R.J.Sram 2013