15. Základy molekulární biologie DNA je zkratka pro kyselinu deoxyribonukleovou, která je nositelkou genetické informace všech živých buněčných organismů. Je tedy nezbytná pro život pomocí svých informací ovlivňuje buňky a tím předurčuje vývoj a vlastnosti organismu. Na tento objev (že DNA souvisí s nukleovými kyselinami) se přicházelo velmi dlouho. Otázkou bylo, kde DNA sídlí? Co způsobuje dědičnost? Po první Světové válce se snažil bakteriolog Frederick Griffith vyrobit vakcínu proti bakterii, která způsobovala těžké zápaly plic, Streptococcus pneumonie. Provedl Bakteriologický pokus: Bakterie má dva kmeny patogenní (které rozpoutávají nemoc) a nepatogenní (nerozpoutávají nemoc). Griffith smíchal mrtvé, uvařené patogenní bakterie se zdravými nepatogenními a pomocí injekce je aplikoval laboratorní myši ta zemřela. V srdci jí nalezli patogenní bakterie to je důkaz, že DNA nemůže být ukryta v bílkovinách, jelikož ty se denaturují vysokými teplotami.
Experiment dotáhli a podpořili Alfred Hershey a Marta Chaseová v roce 1952, kteří pro změnu pracovali s viry (bakteriofágy). Pomocí radioaktivního fosforu kultivovali DNA viru a pomocí radioaktivní síry kultivovali proteiny viru. Poté virem infikovali bakterie. Ty byly dány do odstředivky a s její pomocí vědci rozdělili prázdné kapsule viru z povrchu bakterií. Tělíčka bakterií zůstala dole, veškerá radioaktivita síry byla v roztoku, naopak radioaktivita fosforu zůstala v tělech bakterií. Z toho vyplývá, že nositelkou dědičné informace musí být DNA. Otázkou však zůstávalo, jaká je její chemická struktura. Na toto se snažili přijít vědci James D. Watson a Francis Crick. A byli úspěšní. V roce 1953 navrhli první možnou strukturu DNA, která se pak ukázala jako pravdivá. Stavěli na tom, co již věděli: Štěpením DNA vzniká nukleoacid (NA), který se skládá z pětiuhlíkového cukru (ribóza je pětiuhlíkový sacharid), z fosforečnanů a kyseliny fosforečné (= z fosfátu) a z dusíkaté báze. Cukr a fosfát jsou ve všech nukleotidech stejné, ovšem báze mohla být tvořena kteroukoliv ze 4 struktur: Adenin, guanin, thymin a cytosin. Začali tedy stavět na stálých strukturách, tedy na cukru a fosfátu. Z toho zároveň vyplynulo, že báze mohou být v DNA v jakémkoliv pořadí, aniž by to DNA ovlivnilo, jelikož ony nejsou zodpovědné za kostru, která ji drží pohromadě. Vytvořili k tomu schéma nazývané CUKR- FOSFÁTOVÁ PÁTEŘ, které se později ukázalo jako pravdivé. Cukr-fosfátová páteř je jako kostra držící DNA pohromadě a proměnlivé dusíkaté báze mohou nést rozdílné informace na ní. Pravidla dusíkatých bází : Adenin a guanin jsou tzv. purinové báze Cytosin a thymin jsou tzv. pyrimidinové báze Z pravidla se na sebe váže vždy jedna purinová a jedna pyrimidinová báze Adenin + Thymin; Guanin + Cytosin dvojice jsou navzájem komplementární navzájem se doplňují, podobně jako barvy Mezi párovanými bázemi bývá vždy slabší chemická vazba
Cukr-fosfátová páteř P (Fosfáty) a S (Cukry) tvoří vnější kostru; báze tvoří vnitřní komplementární pás U MATURITY BÝVÁ ČASTO PÁS PÍSMENEK,KTERÉ SE MUSÍ KOMPLEMENTÁRNĚ DOPLNIT! Báze uracilu bývá pouze u RNA místo thyminu při transkripci (o tom později). CF-páteř je vlákno, jehož konce jsou strukturně a kvalitativně jiné dá se rozpoznat začátek a konec: 3 -------- >> 5 5 --------- >>3
Replikace DNA Replikace je kopírování molekuly DNA. Genetická informace se přenáší z jedné molekuly do jiné molekuly stejného typu. Každá replikovaná molekula má jeden řetězec z původní molekuly (mateřské vlákno) a jeden nový to znamená, že proces je SEMIKONZERVATIVNÍ. Při replikaci dochází k řazení deoxyribonukleotidů (základní stavební částice DNA, tvořeny dusíkatými bázemi, cukru deoxyribózy a fosfátu) za pomocí složitého mechanického postupu do stejného pořadí jako v původní molekule v důsledku toho je pak kompletní DNA daného organismu prakticky totožná s tou původní. Nukleosintrifosfáty (nukleotidy) Základní staveb. složky DNA ATP adenosintrifosfát GTP guanosintrifosfát CTP cytosintrifosfát TTP thymidintrifosfát (UTP uridintrifosfát u RNA) Volně se pohybují v našem těle přeměňují se z potravy, kterou přijímáme, a syntetizuje se z nich NA nukleová kyselina. Syntéza nového vlákna ovšem může probíhat jen ve směru 3 -> 5
Do procesu kopírování je zapojeno mnoho enzymů: Především je to DNA polymeráza v replikační vidlici správně přiřazuje a vkládá nukleotidy a tím prodlužuje řetězec; také urychluje reakci DNA Helikáza rozmotává šroubovici DNA Ligáza enzym spojující Okazakiho fragmenty (úseky nově replikované DNA, které se tvoří na opožděném řetězci, a po odstranění RNA primeru, jsou pospojovány v jeden řetězec). DNA Primáza syntetizuje začátky DNA Topoizomeráza při replikaci dohlíží na to, aby při rozmotávání vidlice helikázou nedocházelo k přílišnému utažení zbývajícího vlákna natolik, že by pak nešlo rozmotat. - Nejdříve se tedy rozplete dvoušroubovice, vznikne replikační vidlice a naváže se enzymatický komplex. - Poté se přidají nukleotidy a replikační vidlice postupuje, tím replikace končí - TOTO VŠE SE DĚJE V JÁDŘE JEDNÉ BUŇKY. V jádru buňky se DNA může přepsat na RNA proces zvaný transkripce (přepis). Informace se přeloží ze 4 písmenek na 21 translace na ribozomech buňky. Transkripce - Je to tedy proces, při kterém se DNA mění na RNA. To většinou bývá jen přestupným krokem k tomu, aby z genetického materiálu vznikly bílkoviny; ovšem je i několik nekódujících RNA, které vznikají z DNA, a bílkovina z nich nikdy nevznikne. DNA > RNA -> protein - U eukaryot (vyšší organizmy) probíhá v jádře, u prokaryot (bakterie, viry ad) probíha v cytoplazmě. - Je velmi podobná replikaci RNA polymeráza se posouvá a dělá přepis, vytváří RNA vlákno = doplňující polovinu poly-rna. - Thymin (T) se mění na Urin (U), tzn. že např. řetězec A-T-C-G-G se změní na (U-A-G-C-G)
- Existuje tzv. reverzní transkripce příklad: HIV virus obsahuje informaci v RNA, potřebuje ovlivnit domácí buňku v DNA tudíž přepíše svou informaci obráceně Bakterie (Prokaryota) ---------------------------------------- m-rna Promotor gen terminátor Promotor je úsek DNA, na kterém začíná RNA polymeráza syntetizovat řetězec Gen je informace o proteinu. Jen na něm probíha syntéza Terminátor je na konci syntézy. Eukaryota (napr. Člověk) ----------------------------------------------------------------------- pre-m-rna Promotor exon I Intron I exom II introm II exom III terminátor - Mezi geny jsou introny, které vlastně neobsahují smysluplnou informaci, takže jsou v řetězci k ničemu. Přitom obsazují zhruba 90% strukturních genů. Říká se o nich, že jsou beze smyslu. - Proto se odstraní, vystřihnou, jevem, kterému se říká Splicing. Vznikne tedy souvislý gen s informací o proteinu vznikne m-rna jako u prokarií. - m-rna znamená Message-RNA poslíček, informační RNA Translace - je to přenos genetického kódu mrna do pořadí aminokyselin v polypeptidovém vláknu, zjednodušeně na protein. - Při stavbě bílkoviny je velmi důležité, jak jsou aminokyseliny poskládané za sebou. - Každá trojice bází kóduje jednu aminokyselinu = kodon - Báze jsou 4, takže možností je 4x4x4 = 64. Aminokyselin máme pouze 21, tudíž více tripletů (3-místných kodonů) může označovat jednu aminokyselinu. - K určení druhu aminokyselin máme tento príma slovníček 1. písmeno je uprostřed, s dalšími písmeny kodonu se jde ven.
- AUG startovací kodon, který zároveň kóduje methionin jedna z aminokyselin - URA, UGA a AUG znamená stop - Translace tedy probíhá v ribozomech: - t-rna je tj. transferová-rna, přenáší správné aminokyseliny do ribozomu - za připojení správné aminokyseliny na správné t-rna zodpovídá enzym jménem aminoacid = t-rna syntéza - Proteosyntéza: t-rna se naváže na malou podjednotku a jede od 5 do konce, než najde iniciační kodon AUG. Poté nasedají další t-rna podle komplementarity. Mezi přenesenými aminokyselinami vznikají peptidové vazby. Jakmile zbývá jen kodon beze smyslu, je proteosyntéza ukončena a vzniklé polypeptidové vlákno může být v buňce dále upravováno na požadovanou bílkovinu pomocí ribozomů nebo v Golgiho systému. -
PCR (polymerázová řetězová reakce) - Množení DNA pro vědecké účely - Toho, co dělá helikáza, dosahují vědci vysokou teplotou. Rozvolňují DNA na dva řetězce zahřátím. Potřebujeme: - Termostabilní DNA polymeráza lidé použili bakterie žijící v pramenech o teplotě 70 - V laboratoří se provádí syntéza kratičkých sekvencí jako primerů - nukleotidy (cukr+báze+fosfát) - Smícháme, cyklicky zahříváme a chladíme ve stroji zvaném termocykler - Vytváří se ohromné množství vláken ze dvou se po třiceti zahřátích vyrobí až 2 30 molekul produktu. DNA sekvenování - čtení DNA - Do čtyř nádob dáme DNA vzorek + ingredience jako v PCR - Nemají na konci OH, nemají na konci OH, tudíž se na ně nemůže navázat další nukleotid řetězec končí - Získat můžeme řetězce, které vždy končí: dda, ddt, ddg nebo ddc. Gelová elektroforéza - Nabité části se pohybují v elektřině, DNA je nabité velmi záporně - Vyrobíme gelovou destičku - Malé kousky DNA projdou gelem rychle, naopak velké pomalu - Tím se nám seřadí řetězce DNA podle délky - Nasvítíme je UV lampou - Přečteme DNA písmenka jsou seřazená