Genetická variabilita vybraných horských druhů cévnatých rostlin v Krkonoších

CHRTEK J., PLAčKOVÁ I., ZAHRADNÍKOVÁ J., KIRSCHNER J., KIRSCHNEROVÁ L. ŠTěPÁNEK J. KRAHULCOVÁ A., KRAHULEC F. & HARčARIK J. 2007: Genetická variabilita vybraných horských druhů cévnatých rostlin v Krkonoších. In: ŠTURSA J. & KNAPIK R. (eds), Geoekologické problémy Krkonoš. Sborn. Mez. Věd. Konf., říjen 2006, Svoboda n. Úpou. Opera Corcontica, 44/1: 251 264. Genetická variabilita vybraných horských druhů cévnatých rostlin v Krkonoších Genetic variation in selected mountain species of vascular plants in the Giant Mountains Jindřich Chrtek 1, Ivana Plačková 1, Jitka Zahradníková 2, Jan Kirschner 1, Ludmila Kirschnerová 1, Jan Štěpánek 1,3, Anna Krahulcová 1, František Krahulec 1 & Josef Harčarik 2 1 Botanický ústav AV ČR, Zámek 1, CZ-252 43 Průhonice, e-mail: chrtek@ibot.cas.cz 2 Správa KRNAP, Dobrovského 3, 543 11 Vrchlabí 3 Herbářové sbírky UK, Benátská 2, 128 01 Praha Příspěvek se zabývá genetickou variabilitou (zjišťovanou pomocí analýzy isoenzymů) a vybranými aspekty reprodukční biologie 6 převážně vysokohorských taxonů. Poměrně velká diverzita byla zjištěna u druhu Festuca versicolor. Populace Gladiolus imbricatus je naopak geneticky homogenní; u semen byla zjištěna dormance. U Luzula spicata subsp. spicata byla prokázána nízká heterozygozita a genetická varibilita, která je zřejmě důsledkem převažující autogamie a fluktuace ve velikosti populací; diaspory klíčí pouze po skarifikaci. Všechny keře Salix bicolor v Úpské jámě patří k jednomu klonu; vnitro- i mezipopulační variabilita byla zjištěna u Salix herbacea. Všechny rostliny (genety) Veronica bellidioides na Sněžce jsou geneticky shodné. Population genetic structure (using isozyme analysis) and selected parameters of reproduction biology were examined in 6 high mountain taxa. Relatively high amount of genetic diversity was detected in Festuca versicolor. Population of Gladiolus imbricatus is genetically homogeneous; fresh seeds did not germinate, they germinated in the next spring a er cold and frost treatment. In Luzula spicata, very low heterozygosity and genotype diversity was found, most probably indicating high level of autogamy and fluctuation in population size; diaspores require scarification in order to germinate. All shrubs of Salix bicolor in the Úpská jáma glacial cirque belong to one clone. Both withi- and between-population variation was detected in Salix herbacea. In Veronica bellidioides, all plants at Mt. Sněžka belong to one multilocus isozyme genotype. Klíčová slova: Keywords: Festuca versicolor, Gladiolus imbricatus, Luzula spicata subsp. spicata, Salix bicolor, Salix herbacea, Veronica bellidioides, izolované populace, analýza isoenzymů, genetická diverzita, Krkonoše Festuca versicolor, Gladiolus imbricatus, Luzula spicata subsp. spicata, Salix bicolor, Salix herbacea, Veronica bellidioides, isolated populations, isozyme analysis, genetic diversity, Giant Mts. 251

ÚVOD Zjištění genetické variability malých izolovaných populací má zásadní význam jak pro poznání historie populací, tak i pro úvahy o jejich budoucím osudu. Z genetické variability je možné usuzovat např. na fluktuace početnosti (bottleneck) či limitující stav při vzniku populace (founder effect). Z hlediska budoucnosti populací pak geneticky stabilizované populace mohou úspěšněji čelit případným klimatickým či ekologickým změnám na vesměs extrémních vysokohorských lokalitách, ale i běžným demografickým událostem. Genetická variabilita také napoví mnoho o způsobu rozmnožování (alogamie vs. autogamie). Studie byla zaměřena na 6 druhů rostoucích především v subalpínském stupni Krkonoš. Festuca versicolor TAUSCH (čeleď Poaceae) v úzkém pojetí (subsp. versicolor) je karpatsko-sudetský taxon, v sudetských pohořích roste v současné době pouze v Krkonoších. Gladiolus imbricatus L. (Iridaceae) roste ve střední a východní Evropě, na Kavkaze, v Zakavkazsku a v Íránu (MEUSEL & al. 1965), v České republice především v karpatské oblasti Moravy (ZELENÁ 1967). Luzula spicata (L.) DC. subsp. spicata (Juncaceae) má rozsáhlý areál zahrnující sever Evropy a Severní Ameriky, Alpy a izolovanou arelu v Krkonoších (KIRSCHNER & al. 2002, mapa CHRTEK & KřÍSA 1962). Salix herbacea L. (Salicaceae) je druh rozšířený především v arktickém a boreálním pásu Eurasie a Severní Ameriky, jižněji má pouze izolované arely v nejvyšších pohořích (v ČR pouze Krkonoše a Hrubý Jeseník), Salix bicolor WILLD. naopak do severní Evropy nezasahuje a roste pouze v pohořích jz. a stř. Evropy (v ČR pouze v Krkonoších) (CHMELAř & KOBLÍžEK 1990). Veronica bellidioides L. (Scrophulariaceae) je vysokohorský druh rozšířený v Pyrenejích, Alpách, východních a jižních Karpatech a v pohořích Balkánského poloostrova (KÜPFER 1974); u nás je izolovaná arela v Krkonoších a v minulosti byla i ve Velké kotlině v Hrubém Jeseníku (HROUDA 2000). Ve všech případech byla ke zjištění genetické variability použita analýza isoenzymů. METODIKA V tomto odstavci je popsána pouze příprava vzorků, elektroforéza a vizualizace jednotlivých enzymatických systémů. Sběr materiálu je uveden v částech věnovaných jednotlivým druhům. Mladé listy byly homogenizovány buď v extrakčním pufru podle KATO (1987) s menšími modifikacemi (pufr Viola ): 0,1 M Tris-HCl (ph 8,0), 78 mm merkaptoetanol, 26 mm disiřičitan sodný, 11 mm kyselina L-askorbová, 4 % rozpustný PVP (Veronica bellidioides, Salix herbacea, S. bicolor) se špetkou Dowexu 1X-8 na každý vzorek nebo v pufru Luzula : 75 mm Tris-H 3 PO 4 (ph 7,5), 14,3 mm merkaptoetanol, 2,8 mm sodná sůl kyseliny askorbové, 4 % rozpustný PVP a 7,8 mm DTE (Festuca versicolor, Luzula spicata). Homogenát byl centrifugován 10 min při 15 000 ot./min. v chlazené centrifuze a čistý supernatant byl uchováván při -75 ºC. K rozdělení enzymů byla použita vertikální separace na polyakrylamidových gelech (PAGE); separační gel (8,16 %) s 1,82 M Tris-HCl pufrem, ph 8,9; koncentrační gel (4 %) s 0,069 M Tris-HCl pufrem, ph 6,9; elektrodový pufr byl 0,02 M Tris, 0,24 M glycin, ph 8,3. Celkově bylo testováno 10 enzymatických systémů (bližší informace o enzymatických systémech u jednotlivých druhů viz tam): AAT (aspartát aminotransferáza, EC 2.6.1.1), ADH (alkoholdehydrogenáza, EC 1.1.1.1), EST (esterázy, EC 3.1.1.-), GPI (glukóza-6-fosfát isomeráza, EC 5.3.1.9), IDH (isocitrát dehydrogenáza, EC 1.1.1.42),, LAP (leucin aminopeptidáza, EC 3.4.11.1), ME ( malátový enzym, 1.1.1.40), NADH- -DH (NADH dehydrogenázy, EC 1.6.99.-), PGM (fosfoglukomutáza, EC 5.4.2.2), SKDH (šikimát dehydrogenáza, EC 1.1.1.25), SOD (superoxid dismutáza, EC 1.15.1.1) a 6-PGDH (6-fosfoglukonát dehydrogenáza, EC 1.1.1.44). Složení detekčních roztoků bylo následující: AAT 240 mg kyselina asparágová, 40 mg kyselina α-ketoglutarová, 25 mg pyridoxal-5-fosfát, 50 mg Fast Blue BB, 50 mg Fast Violet B); ADH 20 ml etanol, 15 mg NAD, 10 mg MTT, 3 mg PMS; EST 30 mg α-na ylacetát, 30 mg β-na ylfosfátu, 50 mg Fast Blue BB); GPI 20 mg fruktóza-6-fosfátu, 10 mg NADP, 10 mg MTT, 3 mg PMS, 24 mg MgCl 2 a 20 µl glukóza-6-fosfát dehydrogenázy v 50 ml 0,05 M 252

Tris-HCl pufru ph 8,0; IDH 50 mg isocitronové kyseliny, 10 mg NADP, 8 mg MTT, 8 mg NBT, 3 mg PMS a 80 mg MgCl 2 v 50 ml 0,1 M Tris-HCl pufru ph 8,0; LAP 40 mg L-leucylna ylamid. HCl, 25 mg Fast Black K; ME 150 mg kyselina jablečná, 5 mg NADP, 10 mg MTT, 3 mg PMS, 50 mg MgCl 2 ; NADH-DH 15 mg menadion, 18 mg NADH, 20 mg MTT; PGM 100 mg glukóza- 1-fosfát, 10 mg NADP, 10 mg MTT, 3 mg PMS, 24 mg MgCl 2, 20 µl glukóza-6-fosfát dehydrogenáza; SOD 2 mg riboflavin, 5 mg EDTA-sodná sůl, 5 mg NBT); SKDH 30 mg kyselina šikimová, 5 mg NADP, 6 mg MTT, 3 mg PMS; 6-PGDH 10 mg kyselina 6-fosfoglukonová, 5 mg NADP, 5 mg MTT, 3 mg PMS, 30 mg MgCl 2. PŘEHLED STUDOVANÝCH DRUHŮ 1. Festuca versicolor V Krkonoších roste na dělícím hřebínku v Kotelních jamách, v Čertově zahrádce, Malé Čertově zahrádce a Čertově rokli, na skalách v Dolním Rudníku a na polské straně v Malé Sněžné jámě (Mały Kocioł Śnieżny). Materiál a metodika Bylo studováno 40 rostlin z populace v Čertově zahrádce. Vzorky (listy) byly odebírány v červenci 2004 přímo v terénu do igelitových sáčků s navlhčenou buničitou vatou a v přenosném chladicím boxu převezeny do laboratoře Botanického ústavu AV ČR v Průhonicích. Poloha každé odebírané rostliny byla zaznamenána do plánku. Bylo testováno 8 enzymatických systémů, z nich byly následně vybrány ADH, AAT, LAP a EST. Výsledky a diskuze Bylo vyhodnoceno celkem 6 lokusů: Lap-1, Lap-2, Aat-1, Aat-2, Adh-1 a Adh-2. V případě EST nebyla alelická interpretace možná, a byly proto pouze srovnávány patterny. Lokusy Lap-1 a Aat-1 jsou monomorfické, ostatní polymorfické. Zjištěné frekvence genotypů pro jednotlivé lokusy jsou shrnuty v Tab. 1.; průměrný počet alel na lokus (A) je 1,83, procento polymorfních lokusů (P) je 66.7, pozorovaná heterozygozita (H o, průměr ze všech lokusů) 0,40, očekávaná heterozygosita (H exp, průměr ze všech lokusů) je 0,31 a Shannonův index 0,45. Celkově je možné říci, že populace je geneticky poměrně variabilní. Tab. 1. Zjištěné genotypy a jejich frekvence pro lokusy Lap-1, Lap-2, Aat-1, Aat-2, Adh-1 a Adh-2 u Festuca versicolor z Čertovy zahrádky. Isozyme genotypes and their frequencies for Lap-1, Lap-2, Aat-1, Aat-2, Adh-1 and Adh-2 in Festuca versicolor from the locality Čertova zahrádka. Lap-1 Lap-2 Aat-1 Aat-2 Adh-1 Adh-2 aa 1,0 ab 0,05 aa 1.0 aa 0,325 aa 0,5 aa 0,025 bc 0,95 ab 0,475 ab 0,4 ab 0,5 bb 0,2 bb 0,1 bb 0,475 2. Gladiolus imbricatus V Krkonoších roste pouze na jediné izolované lokalitě na krátkostébelné louce asi 500 m jihovýchodně od boudy Jana (nad Velkou Úpou), v nadmořské výšce 900 m (poloha 50 41 27 N, 15 47 40 E). 253

Materiál a metodika V červnu 2002 byly odebrány čerstvé listy z 30 rostlin (6 mikrolokalit po 5 rostlinách) pro analýzu čtyř enzymatických systémů: ADH, AAT, LAP a IDH. Odebrány byly také 3 rostliny, které byly dále pěstovány v experimentální zahradě Botanického ústavu AV ČR v Průhonicích. V následujících dvou letech byl testován způsob reprodukce. Zjišťována byla především schopnost tvorby semen po autogamii, resp. geitonogamii. Květy postupně se rozvíjející v květenství byly opylovány mezi sebou ručně tak, aby byl zajištěn přenos zralého pylu na blizny v receptivní fázi. Jedno kontrolní květenství zůstalo izolované bez dalšího zásahu (test na spontánní autogamii), z několika dalších květů byly odstraněny prašníky před uvolněním pylu a tyto květy byly rovněž izolovány (test na případnou tvorbu semen bez oplození, tj. autonomní apomixi). Výsledky Všechny studované lokusy byly v populaci monomorfické, s největší pravděpodobností se tedy jedná o jeden klon. To ještě zvyšuje naléhavost dlouhodobého sledování a ochrany populace. Třebaže nebyla prokázána genetická heterogenita uvnitř populace, rostliny mají schopnost semenného rozmnožování autogamicky, resp. sprašováním mezi květy téže rostliny (geitonogamie), což platí i pro sprašování v rámci jediného klonu na krkonošské lokalitě. Úspěšná spontánní autogamie bez účasti opylovačů však není pravděpodobná, protože izolované kontrolní květenství zůstalo bez dalšího zásahu sterilní. Autonomní apomixe (vznik semen bez opylení) prokázána nebyla, což odpovídá tomu, že v rodu Gladiolus nebyl dosud tento reprodukční způsob zjištěn. Semena vytvořená po sprášení mají dormanci. Při výsevu do země po sklizni neklíčila vůbec a vyklíčila až na jaře, po několikaměsíčním období chladu a příležitostném přemrznutí. 3. Luzula spicata subsp. spicata Současný výskyt v Krkonoších je pozůstatek reliktního rozšíření, který bylo v minulosti mnohem širší (KIRSCHNER 1989). V současnosti se soustředil již jen do dvou hlavních center: a) pod Modrým sedlem mezi Studniční a Luční horou v nadmořské výšce 1512 m, b) na svazích a vrcholu Sněžky, včetně západního a východního úpatí v nadmořské výšce 1426 1599 m. Základní zhodnocení taxonu publikoval KIRSCHNER (1989). Dlouhodobě sledovaná byla populace podél cesty pod Modrým sedlem mezi Studniční a Luční horou od r. 1976. V té době čítala 300 jedinců na ploše asi 50 m 2. Po přesunu cesty několik metrů západně od lokality došlo k prudkému rozvoji populace. Sledovaná problematika Cílem studie bylo: 1) Zaznamenat aktuální rozšíření obou hlavních populací a trendy změn populace pod Modrým sedlem. 2) Stanovit podmínky a průběh klíčení diaspor. 3) Zjistit, zda je tento unikátní taxon alpinské tundry Krkonoš charakterizován reprodukcí, která by jej v krkonošském výskytu potenciálně vystavovala ohrožení. Převládající reprodukční způsob je totiž klíčovou informací pro zhodnocení stavu ohrožení taxonu i pro případná ochranářská opatření. Reprodukční způsob a velikost populací se odrážejí v genetické variabilitě, která byla studována pomocí isoenzymové analýzy. 254

Materiál a metody Aktuální rozšíření a populační dynamika Lokality byly podrobně zakresleny do map a zaznamenány pomocí GPS, odhad početnosti byl proveden pomocí mikromap. V letech 2001 a 2002 byla u cesty pod Modrým sedlem vytyčena trvalá plocha 5 7 m a v decimetrové síti opakovaně v r. 2003 zaznamenáni všichni jedinci. Trvalá plocha byla fixovaná body (velkými hřeby v plastových trubkách; severozápadní roh plochy: N 50º43 32,2, E 15 41 26,9, na mapě (Obr. 1.) je označen č. 22. Klíčivost diaspor Pro analýzu klíčivosti byly využity diaspory odebrané v r. 2001. Analýza isoenzymů Pro isoenzymovou analýzu byl využit materiál z obou hlavních populací: v roce 2002 z lokality pod Modrým sedlem mezi Studniční a Luční horou, v r. 2004 ze Sněžky. V obou případech byly vybrány vzorky tak, aby topograficky rovnoměrně pokrývaly obě populace. V prvním případě byl zvolen odběr podél transektu ve vzdálenostech 2 3 m ve víceméně liniové populaci podél cesty, Obr. 1. Na Sněžce byly odebrány vždy 1 3 vzorky z každé skupiny rostlin tvořící jednu polycentrickou (meta) populaci, Obr. 2. a 3. Na každé lokalitě bylo odebráno po 23 vzorcích (z toho 20 analyzováno z každé lokality). Odběr byl proveden nedestruktivně: v rámci trsu byla odebírána vždy jedna z několika mladších listových růžic. Místa odběrů byla zakreslena do mapy (písmeno A u čísla odběru, Obr. 1. 3.). Studováno bylo 5 enzymových systémů: 6-PGDH, LAP, EST, SHDH, ADH; pattern systému SHDH nebyl dostatečně čitelný, a nebyl k vyhodnocení analýzy použit. Extrakce a screening isozymové analýzy byl proveden podle metodiky KIRSCHNER & al. 2000 a KIRSCHNER 1995. Výsledky a diskuse Aktuální rozšíření a populační dynamika Detailní záznam současného výskytu Luzula spicata subsp. spicata v Krkonoších ukazují Obr. 1., 2. a 3. Odhad početnosti, změny ve velikosti a hustoty populace v letech 2001 a 2003 na monitorovací ploše pod Modrým sedlem ukazuje Tab. 2. Velikost sledovaných populací Modré sedlo: Populace na lokalitě pod Modrým sedlem se táhne podél obou stran cesty v délce 210 m a průměrné šířce 4 13 m. Na západní straně cesty jsou menší skupiny rostlin se značnými mezerami ve výskytu. Celkem bylo zjištěno 380 rostlin na straně západní; na východní straně cesty je populace ± spojitá v délce 210 m (Obr. 1.). Odhad četnosti provedený na základě součtu rostlin na trvalé ploše a extrapolace v r. 2001 spadal do intervalu 5500 až 7000 rostlin, v r. 2003 ca 10000 rostlin včetně sterilních růžic. Při celkovém censu v obou letech populace vykazuje velmi vysoké počty rostlin. Poměr nekvetoucích a kvetoucích trsů v r. 2003 odpovídal poměru zjištěnému v r. 2001; průměrně 2,9. Tab. 2. 2001 Rozložení počtu kvetoucích jedinců Luzula spicata subsp. spicata ve sledované ploše pod Modrým sedlem (číslo se vztahuje k ploše 1 1 m, čísla v levém sloupci patří ke čtvercům nejblíže k cestě). Každé číslo představuje součet pro 100 plošek o velikosti 1 dm 2. Původní data jsou k dispozici u autorů. Celkový součet kvetoucích trsů je 680 ks v rozložení Z > V a v původním pořadí na lokalitě; maximální počet jedinců (vč. sterilních) v r. 2001 ve čtverci 1 1 m ca 230. 2003 Rozložení všech jedinců ve sledované ploše pod Modrým sedlem; podíl kvetoucích jedinců k nekvetoucím byl 1 : 2,9. 255

2001 Spatial pattern of flowering plants of Luzula spicata subsp. spicata at an experimental plot near the Modré sedlo saddle (number refers to a 1 1 m square, numbers in the le column belong to squares along the road). Each number represents a total for 100 plots of 1 dm 2 (original data can be provided on request). Altogether 680 flowering tu s in the W > E order, in an original sequence at the locality; highest number of plants (incl. sterile) in a 1 1 m plot in 2001 was 230. 2003 Spatial pattern of all plants in the permanent plot near the Modré sedlo saddle; flowering : sterile plants = 1 : 2,9. rok 2001 rok 2003 50 19 4 16 0 150 130 10 48 1 30 13 19 14 5 161 142 60 34 12 63 14 15 11 6 166 133 92 7 7 76 34 41 7 0 239 145 94 13 0 45 25 17 7 2 171 137 64 15 1 44 22 13 6 0 190 57 68 34 2 68 8 0 2 4 200 61 1 52 3 Obr. 1. Letecký snímek výskytu Luzula spicata subsp. spicata pod Modrým sedlem, 1512 m n. m., 6. 8.2003 Fig. 1. Aerial photograph of the locality of Luzula spicata subsp. spicata near the Modré sedlo saddle, 1512 m, 6 August 2003 bod charakteristika souřadnice 22 výchozí bod pro monitoring (čtverce) N 50º43 32,2, E 15º41 26,9 23 počátek souvislého porostu pod cestou N 50º43 30,8, E 15º41 26,2 24 orientační bod, kámen N 50º43 32,0, E 15º41 26,8 25 počátek souvislého porostu nad cestou N 50º43 32,5, E 15º41 26,9 26 konec souvislého porostu pod cestou N 50º43 35,5, E 15º41 29,0 27 konec souvislého porostu nad cestou N 50º43 35,1, E 15º41 29,0 28 geodetický bod N 50 43 35,1, E 15 41 29 29 místo s největší šířkou porostu N 50 43 33,3, E 15 41 28,1 30 místo s největší šířkou porostu N 50 43 33,3, E 15 41 27,2 Obr. 2. Letecký snímek vrcholu Sněžky s vyznačením výskytu Luzula spicata subsp. spicata, 1. 9. 2004. Dále je uvedeno pro Obr. 2 a Obr. 3 vždy číslo bodu a v závorce počet lodyh s květenstvím nebo jiná charakteristika, A místa odběrů na isoenzymovou analýzu. 31 (2: N 50º44 07,8, E 15º44 30,4, 1576 m), 32 (1, A), 33 (začátek souvislého porostu k bodu 34), 34 (konec souvislého porostu od bodu 33, N 50 o 44 11,5, E 15 o 44 26,4, 1599 m, A), 35 (hustý porost se stovkami lodyh, A), 36 (hustý porost se stovkami lodyh, A + vzorek mezi 36 a 42), 37 (hustý porost se stovkami lodyh, A), 38 (ca 100 na ploše 3 3 m, A), 39 (nezaznamenáno), 40 (nezaznamenáno), 41 (1), 42 (70 na ploše 2 2 m, A), 43 (20), 44 (10), 45 (8, A), 46 (15 na ploše 4 4 m, A), 47 (1), 48 (4, A), 49 (2), 50 (2), 51 (60 na ploše 4 5 m, A), 52 (15, N 50º44 08,4, E 15º44 22,6 ), 53 (desítky, A), 54 (desítky), 55 (6), 56 (20 na ploše 6 6 m), 57 (20), 58 (40 na ploše 0,5 3 m, A), 59 (20), 60 (30, A), 61 (10, A), 62 (3), 63 (5), 64 (5), 65 (ploška s častými trsy), 66 (ploška s častými trsy), 67 (ploška s častými trsy), 68 (5, N 50º44 16,5, E 15º43 54,7, 1426 m, A), 69 (10), 70 (10), 71 (nezaznamenáno), 72 ( 5 v lemu cesty, A), 73 (54 v lemu cesty), 74 (20), 75 (8, A), 76 (22), 77 (11), 78 (14), 79 (2), 80 (40), 81 (130 na ploše 6 6 m), 82 (hustý porost se stovkami lodyh), 83 (17, A), 84 (11), 85 (30), 86 (17). Fig. 2. Aerial photograph of the topmost part of Mt. Sněžka with marked occurrence of Luzula spicata subsp. spicata, 1 September 2004. 256

Obr. 1. 257

Obr. 2. 258

Obr. 3. Letecký snímek západního svahu Sněžky s vyznačením výskytu Luzula spicata subsp. spicata, 1. 9. 2004. Vysvětlivky k jednotlivým bodům jsou v legendě k Obr. 2. Fig. 3. Aerial photograph of the topmost part of Mt. Sněžka with marked occurrence of Luzula spicata subsp. spicata, 1 September 2004. 259

Sněžka: Fragmentovaná (meta)populace, a to na české i polské straně, je rovněž rozsáhlá. Celkový počet zde byl odhadnut na minimálně 6000 jedinců. Při průzkumu v letech 2003 a 2004 došlo pouze k nárůstu známého počtu jedinců dohledáním dalších mikrolokalit (Obr. 2. a 3.). Klíčivost diaspor Podle předpokladu (KIRSCHNER 1989) klíčí diaspory Luzula spicata ze semenné banky až po abrazi vnějšího osemení (Tab. 3.), pravděpodobně následkem kontaktu s částečkami substrátu při jejich pohybu s vodou nebo s ledem. Výsledky dokládají, že hlavním faktorem pro klíčení je narušení osemení. Ani pouhá stratifikace ke klíčení nevede. Nevyklíčené diaspory po skarifikaci mohou být následkem poškození při skarifikaci (jsou velmi drobné a nelze se absolutně vyhnout kontaktu preparační jehly s tekutým endospermem). Tab. 3. Podmínky klíčení diaspor Luzula spicata subsp. spicata. V každém experimentu bylo vyseto na Petriho misky 35 diapor. Kontrola: žádný treatment, vlhko, pokojová teplota; stratifikace: 2 měsíce při -5 C, 14 dnů 10 C, 1 měsíc 0 C; skarifikace: podle Kirschner 1989. Germination of Luzula spicata subsp. spicata. In each treatment 35 seeds per dish were sown. Control: no treatment, humidity, room temperature; stratification: 2 months at -5 C, 14 days at 10 C, 1 month at 0 C; scarification: see Kirschner 1989. 260 Počet vyklíčených semen Luzula spicata subsp. spicata interval [dny] kontrola stratifikace skarifikace + stratifikace skarifikace 10 0 0 12 6 20 0 1 28 27 30 0 1 29 32 Tab. 4. Porovnání variability dvou populací Luzula spicata subsp. spicata v Krkonoších vyhodnocením 10 lokusů vybraných enzymových systémů. M monomer, D dimer, J jiný typ; * nejistá heterozygosita, ** sekundární proužky provázející hlavní; x i = frekvence multilokusového genotypu i, G je v intervalu <0;1>. Comparison of genetic variation in two populations of Luzula spicata subsp. spicata in the Krkonoše Mts. based on 10 selected isozyme loci. M monomeric enzyme, D dimeric enzyme, J other type; * uncertain heterozygosity, ** secondary bands accompanying the principal ones; x i = frequency ot the multicolus genotype i, G within <0;1>. Modré sedlo Sněžka lokus proměnlivost Homo / Heterozygosita proměnlivost Homo / Heterozygosita Lap-1 monomorfický Ho** monomorfický Ho Lap-2 monomorfický Ho variabilní Ho (19 vz.) / He (1 vz.) 6Pgdh-1 monomorfický Ho monomorfický Ho 6Pgdh-2 monomorfický Ho monomorfický Ho Est-1 monomorfický Ho monomorfický Ho Est-2 variabilní Ho (17 vz.) / He (2 vz.)* monomorfický Ho Est-3 variabilní Ho (17 vz.) / He (2 vz.)* monomorfický Ho Est-4 monomorfický Ho monomorfický Ho Adh-1 monomorfický Ho* monomorfický Ho Adh-2 monomorfický Ho monomorfický Ho Výsledná heterozygosita Het = 0,01 Het = 0,005 Výsledná genotypová diversita 2 G = 1 - Σx i = 0,02 G = 1 - Σx i2 = 0,01

Genotypová diversita Srovnávána byla genotypová diverzita a homozygozita populací mezi dvěma velmi vývojově odlišnými lokalitami; mezi zjevně poměrně nedávno expandující malou lokalitou (Modré sedlo) a lokalitou starší, složenou z několika poměrně stabilních subpopulací (Sněžka), Tab. 4. Výsledky ukazují, že populace Luzula spicata subsp. spicata v Krkonoších je téměř naprosto homozygotní, a je zjevné, že se rozmnožuje téměř výlučně autogamicky. Protože u (meta)populací s odlišnou historií je heterozygozita i genotypová diverzita shodně velmi nízká, je nízká genotypová diverzita nejspíš následkem dlouhodobé autogamie s pravděpodobným podílem fluktuací ve velikosti a počtu populací. Závěr V průběhu let 2001 2004 nebyl na lokalitách Modré sedlo a Sněžka zjištěn úbytek populací Luzula spicata subsp. spicata. Celkový počet jedinců se pohyboval pod Modrým sedlem v rozmezí 5500 10000 jedinců, na svazích a vrcholu Sněžky ca 6 000 jedinců. Poměr nekvetoucích a kvetoucích trsů byl zjištěn průměrně 2,9. Semena klíčila až po mírném narušení osemení. Populace jsou v důsledku izolovaného výskytu velmi málo variabilní až téměř invariabilní. Nízká genotypová variabilita ukazuje na fluktuaci početnosti populací (tzv. bottleneck), které se v minulosti vyskytovaly i na jiných místech v Krkonoších (KIRSCHNER 1989). Přestože zbylé hlavní populace mají nízkou genotypovou variabilitu, jsou dostatečně početné a relativně stabilní. Tento fakt je umožněn zejména autogamickým způsobem reprodukce. Zachování vhodných mírně narušovaných stanovišť je pak klíčovým předpokladem pro udržení stávajícího stavu obou populací. 4. Salix herbacea Na české straně Krkonoš roste pouze ve svahu Studniční stěny a v Malé Kotelní jámě; na polské straně jsou známy 3 lokality. Pravidelné sledování dvou lokalit na české straně Krkonoš probíhá od roku 1991 (VAšINA & ZAHRADNÍKOVÁ 1999). Materiál a metodika Byly studovány rostliny ze Studniční stěny (50 rostlin), Malé Kotelní jámy (5 rostlin) a zatím pouze 1 rostlina z Malé Sněžné jámy (Mały Kocioł Śnieżny, Polsko). Vzorky (listy) byly odebírány koncem května 2003 nedestruktivním způsobem přímo v terénu do igelitových sáčků s navlhčenou buničitou vatou a v přenosném chladicím boxu převezeny do laboratoře Botanického ústavu AV ČR v Průhonicích. Poloha každé odebírané rostliny byla zaznamenána do plánku. Testováno bylo celkem 8 enzymatických systémů (AAT, ADH, EST, GPI, LAP, ME, SKDH 6-PGDH), pro vlastní analýzy pak byly vybrány systémy AAT, ADH, EST a LAP. Výsledky a diskuze Z testovaných enzymatických systémů bylo možné vyhodnotit 5 lokusů: Lap-1, Lap-2, Aat-1, Aat-2 a jeden lokus EST (Est-4), u lokusu Est-1 bylo možné spolehlivě rozlišit pouze počet proužků. Lokusy Lap-2 a Aat-1 jsou v celém souboru monomorfické. V případě ADH nebyla možná alelická interpretace a byly proto pouze srovnávány patterny proužků. Celkem bylo rozlišeno 7 multilokusových genotypů, alelické kombinace a frekvence jednotlivých genotypů jsou shrnuty v Tab. 5. (bez monomorfických lokusů). Na lokalitě Studniční stěna bylo v souboru 50 rostlin zjištěno 5 genotypů, v Malé Kotelní jámě pak pouze 1 genotyp, který není přesvědčivě shodný s žádným z genotypů ze Studniční stěny. Zcela unikátní genotyp byl zjištěn u rostliny z Malé Sněžné jámy. 261

Tab. 5. Zjištěné multilokusové genotypy druhu Salix herbacea (frekvence genotypů je počítána v rámci jednotlivých lokalit) Multilocus isozyme genotypes found in Salix herbacea (frequencies are calculated within the particular localities) lokalita Lap-1 Aat-2 Est-4, Est-1 ADH genotyp frekvence genotypu (počet rostlin) Studniční stěna aa aa aa A A I 0,12 (6) bb aa bb B B II 0,16 (8) aa ab aa C C III 0,36 (18) aa ab aa B D IV 0,20 (10) aa bb aa B D V 0,16 (8) Malá Kotelní jáma aa ab aa A C VI 1,0 (5) Malá Sněžná jáma ab ab nečitelné E VII 1,0 (1) VAšINA & ZAHRADNÍKOVÁ (1999) uvádějí, že v populaci na svazích Studniční stěny byly zjištěny pouze samičí (pestíkové) rostliny a tudíž v recentní době se populace mohla rozšiřovat pouze vegetativním způsobem. Zjištění 5 různých multilokusových genotypů naopak ukazuje na to, že v populaci byly zřejmě dříve zastoupeny i samčí (prašníkové) rostliny. Kombinace generativního rozmnožování a klonálního růstu byla zjištěna u S. herbacea v Alpách (REISCH & al. 2007). 5. Salix bicolor Vrba dvoubarvá je v Krkonoších velmi vzácný druh, roste na jediné lokalitě ve Sněhovém žlabu (Úpská jáma, ZAHRADNÍKOVÁ & VAšINA 1996). Materiál a metodika Bylo studováno 12 rostlin ze Sněhového žlabu, ve všech případech šlo o rostliny pěstované v Genofondové zahradě Správy KRNAP. Další postup byl stejný jako u S. herbacea. Výsledky Všechny studované lokusy jsou monomorfické, populace je invariabilní (1 klon). 6. Veronica bellidioides V Krkonoších je známa pouze ze 4 mikrolokalit ve vrcholové části Sněžky, pracovně označovaných Pod vyhlídkou (A), Nad sutí (B), V ohybu jubilejní (C) a Pod Českou boudou (D) v nadmořské výšce 1580 1600 m ve společenstvu zařaditelném do svazu Juncion trifidi; všechny lokality jsou na české straně. Poslední podrobný monitoring probíhal v letech 2001 2004 (J. Zahradníková). Počty zaznamenaných listových růžic a kvetoucích lodyh jsou shrnuty v Tab. 6. Rostliny rozkvétají koncem června, plody dozrávají začátkem srpna. Jedna lodyha nese až 15 tobolek s 30 50 semeny. Nárůst počtu růžic ve sledovaných letech zachycuje spíše rozrůstání jednotlivých rostlin než nové semenáčky. Pouze na lokalitě Pod vyhlídkou byly 1. 9.2004 zjištěny tři rostliny snad vzešlé ze semen. 262

Tab. 6. Početní stav Veronica bellidioides na Sněžce v letech 2001 2004 Population of Veronica bellidioides in the topmost part of Mt. Sněžka, 2001 2004 lokalita rok počet listových růžic počet lodyh s květenstvím Pod vyhlídkou 2001 37 4 2002 35 10 2003 49 11 2004 66 2 V ohybu Jubilejní 2001 14 0 2002 19 0 2003 18 0 2004 26 0 Pod Českou boudou 2003 21 6 2004 40 0 Nad sutí 2003 29 4 2004 36 1 celkem Sněžka 2004 168 3 Výsledky a diskuze V žádném ze studovaných enzymatických systémů nebyla zjištěna variabilita, všechny rostliny patří k jednomu multilokusovému genotypu. Zcela uniformní jsou i patterny u esteráz, enzymatického systému s nízkou substrátovou specifitou, kde se na gelu projevuje aktivita produktů většího množství lokusů. Veronica bellidioides má ve srovnání s dalšími druhy okruhu Veronica alpina v celém geografickém areálu velmi malou genetickou diverzitu (cpdna a AFLP markery, ALBACH & al. 2006), což může být způsobeno efektem hrdla lahve (bottleneck effect) v malých populacích v glaciálních refugiích nebo v prvních fázích šíření z refugií. Zásadní vliv na genetickou diverzitu má pak i to, že V. bellidioides je autokompatibilní, tj. je možné (a pravděpodobně k němu i ve velké míře dochází) samoopylení; kromě toho významnou roli hraje vegetativní šíření dceřinnými růžicemi. Výrazným zmenšením (bottleneck), které mohlo snížit genetickou diverzitu, prošla s největší pravděpodobností i populace na Sněžce již od počátku 19. století tu byl druh hojně sbírán jak turisty, tak i botaniky, kolem roku 1915 byl pak považován za vyhynulý a znovu byl nalezen až v roce 1934 (PROCHÁZKA & ŠTURSA 1999). Poděkování Děkujeme Karin Sramek de Kott a Adéle Mackové za pomoc při analýze isoenzymů. Projekt byl financován z grantu VaV610/3/00. LITERATURA ALBACH D., SCHÖNSWETTER P. & TRIBSCH A. 2006: Comparative phylogeography of the Veronica alpina complex in Europe and North America. Molec. Ecol., 15: 3269 3286. 263

HROUDA L. 2000: 15. Veronica L. rozrazil. In: SLAVÍK B. (ed), Květena České republiky 6, Academia, Praha, p. 355 397. CHMELAř J. & KOBLÍžEK J. 1990: 65. Salicaceae Mirbel vrbovité. In: HEJNÝ S. & SLAVÍK B. (eds), Květena České republiky 2, Academia, Praha, p. 458 495. CHRTEK J. & KřÍSA B. 1962: A taxonomical study of the species Luzula spicata (L.) DC. sensu lato in Europe. Bot. Not., 115: 293 310. KATO T. 1987: Hybridization between Dianthus superbus var. longicalycinus and D. shinanensis evidenced by resolvable esterase isozymes from herbarium specimens. Ann. Tsukuba Bot. Gard., 6: 9 18. KIRSCHNER J. 1989: Luzula spicata. In: SLAVÍK B. (ed), Vybrané ohrožené druhy flóry ČSR, Stud. ČSAV, 1989/10: 11 23. KIRSCHNER J. 1995: Allozyme analysis of Luzula sect. Luzula (Juncaceae) in Ireland: Evidence of the origin of tetraploids. Folia Geobot. Phytotax., 30: 280 290. KIRSCHNER J., KIRSCHNEROVÁ L., KOTTOVÁ K., PLAčKOVÁ I., ŠTěPÁNEK J. & TICHÝ M. 2000: Analýza isoenzymů v populační biologii rostlin. Ms. (Příručka praktických cvičení pro posluchače katedry botaniky Přírodovědecké fakulty UK, Botanický ústav AV ČR Průhonice). KIRSCHNER J. & al. 2002: Juncaceae 1: Rostkovia to Luzula. Species Plantarum: Flora of the World, Part 6: 1 237. KÜPFER P. 1974: Recherches sur les liens de parenté entre la flore orophile des Alpes et celle des Pyrénées. Boissiera, 23: 1 322 + 10 tab. MEUSEL H., JÄGER E. & WEINERT E. 1965: Vergleichende Chorologie der zentraleuropäischen Flora. VEB Gustav Fischer Verlag, Jena. PROCHÁZKA F. & ŠTURSA J. 1999: Veronica bellidioides L. In: ČEřOVSKÝ J., FERÁKOVÁ V., HOLUB J., MAGLOCKÝ Š. & PROCHÁZKA F. (eds), Červená kniha ohrožených a vzácných druhů rostlin a živočichů ČR a SR. Vol. 5. Vyšší rostliny. Príroda, Bratislava, p. 398. REISCH Ch., SCHURM S. & POSCHLOD P. 2007: Spatial genetic structure and clonal diversity in an alpine population of Salix herbacea (Salicaceae). Ann. Bot., 99: 647 651. VAšINA V. & ZAHRADNÍKOVÁ J. 1999: Revize rozšíření vrby bylinné (Salix herbacea L.) v Krkonoších a Hrubém Jeseníku. Opera Corcontica, 36: 153 162. ZAHRADNÍKOVÁ J. & VAšINA V. 1996: Stav populace vrby dvoubarvé (Salix bicolor Willd.) v Krkonoších. In: VACEK S. (ed), Monitoring, výzkum a management ekosystémů na území KRNAP, Opočno, p. 330 334. ZELENÁ V. 1967: Rozšíření Gladiolus imbricatus L. a Gladiolus paluster Gaud. na území Československa. Sborn. Slov. Nár. Múz. Prír. Vedy, 13: 19 40. 264