Hmotnostní spektrometrie biomolekul 1 Jan Preisler Oddělení analytické chemie Ústavu chemie, 31A14, PřF UKB MU tel.: 54949 669, preisler@chemi.muni.cz Kurs C7895 poskytne základy hmotnostní spektrometrie: přehled ionizačních metod, hmotnostních analyzátorů, vybraných technik a aplikací. Důraz bude kladen na hmotnostní spektrometrii biologických látek (ionizační metody MALDI, ESI), moderní instrumentaci v hmotnostní spektrometrii (TOF, iontové a orbitální pasti) a nejnovější vývoj v oboru. Úvod do hmotnostní spektrometrie. Stručná historie hmotnostní spektrometrie: přehled metod a instrumentace. Základní koncepty MS (rozlišení, citlivost). Ionizační metody a metody zavádění vzorku: Elektronová ionizace (EI) Plán přednášek pro rok 017 Přednášky se konají v učebně 07A14 v pondělky 13:00 14:50; případné změny budou ohlášeny předem. Plán přednášek Sylabus C7895 MSBio 017.pdf, učební materiál MS Bio CZ 017.pdf a MS Bio ENG 011.pdf jsou k dispozici na http://bart.chemi.muni.cz. Učební materiál je pouze osnovou k probírané látce. Doporučuji si jej tisknout postupně předem a doplňovat do něj poznámky na přednášce. Učební materiál i sylabus mohou být průběžně aktualizovány. I. Úvod Zdroje informací o hmotnostní spektrometrii Stručná historie hmotnostní spektrometrie, přehled metod a instrumentace Základní koncepty hmotnostní spektrometrie Doplňkové učebnice: J. Gross, Mass Spectrometry, 3rd ed. Springer-Verlag, 017 J. Greaves, J. Roboz: Mass Spectrometry for the Novice, CRC Press, 013 Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant: Mass Spectrometry: Principles and Applications, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 007 Obsah I. Úvod II. Ionizační metody a metody zavádění vzorku III. Hmotnostní analyzátory IV. Biologické aplikace MS V. Otázky Studijní materiál Poznámky z přednášek Materiály použité při přednášce lze stáhnout z informačního systému nebo http:\\bart.chemi.muni.cz a používat při přednášce. Neexistuje souhrnná česká učebnice nebo skripta moderní hmotností spektrometrie se zaměřením na analýzu biomolekul. Školy hmotnostní spektrometrie a HPLC-MS. Doplňková literatura Robert J. Cotter: Time-of-Flight Mass Spectrometry - Instrumentation and Applications in Biological Research, American Chemical Society, 1997. Richard B. Cole et al.: Electrospray Ionization Mass Spectrometry - Fundamentals, Instrumentation & Applications, John Wiley & Sons, Inc., 1997. 1
Další zdroje informací Internet Učebnice http://www.ms-textbook.com/ nebo http://www.spectroscopynow.com/spy/basehtml/spyh/1,1181,4-14-9-0-0- education_dets-0-68,00.html Souborný zdroj informací www.spectroscopynow.com Protein Prospector prospector.ucsf.edu Komerční společnosti, např. http://www.matrixscience.com/ atd. atd. Specializované časopisy International Journal of Mass Spectrometry Journal of Mass Spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry Mass Spectrometry Reviews Rapid Communications in Mass Spectrometry Aplikace MS Analýza biologických látek: Proteiny, mapování peptidů, peptidové databáze, nové metody (ICAT) Analýza peptidů (disulfidové můstky, post-translační modifikace) Nukleové kyseliny Sacharidy Analýza syntetických polymerů A další... Ionizační metody a metody zavádění vzorku Doutnavý výboj (GD) Elektronová ionizace (EI) Chemická ionizace (CI) Indukčně vázané plazma (ICP) Ionizace rychlými atomy (FAB) Ionizace (SIMS) Thermosprej (TSI) Ionsprej (IS) Elektrosprej (ESI) Plazmová Desorpce (PD) Laserová Desorpce (LD) Laserová desorpce za účasti matrice (MALDI) Spojení separace a hmotnostní spektrometrie (on-line, off-line, čipy). Stručná historie hmotnostní spektrometrie 1803 Daltonova atomová teorie hmota se skádá z atomů; všechny atomy maji stejnou hmotu ne tak docela: izotopy Důkaz izotopů: - spektroskopie: nepatrný posun čar... vyžaduje kvalitní přístroj - MS: snadné stanovení Hmotnostní spektrometry Doutnavý výboj jako iontový zdroj Základy iontové optiky. Simulace pohybu iontů, Simion Energetické analyzátory Magnetický sektor Kvadrupólový analyzátor Iontový cyklotron (ICR-FT-MS) Iontová past (IT) Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOFMS) Nové hmotnostní spektrometry: Orbitrap, TOF-TOF, LIFT-TOF. Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS, MS n ) Kolizně indukovaná disociace (CID) Povrchově indukovaná disociace (SID) Fragmentace ve zdroji (ISF) a mimo zdroj (PSD). Principy vakuové techniky Detektory a detekční elektronika Chromatografie - MS (on-line, off-line, in-line MS) 1880 s Crookes: doutnavý výboj H H (H ) * H (H ) * H 4 h vrstva iontu viditelný negativní výboj - - p ~ 0. Pa o U ~ 700 V DC I ~ 1 ma
První hmotnostní spektrometr 1911 J. J. Thomson: Parabola MS (Phil Mag. 1911, 1, 5) Paprsky pozitivní elektřiny 1913 fotografická deska vakuová pumpa magnet s elektrodami - dutá katoda Doutnavý výboj v Ne při 1 Torr, dutá katoda, magnet - doutnavý výboj v Ne, 1 Torr Ne Stručná historie MS ve zbytku 0. stol. 1940 C. Berry: Elektronová ionizace (Electron Impact, EI) Struktura organických sloučenin 1950-70 MS používáno ke strukturní analýze organických sloučenin 1980 Analýza těžkých a velmi těžkých molekul díky novým ionizačním metodám: FAB, PD, ESI a MALDI Dnes MS pro kvalitativní, strukturní i kvantitativní analýzu Široká škála komerčních hmotnostních spektrometrů MS nezbytná pro analýzu organických a biologických molekul První hmotnostní spektrometr Základní koncepty hmotnostní spektrometrie Fotografická deska jako detektor: čáry 0 Ne a Ne na fotografické desce Hmotnostní spektrometr přístroj, který z analyzované látky produkuje ionty a stanovuje jejich hmotnost, přesněji poměr hmotnosti a náboje Součásti spektrometru 1. Komora s iontovým zdrojem (zařízení na zavádění vzorku, iontová optika). Hmotnostní analyzátor (iontová optika, magnet, detektor) 3. Vakuové pumpy (nízké, vysoké a ultra vysoké vakuum) 4. Řídící a vyhodnocovací elektronika, software Ne 0 Ne Magnetický sektor s energetickým analyzátorem 1919 F. W. Aston: Mass Spectrograph (Phil. Mag. 1919, 38, 09) Magnetický sektor s energetickým analyzátorem () zdroj (-) extrakce a fokusace selekce kinetické energie () (-) Většina přírodních izotopů stanovena do r. 1930 Nobelova cena za projev v r. 1934: MS mrtva, vše hotovo analýza hmotnosti r = f(m/z) B štèrbina detekce Iontový signál vs. m/z Hmotnostní spektrum Iontový signál proud, často převeden na napětí, libovolné jednotky normalizace signálu: intenzita nejvyššího píku = 100% %Int. 100 90 80 70 60 50 40 30 0 10 normalizace iontového signálu 0 600 700 800 900 1000 1100 100 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 000 100 00 300 400 500 Mass/Charge 3
Hmotnostní spektrum Hmotnost, m a.m.u., u, Da (Dalton), počet atomových hmotnostních jednotek číselně rovný molární hmotnosti m/z - účinná hmotnost, Th (Thomson) Počet nábojů, z počet elementárních nábojů iontu obvykle ±1 výjimky, např. elektrosprej: z >> 1 Ionty: pozitivní a negativní, ne kationty a anionty. Použité zkratky n číselná koncentrace (m -3 ) I proud (A), tok (m - ) T teplota (K) p tlak (Pa, Torr) R rozlišení (-) f frekvence (Hz) w úhlová frekvence (rad/s, s -1 ) a znak přímé úměry LD detekční limit, též LOD, limit of detection (obvykle mol, g, M) S/N poměr signálu k šumu (signal-to-noise ratio) RSD relativní směrodatná odchylka (relative standard deviation) Hmotnostní spektrometrie, ne spektroskopie. Vybrané veličiny v hmotnostní spektrometrii Hmotnostní rozlišení Míra separace dvou přilehlých píků. Dvě definice: 1. FWHM (full width at half maximum), R = m/ m. Max. hmotnost, při které lze ještě rozlišit píky s jednotkovým rozdílem hmotností. Energie iontu Joule, J elektronvolt, ev atomy misto molů... elektronvolty místo Joulů. 1 ev = 1.6 x 10-19 J jednoduchost: urychlovací napětí = 100 V, náboj = 1... E = 100 ev vhodné pro srovnání s energií ionizační, vazebnou, s energií fotonu atd. Tlak, p 1 atm = 760 Torr = 101 35 Pa = 1,0135 bar = 14,70 PSI Izotopy uhlíku: Izotopové paterny organických molekul 99% 1 C, 1% 13 C Patern jako funkce počtu uhlíkových atomů v molekule: C: 99% 1 C 1% 13 C C : 98% 1 C 1 C % 1 C 13 C 0.01% 13 C 13 C C 3 : 97% 1 C 1 C 1 C 3% 1 C 1 C 13 C 0.04% 1 C 13 C 13 C 10-4 % 13 C 13 C 13 C Binomická řada Relativní výskyt lehkého izotopu, a Relativní výskyt těžkého izotopu, b Počet atomů, n Např. pro n = : (ab) = a ab b Monoizotopická molekula obsahuje dané atomy ve formě jediného izotopu (u org. molekul obvykle atomy C - pouze izotopy 1 C) Použité zkratky m hmotnost molekuly (u, a.m.u., Da) z počet náboj; (-) m/z účinná hmotnost (Th, Thomson), slang: hmotnost, hmota e elementární náboj (1.6x10-19 C) U napětí (V) E intenzita elektrického pole (V/m, N/C) W energie, práce (ev, J) v rychlost iontu (m/s) r poloměr zakřivení (m) L dráha (m) l střední volná dráha molekuly t čas, doba (s) s srážkový průměr (m) s srážkový průřez (m ) m redukovaná hmotnost (a.m.u., Da, kg) Izotopové paterny organických molekul Relativní výskyt molekul v %: C 60 : 1 C 60 100 1 C 13 59 C 66 1 C 13 58 C 1 1 C 13 57 C 3 4.6 C 100 : 1 C 100 100 1 C 13 99 C 110 1 C 13 98 C 60 1 C 13 97 C 3 (normalizováno na výskyt monoizotopické molekuly /pouze 1 C/ = 100 %) Se stoupajícím n přestává být monoizotopická forma dominantní a intenzity různých forem jsou porovnatelné (široká obálka)... viz příklad dále. 4
Praktický dopad výskytu izotopů - Snížení citlivosti - Nutnost vysokého R při vysoké m/z pro správné stanovení m/z Molecular formula: C90H135N18O18S3 Resolution: 0000 at 50% %Int. 185.9 100 1851.9 Použití izotopových vnitřních standardů 80 1853.9 Příklad: 5 peptidů/proteinů s poměrem zastoupení prvků C : H : N : O : S = 30 : 45 : 6 : 6 : S R = 0 000 60 40 1854.9 C 30 H 45 N 6 O 6 S C 60 H 90 N 1 O 1 S C 90 H 135 N 18 O 18 S 3 C 180 H 70 N 36 O 36 S 6... navíc ukázán pro ruzná R C 70 H 405 N 54 O 54 S 9 C 360 H 540 N 7 O 7 S 1 C 900 H 1350 N 180 O 180 S 30 C 1800 H 700 N 360 O 360 S 60 0 0 1855.9 1857.9 185 1854 1856 1858 Mass/Charge Molecular formula: C30H45N6O6S Resolution: 0000 at 50% %Int. 617.3 100 Molecular formula: C180H70N36O36S6 Resolution: 0000 at 50% %Int. 3705.9 100 80 80 3704.9 3707.9 60 60 40 618.3 40 3703.9 3708.9 0 0 619.3 60.3 61.3 6.3 63.3 616 617 618 619 60 61 6 63 64 65 Mass/Charge 0 0 3709.9 3710.9 371.9 3704 3706 3708 3710 371 3714 Mass/Charge Molecular formula: C60H90N1O1S Resolution: 0000 at 50% %Int. 134.6 100 80 135.6 60 Molecular formula: C70H405N54O54S9 Resolution: 0000 at 50% %Int. 5559.8 100 5560.8 80 5557.8 5561.8 60 40 136.6 40 5556.8 556.8 0 0 137.6 139.6 134 136 138 140 Mass/Charge 0 0 5555.8 5563.8 5564.8 5566.8 5569.8 5555 5560 5565 5570 Mass/Charge 5
Molecular formula: C360H540N7O7S1 Resolution: 0000 at 50% %Int. 13414.4 100 1341.4 80 13416.4 13411.3 60 13417.4 Molecular formula: C180H70N36O36S6 Resolution: 500 at 50% %Int. 3706.6 100 80 60 40 0 0 13410.3 13418.4 13409.3 13408.3 13419.4 1340.4 134.4 13405 13410 13415 1340 1345 Mass/Charge 40 0 0 m/z ~ 9 3695 3700 3705 3710 3715 370 Mass/Charge Molecular formula: C900H1350N180O180S30 Resolution: 0000 at 50% %Int. 18533.4 100 18530.4 18535.4 80 18536.4 1859.4 60 40 0 0 1854. 1858.3 1857.3 1856.3 1850 18530 18540 Mass/Charge 18537.5 18538.5 18539.5 18541.5 18544.6 Molecular formula: C180H70N36O36S6 Resolution: 500 at 50% %Int. 3706. 100 80 60 40 0 0 m/z ~ 4.5 3695 3700 3705 3710 3715 370 Mass/Charge Molecular formula: C1800H700N360O360S60 Resolution: 0000 at 50% %Int. 37066.0 100 Molecular formula: C180H70N36O36S6 Resolution: 5000 at 50% %Int. 3705.9 100 80 80 3704.8 3707.9 60 60 40 m/z ~ 1 40 3703.8 3708.9 0 0 3709.9 3711.0 0 37050 37060 37070 37080 Mass/Charge 0 3714.0 3718.0 3695 3700 3705 3710 3715 370 Mass/Charge 6
Molecular formula: C180H70N36O36S6 Resolution: 10000 at 50% %Int. 3705.9 100 80 3704.9 3707.9 60 II. Ionizační techniky a zavádění vzorku vzorek (atm. tlak) vzorek (vakuum) Nežádoucí jevy nárust tlaku v iontovém zdroji ochlazování a mrznutí vzorku v důsledku vypařování adsorpce látek ze vzduchu (např. vody) na stěny iontového zdroje 40 0 0 3703.9 3708.9 3709.9 3710.9 3713.9 3717.9 3695 3700 3705 3710 3715 370 Mass/Charge Rozdělení vzorků podle skupenství Tekuté vzorky plynné vzorky kapalné vzorky (kapalný analyt, rozpuštěný analyt) Tuhé vzorky těkavé (lehké sloučeniny) netěkavé (polární, polymerní látky) Vícenásobně nabité ionty Typický příklad: vícenásobně nabité ionty [MzH] z z elektrospreje "Obálka" ve tvaru zvonu. Mezery nejsou ekvidistantní (narozdíl od izotopového paternu). Př.: m/z m = 10 000 Da z 4 5 6 7 8 9 10 m/z 501 001 1668 149 151 111 1001 S Off-line On-line In-line iontový zdroj (vakuum) vzorek Zavádění vzorků z těsnění ventil Počet zaváděných vzorků 1 vzorek Více vzorků sériově (diskrétní vzorky nebo spojitý tok) paralelně atmosferický tlak z o ventil k pumpě sonda Co můžete říci o tomto spektru? Pozn: Jedná se o část hmotnostního spektra jediné organické sloučeniny. Hodnoty m/z byly určeny s tolerancí ~ 0.1. S 1000.3 1000.7 1000.0 1001.0 Elektronová ionizace, EI (Electron impact) Klasická ionizační technika. Elektrony emitované ze žhavého vlákna jsou urychleny středně velkým napětím. Energie elektronu, E(e - ) = urychlovací napětí x náboj (1). Typická energie: 70 ev. 15 V m/z komora e - žhavené vlákno -55 V ABC přívod plynu ABC ve směru kolmém k svazku elektronù ( ) 7
Mechanismus EI Interakce elektronu s molekulou analytu ABC: e - (rychlý) ABC ABC e - (pomalé) Výsledná rovnice, ABC ABC e - je charakterizována ionizační energií ABC, H(ABC). Ionty ABC s přebytkem energie se mohou dále rozpadnout: (ABC ) * AB C, A CB atd. Stupeň fragmentace závisí na energii elektronů, E(e - ) a na struktuře analytu: a) E(e - ) ~ ionizační potenciál tvorba molekulárních iontů. Ionizační potenciál jednoduchých organických molekul ~10 1 ev. b) E(e - ) >> ionizační potenciál fragmentace. Typ fragmentace záleží na struktuře analytu; sloučeniny s podobnou strukturou mají podobná fragmentační spektra. Interpretace spekter. Knihovny spekter (> 100 000 spekter). 0. léta 0. století A. J. Dempster Chemická ionizace (CI) Tentýž iontový zdroj jako pro EI plus reaktivní plyn Reaktivní plyn (RH) CH 4, butan, H, NH 3 atd. p(abc) < 10-4 Pa p(r) ~ 0.1 Pa (l ~ 0.05 mm, mnoho kolizí ve zdroji) Mechanismus tvorby iontů a) produkce RH e - (rychlý) RH RH e - (pomalý) b) přenos náboje RH ABC RH ABC Mechanismus EI Mechanismus tvorby iontů při CI (pokr.) Prahová energie, AE (appearance energy) při níž se objeví dané fragmenty, nemusí být větší než H(ABC)! ABC ABC e - Ionizační energie ABC, H(ABC) ABC AB C e - Prahová energie AB, AE(AB ) AE(AB ) = H(ABC) D(ABC ) Dissociační energie ABC, D(ABC ) c) přenos protonu (běžnější) RH R H ABC H ABCH RH ABC R ABCH PA(R) protonová afinita - PA(ABC) E = PA(R) - PA(ABC) Absorpce elektronů při průchodu plynem ionizované látky Úbytek proudu elektronů, di při průchodu infinitesimálně tenkou vrstvičkou analytu: di = -acidx, po integraci: I = I o e -acx. I proud elektronů (A) c koncentrace molekul ABC, (cm -3 ) (c = p/rt) x tloušťka vrstvy (cm) a průřez (cm ) analogie koeficientu e v Lambert-Beerově zákonu E < 0: exotermní, preferovaná reakce E << 0: přebytek energie ABC fragmentace ABC, strukturní analýza E < 0, E 0: ABC a ABCH převládají: kvantitativní analýza molekulová hmotnost ABC vysoká ionizační účinnost (ABC) - žádná informace o struktuře Chemická ionizace (CI). Doutnavý výboj. Indukčně vázané plazma (ICP). Ionizace rychlými atomy (FAB). Ionizace (SIMS). Fotoionizace (PI). Plazmová Desorpce (PD) Kolize molekul při CI Střední volná dráha molekuly Střední dráha, kterou urazí iont mezi srážkami l = ( ps n ) -1 l(cm) = 0.66/p(Pa) (pouze hrubý odhad) Počet kolizí z = ps (8kT/(pm)) 1/ m redukovaná hmotnost, m = (m 1-1 m -1 ) -1 s kolizní průměr s průřez molekuly CI: 10 15-16 kolizí, vysoká ionizační účinnost (ABC) Porovnání CI vs EI silnější signál - vyšší šum celkově vyšší poměr S/N (LOD organických látek ~ pg) 8
Negativní chemická ionizace Tentýž iontový zdroj jako pro EI plus reaktivní plyn Mechanismus 1. Produkce termálních (pomalých) elektronů e - (rychlý) RH RH e - (pomalý) W(pomalý e - ) ~ 3/ kt T ~ 400 K E ~ 0.1 ev. Záchyt elektronu ABC e - ABC - Přednostně u sloučenin s elektronegativními skupinami (PCB, NO 3 - atd.) LD ~ pg Zavedení vzorku pro EI/CI (pokr.) 3. Netěkavé látky - Velké molekuly - Molekuly s mnoha polárními skupinami mnoho zajímavých sloučenin (proteiny, DNA, sacharidy) a) Příprava těkavých derivátů a následná standardni ionizace (EI, CI). Vhodné pro molekuly s M < 1000 Da. Příklad: esterifikace, RCOOH CH 3 OH RCOOCH 3 b) Použití klasické ionizace v desorpčním provedení. Vzorek nanesený na sondě je vsunut do iontového zdroje, kde dochází k přímé interakci elektronů se vzorkem v kondenzované formě. c) Jiné ionizační techniky Měkká ionizace: produkce molekulárních iontů aniž by došlo k jejich tepelnému rozkladu: FAB, Elektrosprej, Laserové desorpční metody 1.Plyn/těkavá kapalina Zavedení vzorku pro EI/CI Doutnavý výboj Anorganické iontové zdroje Analýza zbytkových plynů ("residual gas analysis"): otevřený iontový zdroj v komoře s plynem: p(komora) = p(plyn) Eluent ze separační kolony (GC-MS) Problém: Vysoký proud plynu z klasických kolon GC a) oddělení a sběr frakcí (split, splitter) b) rozhraní (interface) pracující bez přerušení i) tryskový separátor (particle beam) kolona pro obohacení ABC v nosném plynu vyžaduje M(ABC) >> M(nosič)... He jako nosný plyn vakuová pumpa MS Termální ionizace Indukčně vázané plasma Další techniky vhodné pro analýzu anorganických vzorků, např. laserová desorpce, jsou použitelné i pro organické látky a biomolekuly a budou zmíněny později Zavedení vzorku pro EI/CI (pokr.) Doutnavý výboj ii) membránové interface - zavedení analytu přes membránu, oddělení nosného plynu pomocí membrány c) přímý vstup z kapilární GC kolony (nižší tok nosného plynu, He) První iontový zdroj (J. J. Thompson) Analýza pevných vzorků, obvykle vodivých. Přesná a celkem citlivá analýza: RSD ~1%, LOD ~1 ppb. Výboj v Ar (p ~100 Pa): Ar vyrážejí atomy kovu M z destičky vzorku a později je ionizují na M.. Těkavý, termálně stabilní pevný vzorek Přímé vložení vzorku na sondě (sklo, keramika, ocel). Po vložení vzorku do spektrometru dochází k jeho odpařování a ionizaci v plynné fázi. (-) katoda, destička vzorku Ar 100 Pa () anoda do MS, 0.1 Pa (-) vstup do hmotnostního analyzátoru 9
Termální ionizace (TI) ICP žhavené vlákno 0.1 Pa k MS Plazma 101 kpa 100 Pa () (-) Vzorek nanesen na vlákně; vlákno odporově zahříváno. Vypařování, atomizace a ionizace: MX (s) MX (g) M (g) X (g) M (g) M (g) e - (vlákno) Obvykle 3 vakuové stupně (diferenciální pumpování). Velmi účinná ionizace, n(m )/n(m total ) = 90 100%. Ionty s jedním nábojem převládají. Nerovnovážný systém. Termální ionizace Diferenciální pumpování vlákno e - M(g) M (g) Saha-Langmuirova rovnice n(m )/n(m) exp[(w - IE)/(kT)] Pracovní funkce kovu (vlákno), W ~ 4 ev 101 kpa 1k Pa 100 Pa 1 Pa iontový zdroj MS Kov K Ca Fe Zn IE (ev) 4.6 6.0 7.8 9.4 (W IE) (ev) -0.5-1.5-3.9-5.4 účinné slabé Tři vlákna (s rozdílnou teplotou): Náhrada jednoho vlákna, které odpařuje a ionizuje vzorek příliš rychle. Stabilnější iontový tok (RSD pouze ~ 0.1 %!) Užitečné pro stanovení izotopového zastoupení. pumpa 1 pumpa pumpa 3 - často používaný koncept v MS - použit u technik ionizace při atmosferickém tlaku aerosol vzorku Ar, 1L/min radiální tok Ar, 10 L/min Induktivně vázané plazma (Inductively Coupled Plasma, ICP) plazmový hořák cívka 1. Desolvatace MX (aq, aerosol). Vypaření MX (s) 3. Atomizace MX (g): disociace na M(g) a X (g) 4. Ionizace na M (g) 101 kpa 100 Pa 0.1 Pa ionty atomy série otvorù (differenciální pumpování) ICP Supersonická tryska Žhavá plazma (5000 K) proudí dovnitř otvorem a expanduje nadzvukovou rychlostí. Náhodný pohyb atomů na atmosferické straně je charakterizován širokou distribucí kinetické energie (5000 K) a relativně nízkou střední translační rychlostí. Uvnitř se atomy pohybují nadzvukovými rychlostmi s velmi úzkou energetickou distribucí supersonické ochlazení (~300 K). Distribuce je později narušena srážkami s okolním plynem (barrel shock, Machův disk). Účinná ionizace 90-100 % většiny prvků ionizováno (velmi uniformní ionizace). Vhodné pro stanovení izotopového zastoupení (nízká systematická odchylka). Nevýhody nevhodné pro určování struktury molekul interference 10
ICP Detekční limity 1 ppt (kvadrupól) 10 ppq (magnetický sektor) pro srovnání: ICP-AES a AAS: ppm - ppb Ionizace polem (Field Ionization, FI) Vysoké elektrické pole mezi ostrými hroty, E > 10 9 V/m Odstranění elektronu vnitřním tunelovým jevem. ppm ppb ppt ppq million 10 6 billion 10 9 trillion 10 1 quadrillion 10 15 Interference 1. Nespektrální Posun ionizačních rovnováh v důsledku přítomnosti matrice, kyselin, snadno ionizovatelných prvků atd.. Spektrální Ionty izotopů Izobarické molekulární ionty Spektrální interference v ICP Tvorba molekulárních iontů v ICP 1. Plyn plazmatu a jeho reakční produkty (Ar, Ar, ArH, ArO, ArC, ArN atd.). Vzorek nebo solvent (hydridové ionty, OH, ClO, NO, CaO, LaO atd.) 3. Chemická ionizace plynů pozadí (H O, H 3 O, C x H y atd.) Odstranění spektrálního rušení 1. Matematické korekce (např. ze známé distribuce izotopů). Desolvatace aerosolu (např. vymrazení v kapalném N ) 3. Studené plazma (relativní změny ionizačního stupně) 4. Kolizní cela (termalizace iontů, posun reakčních rovnováh) 5. Spektrometr s vysokým rozlišením LDI FD PD FAB SIMS MALDI Desorpční ionizační techniky Laser Desorption/Ionization 1963 R. Honig Field Desorption 1969 H. D. Beckey Plasma Desorption 1974 R. D. MacFarlane Fast Atom Bombradment 1981 M. Barber Secondary Ion Mass Spectrometry 1976 A. Benninghoven Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization 1988 M. Karas & F. Hillenkamp, K. Tanaka Spektrální interference v ICP Příklady izobarických iontů a rozlišení potřebného k jejich stanovení. Desorpce polem (Field Desorption, FD) H. D. Beckey, Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys., 1969,, 500-503 Izotop Rušící iont Rozlišení 39 K 38 Ar 1 H 5690 40 Ca 40 Ar 71700 41 K 40 Ar 1 H 4890 44 Ca 14 N 14 N 16 O 970 1 C 16 O 16 O 180 5 Cr 40 Ar 1 C 380 56 Fe 40 Ar 16 O 500 75 As 40 Ar 35 Cl 7770 80 Se 40 Ar 40 Ar 9690 Vzorek je nasměrován (g) nebo nanešen (l, g) na emitor, žhavené kovové vlákno se speciálně upraveným povrchem. Analyty jsou tvořeny ve velmi vysokém elektrickém poli mezi ostrými hroty, E > 10 9 V/m; elektrony jsou odstraněny vnitřním tunelovým efektem. Často lze sledovat doprovodné ionizační mechanismy: - termální ionizaci - elektrosprej... během nanášení kapalných vzorků Vhodné pro analýzu organických analytů s M.W. < kda Pozn.: vyšší rozlišení často znamená nižší citlivost. 11
FAB MS spektrum peptidu v normálním a CF modu Field Ionization. Field Desorption Produkce rychlých atomů (Xe) pro FAB 1. Produkce rychlých iontů Xe. Konverze Xe na Xe: Xe (rychlý) Xe (pomalý) Xe (rychlý) Xe (pomalý) probe for liquid injection, FD surface of emitter Zdroj: Bernhard Linden 3. Eliminace (odklon) Xe zdroj zdroj Xe Xe rychlé Xe Xe () (-) rychlé Xe, Xe Xe 5 kv MS sekundárních iontů (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) Ionizace ionty paprsek primárních iontů, ~ 6 kev k MS analyzátoru sonda s pevným vzorkem, 3 kv Primární iontový svazek může být skenován, výsledkem je topografie prvků vzorku, "MS image". Rozlišení vyšší než u optického skenování (svazek primárních iontů lze lépe zaostřit, ~nm). Produkty především atomy a neutrální molekuly, též ionty. Případná postionizace možná, např. fotoionizace pomocí laseru. Anorganická i organická analýza, v poslední době i lehčí biopolymery za účasti matrice, matrix-assisted SIMS. Zdroj: R. Capriolli HK Ionizace nárazem rychlých atomů (Fast Atom Bombardment, FAB) () CF-FAB MS/MS řetězce a lidského hemobloginu Sonda s vrstvou viskózního solventu a analytu (glycerol ABC) Rychlé atomy Xe E ~ 5 kev (-) Ionizace podobná CI (organické molekuly, malé peptidy ). Sestava: off-line i on-line (průtoková sonda; tzv continuous flow, CF-FAB). Max. hmotnost ~ 10 000 Da. LOD ~ 10 pmol nebo až < 1 pmol (CF-FAB) Obvykle z = 1. Vzniklé ionty: ABCH, [ABCN ],[ABCK],[ABCH] -, fragmenty. Zdroj: R. Capriolli HK 1
Fotoionizace (Photoionization, PI) M n h M e- Nutná podmínka: nh > IE(M) Typy fotoionizace 1. Jednofotonová ionizace (single photon ionization, SPI) n = 1. Multifotonová ionizace (multiple photon ionization, MPI) n > 1 neselektivní analýza vhodná pro anorganické analyty 3. Rezonanční multifotonová ionizace (REMPI) n > 1 pokud h = W (energie elektronového přechodu M) velmi selektivní a velmi citlivé stanovení aromatické molekuly, barviva, léky Plazmová desorpce (PD) 1974 Ronald D. Macfarlane (R. D. Macfarlane, R. P. Skowronski, D. F. Torgerson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974, 60, 616.; R. D. Macfarlane, D. F. Torgerson Science 1976, 191, 90.) První technika použitá k ionizaci relativně velkých organických molekul (~tisíce Da, př. inzulín, 5735 Da). Štěp z radioaktivního zdroje narazí do vzorku naneseného na fólii. Jiný štěp uvolněný z rozpadu téhož atomu 5 Cf nastartuje záznam signálu. Mechanismy fotoionizace Experimentální uspořádání PD e - e - e - IE(M) h h h h h SPI MPI REMPI Zdroj: R. D. Macfarlane, R. P. Skowronski, D. F. Torgerson, "New approach to the mass spectrometry of nonvolatile compounds", Biochem. Biophys. Res. Commun. 60, 616-61, (1974). PI PD: příklad Příklad uspořádání: LD-PI PI jako postionizace pro laserovou desorpci 1. Puls desorpčního laseru. Desorpce obláčku (přev. neutralů) - - 3. Puls ionizačního laseru 4. Extrakce iontů Pozitivní PD MS ribonukleázy A z hovězí slinivky - - (D. M. Bunk, R. D. Macfarlane Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199, 89, 615-619) 13
Charakteristika PD Radioaktivní zdroj kalifornia 5 Cf. Energie fragmentů ~MeV. Tvorba molekulárních iontů, iontových klastrů a iontů s více náboji. Vhodné i pro těžké analyty MALDI ESI Nevýhody - radioaktivní zdroj - zdlouhavá akumulace signálu Pro ionizaci těžkých analytů dnes upřednostňovány MALDI a ESI. Zdroj: www.nobel.se October 9, 00 3 Laserová desorpce/ionizace (LDI). Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice (MALDI). Sprejové ionizace: Termosprej (TSI). Ionsprej (ISI). Elektrosprej (ESI). Desorpční elektrosprej (DESI). 1987 Karas & Hillenkamp melitin kyselina nikotinová m/z = 845 1988 Tanaka lysozym Co/glycerol m/z = 100 87 (heptamer) LDI, MALDI Schema MALDI (detail) Laserová desorpce/ionizace (Laser Desorption/Ionization, LDI) S objevem laseru v 60. letech 0. století Zpočátku anorganické (R. Honig, Appl. Phys. Lett. 1963,, 138-139), později organické látky (M. A. Posthumus, P. G. Kistemaker, H. L. C. Meuzelaar, M. C. ten Neuver de Brauw, Anal. Chem 1978, 50, 985). Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) Vhodná pro těžší analyty, polymery, biomolekuly. Karas, M; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53-68. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988,, 151. MALDI Puls laseru Analyt Matrice Plynná fáze Vrstva vzorku 14
Schema LDI (MALDI) Běžné matrice pro MALDI sinapinic acid (SA) (3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid) gentisic acid (DHB) (,5-dihydroxybenzoic acid) laserový puls sonda s tenkou vrstvou vzorku U 1 U (U 1 > U ) pro MS, obvykle TOFMS a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) (HPA) 3-hydroxypicolinic acid (3-hydroxy-- pyridinecarboxylic acid) Princip LDI a MALDI Běžné matrice pro MALDI 1. Velmi krátký puls laseru, typicky t ~ ns (LDI, MALDI), max. ms. Molekuly se odpaří dříve, než se rozloží. Ochlazení expanzí: konverze E vib na E trans (collisional cooling). ferulic acid (4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid) dithranol (DIT). Energie je absorbována převážně matricí (M), ne analytem. e (matrice) >> e (analytu), c(matrice) >> c(analytu) Matrice MH, M, M*, fragmenty, ionty fragmentů. Analyt, rozptýlený v matrici, se odpařuje spolu s matricí. ',4',6'-trihydroxyacetophenone (THAP) '-6'-dihydroxyacetophenone 3. Matrice se podílí na ionizaci analytu ABC. Matrice je excitována po absorbci jednoho či více fotonů. Dominantní ionizační mechanismus = přenos protonu: MH ABC M ABCH. Požadavky na matrici (MALDI) Běžné matrice pro MALDI 1. Absorbce při vlnové délce použitého laseru (UV, IR).. Tvorba žádoucích krystalů s analytem (empirie). 3. Obvykle kyselina (účinný přenos protonu na analyt). 4. Stabilní, nereagující s analytem, nepříliš těkavá. nicotinic acid-n-oxide,-(4-hydroxy-phenlyazo)-benzoic acid (HABA) Typy matricí aromatické kyseliny (Karas & Hillenkamp) glycerol s přídavkem jemného kobaltového prášku (Tanaka) modifikovaný povrch, např. Si - DIOS (Siuzdak), SELDI trans-3-indoleacrylic acid (IAA) picolinic acid (PA) (-pyridine carboxylic acid) 15
Matrice - aplikace Vliv energie laseru peptidy < 10 000 peptidy, proteiny > 10 000 oligonukleotidy < 3 kda nukleové kyseliny > 3 kda syntetické polární polymery syntetické polární polymery karbohydráty CHCA, DHB SA, DHB THAP HPA DHB DIT, IAA DHB, CHCA, THAP Velmi výrazná závislost spekter na energii laseru, přesněji na výkonu vztaženém na plochu, tzv. hustotě výkonu (power density, PD). Signál (ABCH ) fragmentace pokles rozlišení Přídavky komatricí (např. monosacharidů) zlepšení krystalizace, homogenity vzorku, rozlišení, potlačení fragmentace 0 pracovní oblast PD PD T Vlastnosti matrice Vliv energie laseru CHCA: DHB: horká matrice peptidy < 10 000 Da vhodná pro PSD (strukturní analýza) studená matrice univerzální použití Prahová hustota výkonu, PD T výkon laseru vztažený na plochu, při kterém se začínají objevovat píky iontů analytu ve spektru. Při PD > PD T : Signál (ABCH ) = k.pd n, kde n = 4 6. Malá změna energie vede k velké změně signálu iontu ABCH. V praxi obvykle běhěm měření pomalu zvyšujeme energii za současného posouvání terčíku se vzorkem a sledujeme spektra z jednotlivých laserových pulsů. Po zjištění prahové energie nastavíme energii asi 10 30% nad prahovou hodnotou a akumulujeme spektra (100-1000) za občasného posouvání terčíku. Lasery UV-MALDI 337 nm dusíkový laser (nejlevnější a nejběžnější) 355 nm Nd:YAG (3xf) 66 nm Nd:YAG (4xf) 193 nm ArF... fragmentace! Pozn.: YAG lasery jsou dražší, ale mají delší životnost a dosahují vyšších frekvencí (khz vs. Hz). Akumulace spekter zpravidla zaznamenáváme průměr z 100 1000 desorpcí zvýšení odstupu signálu od šumu a reprodukovatelnosti signál, S n šum, N n signál/šum, S/N n IR MALDI.94 mm Er:YAG laser 10.6 mm CO laser 16
Iontový signál MALDI MS spektrum Modelové spektrum vzorku peptidů, Pep 1 a Pep Na K ionty matrice, fragmentů matrice a analytu a aduktů ionty klastrů Pep 1 H Pep H Pep 1 Na Pep Na 0 500 1000 1500 m/z [ABCH], [ABCH], dimer [(ABC) H] adukty s alkalickými kovy a matricí [ABCNa], [ABCK], [ABCMH] fragmenty matrice a analytu, iontové klastry, např. [M Na] Potlačení matrice v ideáním případě pouze pík analytu. MALDI vzorek = analyt matrice c(analyt) = 0.1-10 mm c(matrice) = 1-100 mm terčík: ocel, Al, syntetické polymery Příprava MALDI vzorků detail MALDI vzorku www.srsmaldi.com Charakteristika MALDI jedna ze dvou nejpoužívanějších metod pro biopolymery (vedle ESI) měkká ionizace jednoduchá spektra, většinou z = 1 nebo z = -1 pulsní ionizace (předurčena ke spojení s TOFMS) limit detekce ~ amol (peptidy, při vhodné přípravě) rychlá příprava a analýza vzorků Zásady při přípravě MALDI vzorků Rekrystalizace matrice Čerstvý roztok matrice Vhodná volba solventu (ACN, EtOH, MetOH, aceton, voda) ph matrice < 4 (úprava např. 0.1 % TFA) Analyt musí být rozpuštěný Purifikace analytu před MALDI analýzou Neznámý analyt příprava série roztoků o různých koncentracích Nanesené vzorky jsou obvykle stabilní (skladování terčíků se vzorky) Dokonalé očištění terčíku Charakteristika MALDI - obtížná kvantifikace (nutnost vnitřního standardu) - hledání pravého místa na vzorku - často intenzivní pozadí v oblasti nízkých m/z (matrice, fragmenty a klastry matrice) - vzájemné rušení analytů Metody přípravy vzorků vysušení kapky směsného roztoku (dry droplet) smíchání a vysušení na terčíku (quick & dirty) urychlení vysoušení ve vakuu (vacuum drying) nejprve vrstva matrice v těkavém solventu (fast evaporation) vrstva matrice, pak vrstva matrice s analytem (overlayer) vrstvy: matrice, analyt, matrice (sandwich) krystaly rozdrceny, převrstveny roztokem vzorku (crushed crystals) rozpuštění vzorku v kapce acetonu (acetone redeposition) nanášení na rotující terčík (spin coating) pomalý růst krystalů (slow crystallization) nanášení elektrosprejem (electrospray deposition) modifikované terčíky - hydrofilní/hydrofobní rozhraní 17
Signal Signál Další metody přípravy vzorků speciální metody (ES, nanášení ve vakuu, MALDI z aerosolu...) mikrometody mikroterčíky, piezoelektrické pipetory, nanášení z kapiláry velikost ohniska velikost vzorku maximální citlivost vyšší hustota vzorků na terčíku Perspektiva MALDI MS analýza početných sérií biologických vzorků peptidové mapování pro identifikací proteinů (MALDI MS produktů enzymatického štěpení proteinů) peptidy, proteiny, oligonukleotidy, sacharidy Mikrometody vzorek: 1 mm laser: 50 mm Slaser 50 0. 5% S 1000 vzorek Spojení se separačními technikami výhoda archivování vzorků na MALDI terčíku uvedení dostupných MS/MS spektrometrů pro MALDI doplňková technika k ESI (odlišná ionizační účinnost pro různé analyty) Vliv přítomnosti solí MALDI spektrum vzorku peptidu v přítomnosti solí Na a K 0.6 MS analýza početných sérií biologických vzorků 1, 10, 96, 100, 384, 1536... vzorků/terčík 0.4 0. 0.0 PepH PepNa PepK 0 00 400 600 800 1000 100 m/z odsolení vzorku nutné (přítomnost solí tvorba aduktů, citlivost ) 384 vzorků/terčík Redukce vlivu solí segregace na terčíku... výběr vhodného krystalu pro desorpci přídavek kyselin (TFA, HCOOH, HCl), NH 4 solí opláchnutí krystalů na terčíku katex na terčíku odsolení vzorku před nanesením: separace, dialýza, ZipTip (C 18 ) 100 80 60 MALDI MS identifikace hovězího albuminu z produktů enzymatického štěpení 1178.3 1439.47 1639.51.E4 1.. H O 3. 50% ACN ZipTip 40 vzorek: peptid, Na Na (odpad) peptid (MALDI terčík) 0 97.34 1193.37 1567.36 1750.5 1867.50 550.60 168.50 854.35 149.361419.39 764.33 555.31 61.34 3815.5 1905.46 358.8 0 0 500.0 100.0 1900.0 600.0 3300.0 4000.0 m/z Analyt: 1 pmol tryptického digestu BSA, odsoleno pomocí ZipTip C18 Matrice: 10 mg/ml CHCA v ACN/0.1% TFA : 70/30 Příprava vzorku: dried-droplet. MS: Voyager DE-STR 18
Mikrometody - příklad (A) úprava vzorku a dávkování (B) reaktor s imobilizovaným enzymem (C) mikropipetor (D) nanovialky (300 x 300 x 0 mm) na MALDI terčíku (E) automatizovaná MALDI-TOF MS Ekstrom, S., Onnerfjord, P., Nilsson, J., Bengtsson, M., Laurell, T., Marko- Varga, G. Anal. Chem. 000, 7, 86-93 eluent z LC nebo CE kolony vyhřívaná kovová kapilára (~ 00 ºC) Termosprej (TSI) sprej kapek k MS Roztok vře ve špičce kapiláry, tvoří se kapky, později suchý aerosol a ionty MH. Spektra podobná jako u CI, převládají molekulární ionty. Do zdroje mohou být vloženy elektrody přídavný výkon vyšší účinnost ionizace. Elektronegativní sloučeniny mohou tvořit negativní ionty. (Do komory může byt vložen přídavný zdroj elektronů, aby zvýšil tvorbu negativních iontů M -.) Použití těkavých pufrů - prevence zacpávání špičky kapiláry (NH 4 Ac). (-) k mechanické pumpě (100 Pa) Srovnání LDI a MALDI Ionizace svazkem částic (Particle Beam Ionization, PBI) LDI MALDI Ionizace relativně tvrdá měkká Vzorek pouze analyt analyt v přebytku matrice Max. m (Da) <10 000 10 6 Typický analyt malé organické molekuly, malé peptidy, syntetické polymery peptidy, proteiny, DNA, sacharidy, syntetické polymery Typická sestava PBI pro GC a LC. (zdroj: www.micromass.co.uk ) On-line ionizační techniky Ionizace za atmosferického tlaku (Atmosferic Pressure Ionization, API, též sprejové ionizační metody) Společné znaky Analyt: polární, často ionizovaný v roztoku. Vyhřívané kapiláry a jiné elementy iontového zdroje (stovky ºC) Přídavné elementy pro zvýšení ionizační účinnosti (svazek elektronů, el. oblouk) Diferenciální pumpování Často po předcházející separaci... D separace (MS jako druhý rozměr). Fáze ionizačního procesu: 1) tvorba kapek aerosolu ) odpařování rozpouštědla 3) analýza iontů Princip Ionizace svazkem částic (Particle Beam Ionization, PBI) Odvozen od generátoru monodisperzního generátoru aerosolu: R. C. Willoughby, R. F. Browner, "", Anal. Chem., 56, 66-631, (1984) Velmi podobné TSI a vyhřívanému zmlžovači. Přídavný zdroj svazku částic, obvykle He. Separátor He od iontů. Přídavný EI zdroj může být použit = výsledkem jsou EI spektra (s vyšším šumem v důsledku přítomnosti iontů a molekul rozpouštědla). Charakteristika Spektra podobná jako v případě TSI. Více fragmentů. Méně citlivý než TSI a ESI. Vhodný pro tepelně stálé, neiontové sloučeniny s nepříliš vysokou hmotností. 19
Vyhřívaný nebulizér Princip ESI plyn LC, CE plyn atmosferický tlak vyhřívaný element výboj N (vysoušení vzorku) Ionty extrahovány skrz sérii otvorù do MS analyzátoru - - - - - - - - Spektra podobná CI, obvykle záchyt 1 protonu ([MH] ). Nízké procento fragmentace (měkká ionizace). Vhodné pro střední hmotnosti (~000 Da). Struktura?... Nutno použít přídavnou kolizní celu (MS/MS). - Iontový sprej (Ion Spray, IS) plyn LC, CE plyn vyhřívaný element atmosferický tlak () (-) N (vysoušení vzorku) Ionty extrahovány skrz sérii otvorů do MS Pouze pozitivní ionty proniknou přes elektrody, negativní jsou odstraněny. Vícenásobně nabité ionty [MH], [MH], [M3H] 3, [M4H] 4 atd. Plněné LC kolony se splitterem, mikrokolony, kapilární kolony. Electrospray, Nanospray Elektrosprejová ionizace (ESI) * Yamashita, M; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4451. * Yamashita, M; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4671. Wilm, M. S.; Mann, M. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1994, 136, 167. Schema infúze, mlc, CE jehla (křemen, pokovený křemen, kov) přídavná kapalina (sheath liquid) - 1 5 kv není nutná přídavný plyn - není nutný atmosferický tlak Protielektroda s otvorem, "nozzle" (0 V) vyhřívaná kapilára 100 Pa k MS "skimmer" vakuum Princip ESI Tvorba Taylorova kužele vlivem elektrického pole. Koncentrace kladného náboje v kuželi, destabilizace menisku a emise kapek s nadbytkem kladného náboje. Snižování objemu a zvyšování hustoty povrchového náboje kapek díky vypařování rozpouštědla. Nesymetrické štěpení nabitých kapek (Rayleighův limit stability); výchozí kapka ztrácí ~15% náboje ale jen % objemu. Velikost kapek: mm nm. Počet nábojů v kapce: 10 5 10. (Velikost makromolekuly ~ nanometry.) Vznik iontů v plynné fázi. Sekundární reakce v plynné fázi. Transfer iontů do komory MS. Nedochází k výboji; výboj je nežádoucí. 0
Provedení ESI Přídavný plyn proud N, vyhřívaná kapilára za otvorem: dokonalejší desolvatace, zabránění tvorby klastrů. Koaxiální proud kapaliny možný (... přídavná koaxiální kapilára). Rozměry jehly: i.d. < 100 mm, o. d. 100 mm 1 mm, hrot < 100 mm. Vzdálenost hrotu od protielektrody: 1 3 cm. Tok < 10 ml/min. Nanosprej: menší rozměry, bez přídavné koaxiální kapaliny a nuceného pumpování, tok < 100 nl/min. Uspořádání trysky a otvoru (... oddělení iontů od balastu): Tvorba vícenásobně nabitých iontů Vyšší z snižuje m/z lze použít hmotnostní analyzátor s nižším limitem max. hmotnosti i pro ionty o velmi vysoké hmotnosti. Ke zjištění m a z stačí pouze sousední píky: (m/z) n = (mn)/n (m/z) n1 = (mn1)/(n1) Ovlivnění náboje z? ph roztoku: ph z ph z, negativní náboj převládá b - zářič, jiný zdroj e - (záchyt e - analytem z ) - Spektrum směsi složitější (ale může být vyhodnoceno). Jedna látka je přítomna v několika formách a dává několik píků ve spektru... komplexní spektra, snížená citlivost. - Často další píky, např. adukty [MNa], [MK] atd. Provedení ESI Uspořádání trysky a otvoru... oddělení iontů od balastu - v ose (on-axis) - mimo osu (off-axis) - diagonální (tilted) a kolmé (orthogonal) - Z-sprej Připojení el. napětí - přes přídavnou kapalinu (sheath flow) - kapalinový spoj (liquid junction) - pokovený hrot kapiláry (sheathless inteface) ESI Aplikace elektrického pole (nozzle-skimmer) fragmentace ve zdroji. K objasnění struktury - přídavná komora pro kolizní disociaci za prvním MS. Signál v ESI je závislý na koncentraci analytu, c(analyt); při velmi nízkých koncentracích je závislý na látkovém množství analytu (nanosprej). Signál α c(analyt) (10-7 10-3 M), při vyšších c se růst zpomaluje (plato). Vlastnosti ESI Velmi měkká ionizace vhodná pro biomolekuly. Velmi vysoký limit max. hmotnosti, m ~ 10 6 (m/z mnohem menší). Ionizace těžkých polymerů (i celého viru). Tvorba vícenásobně nabitých iontů [MzH] z "Obálka" ve tvaru zvonu. Typické pro iontový sprej či elektrosprej. Mezery nejsou ekvidistantní (narozdíl od izotopového paternu). S Faktory ovlivňující ESI Typ analytu Jehla, sprejovací špička (rozměry, uspořádání) Napětí mezi jehlou a protielektrodou Spotřeba roztoku (solventy, additiva, soli, iontově párovací reagenty) Průtok vzorku, přídavné kapaliny a sušícího plynu Teplota ústí kapiláry m/z Př.: m = 10 000 Da z 4 5 6 7 8 9 10 m/z 501 001 1668 149 151 111 1001 1
molekulová hmotnost Použití těkavých pufrů: - CH 3 COOH - HCOOH - TFA (kyselina trifluoroctová) - NH 4 soli těkavých kyselin Koncentrace solí < 0 mm Vystříhat se použití síranů, fosfátů Zásady v ESI Pravoúhlý nebo Z sprej mohou částčně pomoci v případech, kde se nelze řídit výše uvedenými zásadami. Pro pozitivní ionizaci pk a (elektrolyt) < pk a (analyt) Pro negativní ionizaci pk b (elektrolyt) < pk b (analyt) Důkladná příprava vzorku = snazší analýza odsolení, odstranění surfaktantů a dalších příměsí DESI Desorption electrospray ionization - elektrosprej v desorpčním provedení - interakce s povrchem - příklady aplikací: léčiva v tabletách kokain na bankovkách metabolity na pokožce - široká skupina ambientních technik (DART, MALDESI, LAESI...) Z. Takáts, J. M. Wiseman, B. Gologan, R. G. Cooks Science 306, 471 (004) Přehled nejpoužívanějších API technik Nejpoužívanější API techniky v organické analýze: ESI, APCI a APPI Analyzátory. Základy iontové optiky. Wienův Filtr. Energetické 4 analyzátory (E). Hmotnostní analyzátory. Magnetický sektor (B). APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) - pneumatický zmlžovač - reagent = solvent (mobilní fáze), aditiva... podobné CI - energie pro uskutečnění reakce: - elektroda pro koronový výboj před vstupním otvorem - vyhřívaný zdroj - nulové napětí na jehle (rozdíl oproti ESI) APPI (Atmospheric Pressure Photoionization) - pneumatický zmlžovač - UV výbojka (např. kryptonová) pro fotoionizaci - nulové napětí na jehle (oproti ESI) - vyhřívaný zdroj, případně další přídavné elementy - APLI: budícím zdrojem je laser Použití ESI, APCI a APPI Schematické znázornění aplikačního použití ESI III. Hmotnostní analyzátory Základy iontové optiky. Simulace pohybu iontů. Energetický analyzátor Hmotnostní analyzátory APPI APCI Detekce iontů Základy vakuové techniky Spojení separace MS. Čipy polarita Nové techniky/technologie
Základy iontové optiky Analogie se světelnou optikou štěrbina štěrbina čočka čočka hranol, mřížka W kin : energetický analyzátor, deflektor m/z: hmotnostní analyzátor zrcadlo iontové zrcadlo optické vlákno iontový vodič Odlišnosti od světelné optiky vlnová délka, l kinetická energie, W kin hmotnost/náboj, m/z index lomu neměnný možné ladění elektr. nebo magn. pole časově proměnná pole během experimentu nezávislé na intenzitě vzájemné odpuzování iontů Čočka (unipotenciálová, elektrostatická, einzel lens) V analogie klasické čočky ohnisková vzdálenost může být změněna změnou napětí V vyšší iontová propustnost ve srovnání se štěrbinou fokální vzdálenost není funkcí m/z (pro ionty ze stejného iontového zdroje) ideální funkce pouze pro ionty o stejné kinetické energii - pokud je vzájemné odpuzování iontů zanedbáno (space-charge effect) zobrazená čočka je jen jednou z mnoha možných sestav Lorentzova a Coulombova síly Magnetické pole o indukci B: Iontové zrcadlo (reflektor, reflektor) dvě mřížky B F v F magn. = ze ( v x B ) Coulombova síla v el. poli E: F el. = zee Celkově: F = ze (E v x B ) Pro jednoduchost dále pouze: F el. = zee F magn. = zevb v x Kinetická energie iontu vs. potenciální energie elektrického pole: 1) mv x iontové zrcadlo: iont se vrací stejnou rychlostí, jakou zeu pronikl přes vstupní mřížku ) mv x energetický filtr: dostatečně rychlé ionty pronikaji druhou zeu mřížkou polopropustné zrcadlo Iontová zrcadla: s mřížkami a bez mřížek, různý průběh E Použití: např. ke korekci počáteční energetické disperze v TOF MS. 0 U Elementy iontové optiky Konstrukce iontového zrcadla se stupni Štěrbina vymezení paprsku vymezení vs. propustnost R 1 R 1 R 1 R 1 R 1 R 1 R R R R R R R R R R Deflektor odklonění iontů deflektory pro x, y skenování -V V (U ) mřížky: definice ekvipotencionálních rovin prstence: elektrostatické stínění potenciálu okolí (vakuové aparatury) potenciály prstenců a mřížek jsou definovány pomocí série rezistorů a U 3 U 1... urychlovací napětí U 3 >U 1 3
Vlastnosti iontu Vlastnosti iontů m/z hmotnost/náboj v rychlost (kinetická energie, W = mv /) t čas x, y, z souřadnice a úhel (směr) t 0 čas zrodu (index 0 zrod iontu) Vlastnosti skupin iontů (nejčastěji o totožném m/z) popsány disperzemi, distribucemi v (W), x, y, z, t 0, a Wienův rychlostní filtr Pro iont letící středem filtru platí: V zee = zevb ( E ) L E v B... prolétají pouze ionty o určité rychlosti. V případě, že všechny ionty byly urychleny napětím U, platí mv zeu m eb U z E Wienův filtr lze použít k analýze hmotnosti (m/z). Vlastnosti iontů Př.: Distribuce počáteční rychlosti při MALDI (P v pravděpodbnost výskytu molekuly o rychlosti v) P v protein matrice Energetický analyzátor; elektrostatický analyzátor (ESA, E) vstupní štěrbina iontový zdroj L V -V r ESA výstupní štěrbina U 0 1000 000 v 0 (m/s) Wienův rychlostní filtr Energetický analyzátor v V/ -V/ B L Zrychlení: mv zee, kde E. V r L Energie: Poloměr zakřivení: mv zeu U r E Příčné elektrické pole mezi dvěma plochými elektrodami Příčné magnetické pole Vektor intenzity elektrického pole E je kolmý na vektor magnetické indukce B Na iont půspbí opačně orientované el. a magn. síly Poloměr zakřivení je přímo úměrný kinetické energii iontu. Ve vztahu nehraje roli m/z. I tlustější rovnoběžné svazky iontů jsou zaostřeny. Zaostření může být optimalizováno v obou dimenzích, použije-li se plechů zakřivených v obou rozměrech (i axiálně). Sektor tvar výřezu z kruhu 4
Magnetický sektor (MAG, B) Quadrupólový analyzátor (Q, q) Iontový cyklotron (ICR-FT-MS) Iontová past (IT) Průletový, Time-of-flight (TOFMS) Hmotnostní analyzátory Princip magnetického sektoru m eb r z U Způsoby skenování spektra: Posunem výstupní štěrbiny, r. Konst. U, B. Změnou U, konst. B. Problémy s nízkou extrakční účinností při nízkých hodnotách U. Změnou B, konst. U. Dříve obtížné, nyní převládající řešení. Peak switching Skoková změna některé z proměnných. Vhodné pro monitorování omezeného počtu druhů iontů (např. přepínáním U). Magnetický sektor (MAG, B) Tandem elektrostatický analyzátor - magnetický sektor vstupní štěrbina iontový zdroj () magnetický sektor B........ r m 1 m detektor m 1 /z 1 > m /z Přímá geometrie (Forward-geometry, ESA-MAG, EB) 1. energetický analyzátor: výběr iontů se specifickou kinetickou energií. magnetický sektor: hmotnostní analýza iontový zdroj U -V B.... Vektor intenzity magnetického pole B je kolmý k vektoru rychlosti iontů proudících do sektoru z iontového zdroje. ESA V.. MAG detektor Princip magnetického sektoru 1.) Lorentzova síla = dostředivá síla: mv Bzev r.) Kinetická energie = urychlovací energie: m ebr z v mv zeu m eb r z U Tandem EB Disperze vlastností iontů (v, x, a) a nestabilita polí (B, U) ovlivňují kvalitu spekter. Zařazení ESA před MAG řeší problém disperze rychlosti v (kinetické energie W kin ) iontů vstupujícich do magnetického sektoru. Praktické geometrie EB: 1. Nier-Johnsonova 90 o ESA 60 o MAG výstup stále zaostřen pro daný poloměr, r vhodná pro skenovací spektrometry. Mattauch-Herzogova 31.8 o ESA 90 o MAG jedna fokální rovina pro ionty o různých hmotnostech vhodná pro plošný detektor (fotodeska, pole) 3. Matsudova vhodná pro kompaktní přístroje 5
Mattauch-Herzogova geometrie 5 Kvadrupólový filtr (Q). Iontová past (IT). Lineární past (LT). Iontový cyklotron (FT-ICR-MS). Orbitrap (O). Elektrostatická past. Nier-Johnsonova geometrie Kvadrupólový hmotnostní filtr (Quadrupole MS, Q, q) r -U-Vcos(wt) y z x UVcos(wt) 4 tyče hyperbolického (též kruhového, čtvercového nebo jiného) průřezu U... DC složka napětí V... AC (RF) složka napětí w úhlová frekvence, w = pf, f = 1-3 MHz, fázový posun 180 o Další kombinace E a B Reversní geometrie (Reverse-geometry, BE) 1. magnetický sektor: hmotnostní filtr. energetický analyzátor: analýza iontů podle kinetické energie MIKES (Mass-Analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry) první MS/MS technika, tandemová hmotnostní spektrometrie (1973) 1. Magnetický sektor propustí ionty o určité hmotnosti.. Metastabilní ionty se rozpadnou v oblasti mezi magnetickým a energetickým analyzátorem. 3. Dceřinné ionty vzniklé z rozpadu se rozdělí podle kinetické energie v energetickém analyzátoru. Kvadrupólový hmotnostní filtr Rovina xz: těžké ionty procházejí Rovina yz: lehké ionty procházejí... pouze ionty o specifické m/z projdou kvadrupólovým filtrem, ostatní ionty jsou odchýleny. Celá řada hybridních přístrojů založených na E a B: EBE, BEB, EBEB, BEBE... 6
Diagram stability... grafická reprezentace řešení Mathieuových rovnic, které popisují pohyb iontů v kvadrupólovém filtru. a m1 m m-1 konst. a/q (konst. U/V) a 8 eu ( m ) w r z oblast propustnosti q q 4eV ( m ) w r z Trajektorie iontů v kvadrupólovém filtru Rozlišení je voleno hodnotou směrnice skenovací přímky (a/q) xz xz yz yz xz Trajektorie iontů v kvadrupólovém filtru xz Vlastnosti kvadrupólového filtru Zaznamenávání spektra r a f obvykle konst., současné skenování U a V při konst. U/V. Limit max. hmotnosti ~ 000. yz yz ( ) 0.316 max m V ~ [V, cm, MHz] z r f Zýšení limitu m/z : V, r, f. Rozlišovací schopnost řádově ~ 10 3 podobné pro všechny kvadrupólové analyzátory 7
Vlastnosti kvadrupólového filtru Zvýšení rozlišení. (Rozlišení, R < 10 000, obvykle R < 000.) Pro urychlovací napětí, U acc (směrem do kvadrupólu): m eu z v acc l v t t m l z eu acc Pro danou délku kvadrupólu, l, musí být napětí U acc dostatečně malé, aby iont strávil v kvadrupólu desítky - stovky cyklů o frekvenci w během doby průletu t. Zvýšení rozlišení též přesnější mechanickou výrobou. Kvadrupólový filtr Externí zdroj problémy s okrajovým polem (fringe field), nestabilní dráhy; významné % iontů se nedostane dovnitř hmotnostní diskriminace - těžké ionty, které stráví delší dobu v okrajovém poli, jsou více ovlivněny řešení: - vstupní elektrostatická čočka - vstupní RF kvadrupól (q), hexapól nebo oktapól (pouze RF složka: a = 0, U = 0 neselektivní filtr propouštějící všechny m/z... iontový vodič ) Trojitý kvadrupól (QqQ) populární tandemový hmotnostní spektrometr pro CID prostřední kvadrupól (q, pouze RF složka) slouží jako kolizní cela Kvadrupólová iontová past (Ion trap, IT) 1953 Wolfgang Paul (Paulova past) - téměř bez povšimnutí 1983 Finnigan - komerční přístroj (dnes nejprodávanější MS) Schema iontové pasti vstupní ionty prstenec víčka detektor DC AC DC DC: stejnosměrné napětí nebo zem AC: stejnosměrné střídavé napětí, U Vcos(wt) z r Bruker, Model ESQUIRE-LC a z a z q z m 3 m m 1 16eU ( m ) w r z 8eV ( m ) w r z Diagram stability iontové pasti oblast nestability: ionty opouštějí past štěrbinami ve víčkách q z m 3 > m > m 1 (z = 1) oblast stability: ionty oscilují uvnitř pasti, jsou "lapeny" (storage mode) q z V/(m/z) pro pohyb podél osy z (a = 0, U = 0) Skenování: zvyšováním V jsou vypuzovány nejprve lehčí a posléze těžší ionty 8
Iontová past Experiment zahrnuje fáze ionizace, akumulace, sken a detekce. Akumulace ionů: ionty lze sbírat i během ionizačního pulsu - výsledkem jsou velmi nízké detekční limity. Doba cyklu akumulace - detekce závisí na požadavcích: Vyšší citlivost delší akumulace. Širší rozsah m/z, vyšší m delší sken. Vyšší R pomalejší sken. Rezonanční vypuzení (resonant ejection) iontů o specifické m/z přivedením přídavného RF signálu na víčka pasti. Vytvoření "díry" v oblasti stability. (1983, G. Stafford: mass selective instability mode ) Pufrovací plyn (o nízké hmotnosti: He, 1 mtorr) Mnohem lepší výsledky než pouze pro samotný analyt. Srážky analytu s pufrovacím plynem vedou k lepší distribuci energie mezi molekulami analytu. Výhodné pro spojení GC-MS. Iontová past Iontová transmise polovina iontů může být detegována Fyzická omezení volba rozměrů, napětí a frekvence omezena. Maximální dynamický rozsah (10 6 pro 1 druh iontu) omezen: - minimum citlivostí (i 1 iont může být detegován) - maximum max. množstvím lapených iontů: pro vyšší množství iontů než 10 6 přestává past postupně fungovat - vzájemné odpuzování iontů. Pozor, jde o sumu iontů všech m/z! Lineární past Lineární past neboli D past vychází z kvadrupólového filtru/iontového vodiče. Iontová past popsaná dříve je někdy označována jako 3D past. Ionty jsou injektovány do RF (RF-only) kvadrupólu a poté zadrženy zvýšením potenciálu na postranních víčcích, takže oscilují v potenciálové jámě kvadrupólu. Později jsou ionty postupně vypuzovány otvory v tyčích nebo víčcích a detekovány. Dva způsoby vypuzení iontů z LT: A. Schwartz, J.C., Senko, M.W., Syka, J.E.P., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 00, 659. B. Hager, J.W., Rapid Comm. Mass Spec. 16, 000, 51. Iontová past MS/MS - past může nahradit tandem dvou spektrometrů srážkově indukovaná (aktivovanou) disociace, většinou s He CID, CAD: collisionally induced (activated) dissociation Vysoké R v praxi řádově 10 3, obvykle do 5 000 Max. hmotnost, m/z max řádově 10 3, ale i ~ 70 000 (rezonanční vypuzení) Miniaturizace: iontová mikropast, past na čipu (i pro kvadrupólový filtr) celková velikost 1 cm vhodné např. pro vesmírný výzkum - mnohem náročnější tolerance, obtížná výroba - horší parametry (R, m/z max ) Lineární past s radiálním vypuzením detector I - detector II Ionty jsou vypuzeny z LT v radiálním směru. (Zdroj: Schwartz, J.C., Senko, M.W., Syka, J.E.P., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 00, 659.) 9
Lineární past s axiálním vypuzením Srovnáni kvadrupólových analyzátorů QIT QQQ LQIT Citlivost - Dynamický rozsah - Rozsah m/z - MS 3 - Ionty jsou vypuzeny z LT podél osy kvadrupólu. (Zdroj: J. C. Y. Le Blanc et al. Proteomics 3, 004, 859-869.) Neutral loss sken/precursor sken - Správnost m/z - Rozlišení - Výhody D vs. 3D pasti Účinnost zachycení: 50-75% (3-D: 5 % - 0%, a závisí na hmotnosti) Účinnost extrakce: 5-50% (3-D : 0%) Citlivost: 5-10 násobný vzrůst Iontová kapacita: 0-30 x vyšší než u 3-D Lineární rozsah vzrostl o více než řády až na 10 6 Rozlišení: ~10 000 při rychlosti skenu 300 a.m.u./s Širší možností manipulací s ionty (akumulace, skeny...) Iontový cyklotron (FT-ICR-MS) (Fourier transform - ion cyclotron resonance - mass spectrometer) typ iontové pasti geometrie: kubická, cylindrická, hyperbolická Past se skládá z dvou párů elektrod a dvou víček: B excitace x z y B excitace detekce detekce Rozdíly mezi kvadrupólovým filtrem a pastmi FT-ICR-MS Kvadrupólový filtr - nezachytává ionty - pouze iont s jistou hodnotou m/z může projít filtrem v daném okamžiku Ionty jsou zavedeny do pasti podél osy z (rovnoběžně s vektorem B), lapeny v potenciálové jámě (zvýšením potenciálu na víčkách), excitovány elektrickým polem kolmým k vektoru B a indukčně detekovány.... skenující přístroj znamená ztrátu iontů a tím i nižší citlivost (vyjma režimu single ion monitoring, kdy je výhodnější)... space charge jevy jsou mnohem méně výrazné, což vede k vyššímu dynamickému rozsahu Pohyb iontu v magnetickém poli: mv Bzev r v r B Úhlová (cyklotronová) frekvence: w v r Be ( m ) z 30
Vlastnosti FT-ICR-MS - (supravodivý) magnet s velkou magnetickou indukcí B ~ 10 Tesla - velmi nízký tlak, p < 10-7 Pa (UHV, ultra high vacuum) - vysoká cena ~ 5 000 000 Kč - omezený dynamický rozsah ~ 10 3, 100 až 10 5 iontů velmi vysoká přesnost a správnost m/z, ~ ppm velmi vysoké rozlišení, R ~ 10 6 multiplexová (Fellgettova) výhoda FT všechny m/z se měří po celou dobu zlepšení S/N 10 3 x, zvýšení rychlosti získávání 10 6 x vhodné k MS n (CID, CAD), běžně n = až 3, demonstrováno i n = 1 Princip FT-ICR-MS Detekce 1. indukční - ionty indukují náboj v detekčních destičkách při průletu okolo: nedestruktivní detekce (FT cyklotron).destruktivní - ionty narazí do detekčních destiček (prostý cyklotron) Záznam dat vyšší frekvence vzorkování vyšší horní limit m/z. Nyqistovo kritérium: nejvyšší detegovaná frekvence = vzorkovací frekvence/ delší doba záznamu, t vyšší rozlišení a nižší dolní limit m/z. Důsledek... nutnost uchování velkého množství dat - heterodyne, frekvenční směšovač (frekvenční posun signálu směrem dolů umožní použít nižší vzorkovací frekvence) Fourierova transformace... transformace signálu z časové do frekvenční (m/z) domény Netlumený pohyb iontů o jedné m/z S t Reálný signál z FT ICR MS S t t t FT FT m/z Srážky s molekuly plynu a nehomogenita magnetického pole způsobují pozvolný pokles signálu. Vyšší tlak více srážek nižší rozlišení. Lorentzovský tvar píku. S S m/z Z-trapping Princip FT-ICR-MS Na víčka je vloženo napětí 1-5 V, aby ionty neopustily past ve směru osy z potenciálová jáma. V přídavném poli dochází k oscilaci iontů a rozštěpení původně jediného pohybu na pohyb cyklotronový a magnetronový. Důsledkem jsou komplikovanější kalibrace, posun píků a vyšší ztráta těžších iontů. Princip FT-ICR-MS Ionizace pro FT MS 1. ionizace uvnitř: analyzátor = zdroj (např. EI, LDI). externí zdroj a zavedení do cely - iontové vodiče, kvadrupóly, elektrostatická čočka - diferenciálně pumpované cely (iont se tvoří v první cele při vyšším tlaku a poté je zaveden do detekční cely otvorem podél osy z) Excitace 1. Impuls... vysoká amplituda, krátké trvání. Chirp... rychlý sken frekvencí v požadovaném intervalu frekvencí 3. SWIFT... Stored Waveform Inverse Fourier Transform excitační profil získaný ift zvoleného profilu m/z (ift = inverzní FT, transformace z frekvenční (m/z) do časové domény) Rozlišení m Bt a m m z FT-ICR-MS Max. hmotnost. Ze vztahu pro střední kvadratickou rychlost termálního pohybu, kt v, m který pre-excituje ionty, vyjádříme r mv zeb mkt zeb. V pasti s danými parametry (B, r) nemohou být uchovány ionty s hmotností vyšší než (zebr ) m kt. 31
Hmotnostní spektrometr budoucnosti? Lineární elektrostatická past... neexistuje jediné nejlepší řešení Trendy Ústup magnetických sektorů Detekční trubice Elektrody pasti Hybridní spektrometry Rozšiřování moderních spektrometrů a jejich hybridů (iontové pasti, ortogonální TOF analyzátory). Nové spektrometry Elektrostatická past Orbitrap Lineární pasti kvadrupólového typu Detekovaná frekvence = f(m/z) pohybující se elektrony indukují proud Benner, Anal. Chem. 1997, 69, 416-4168 Elektrostatická orbitální past, Orbitrap A. Makarov, HD Technologies Ltd., USA, ASMS 1999 prstence () injektáž iontů centrální elektroda - (-) detekce kmitavý pohyb iontů Princip Injektované ionty jsou lapeny v radiálním elektrostatickém poli mezi centrální vřetenovitou elektrodou a dvěma prstenci, krouží kolem elektrody. Ionty zároveň oscilují podél osy elektrody a jsou indukčně detekovány. MS spektra jsou získána pomocí Fourierovy transformace signálu zaznamenaného v čase; m/z je určeno z frekvence oscilací. injektáž iontů mv qe r prstenec () elektroda (-) 6 Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOF MS). Metody zvýšení rozlišení TOF MS (reflektor, zpožděná a ortogonální extrakce). Simion: příklady. Animace. Vlastnosti Orbitrapu Velmi vysoké rozlišení jako u FT-ICR-MS (R = 50 000 500 000). Velmi vysoká přesnost a správnost jako u FT-ICR-MS. Nepotřebuje magnet. Nepotřebuje RF generátory. - Vyžaduje velmi nízké tlaky jako FT-ICR-MS. - Náročná injektáž iontů do orbitrapu. V současnosti velmi rychle se rozšiřující spektrometr, existuje několik variant ve spojení s kvadrupólovými analyzátory Průletový analyzátor (Time-of-flight MS, TOFMS) Princip: m/z vypočten z doby letu iontů 1. Urychlení iontů Stejná urychlovací energie pro všechny ionty W(el.) W(el.) = W(kin.). Drift (let) iontů: separace iontů podle m/z W(kin.) = mv / 3. Záznam iontového signálu v čase, I(t) 4. Stanovení m/z doby letu: transformace I(t) I(m/z) 3
Historie TOFMS 1946 princip TOF W. E. Stephens, Phys. Rev., 1946, 69, 691 1948 první TOF spektrometr (ion velocitron) A. E. Cameron, D. F. Eggers, Rev. Sci. Instrum. 1948, 19, 605 1955 iontový zdroj se stupni; zpožděná extrakce (time-lag focusing) Wiley, W. C.; McLaren, I. H.; Rev. Sci. Instrum., 1955, 6, 1150 1973 iontové zrcadlo B. A. Mamyrin, V. I. Karataev, D. V. Schmikk, and V. A. Zagulin, Sov. Phys. JETP 1973, 37, 45 1995 pulsní extrakce ( time-lag focusing v praxi) Whittal, R. M.; Li, L., Anal. Chem. 1995, 67, 1950-1954 Brown, R. S.; Lennon, J. J., Anal Chem. 1995, 67, 1998-003 Vestal, M. L.; Juhasz, P.; Martin, S. A, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1995, 9,1044-1050 Geometrie TOFMS TOF MS s iontovým zrcadlem (reflektorem)... dosažení lepších parametrů spekter... možnost strukturní analýzy (PSD) () odpuzovací elektroda (repeller), ~0 kv iontový zdroj: např. pulsní e - svazek, laserový puls driftová zóna (E = 0) mřížky zdroje iontový deflektor detektor (-) () reflektor, >0 kv () mřížky a elektrody reflektoru Geometrie TOFMS iontový zdroj Lineární geometrie... nejjednodušší sestava laser trubice detektor () iontový zdroj: pulsní e - svazek, laserový puls difúzní pumpa digitální osciloskop odpuzovací elektroda (repeller) ~0 kv driftová zóna, E = 0 vstupní a výstupní mřížky detektor mechanická pumpa generátor zpoždění řídící jednotka vakuová jednotka MALDI TOFMS zdroj vysokého napětí Geometrie TOFMS Princip TOFMS Wiley-McLarenova lineární geometrie (1955)... nastavení extračního el. pole nezávislé na celkovém urychlovacím napětí, optimalizace spekter odpuzovací elektroda (repeller), ~0 kv iontový zdroj: pulsní e - svazek, laserový puls () extrakční mřížka, ~17 kv () driftová zóna, E = 0 akcelerační mřížka, 0 V výstupní mřížka, 0 V detektor 1. Pulsní ionizace (doba pulsu ~ ns): rychlé vytvoření obláčku iontů (EI, LD, MALD, PD ). Extrakce a urychlení iontů v elektrickém poli 3. Separace iontů v driftové zóně při E = 0 (field-free region, flight tube) 4. Detekce iontů, záznam signálu, transformace do m/z domény urychlovací energie mv z eu L v t m z t e U L kinetická energie délka driftové zóny doba letu S (m/z) 1 <(m/z) t 33
Princip TOFMS Iontové zdroje pro TOFMS Přesnější vztah zahrnuje i čas strávený v prostoru iontového zdroje a detektoru: napětí: U s 0 0 U d vzdálenosti: s L d 1. Zdroj pro plynné vzorky e -, ionty, laser () (-) t TOF = t s t L t d t s ms ml d m t L td ( zeu zeu U ze U Us 4U ) s d s s d. Zdroj pro tuhé vzorky (desorpce) laser, ionty, atomy Pozn.: 1) t s, t L, t d a tedy i t TOF jsou přímo úměrné (m/z) 1/ ) pro hrubý odhad t TOF : t TOF ~ t L (L >> s, d) () (-) TOF: kalibrace m/z m/z=(eu/l )t m/z=k 1 (t-t 0 ) t=c 0 c 1 (m/z) 1/ t=c 0 c 1 (m/z) 1/ c (m/z) t=c 0 c -1 (m/z) -1/ c 1 (m/z) 1/ c (m/z) Ideální zdroj iontů pro TOFMS Všechny ionty jsou vytvořeny: v čase t 0 (doba tvorby, t = 0) ve vzdálenosti x 0 (x osa letu TOFMS) (nejlépe v jednom bodě [x 0, y 0, z 0 ]) se stejnou rychlosti v x0 (, která nemusí být nulová,) podél osy x. (nejlépe s v y0 = 0 a v z0 = 0) korekce spuštění záznamu dat korekce poč. rychlosti iontů před extrakčním pulsem korekce neideálního tvaru extrakčního pulsu y z x zdroj detektor Principiální výhody a vlastnosti TOFMS Teoreticky neomezený rozsah m/z Ideální pro pulsní ionizaci Fellgettova výhoda: pro každý puls zaznamenáno celé spektrum, není třeba skenovat Velmi krátká doba záznamu spektra (~10-4 s) Vysoká propustnost iontů... předpoklad vysoké citlivosti Jednoduchost Reálný zdroj iontů pro TOFMS Ionty jsou charakterizovány distribucemi: doby vzniku t 0, místa vzniku x 0, y 0, z 0, počáteční rychlosti v 0 (energie W kin0 ), a směru pohybu a (odchylka od osy letu x). Důsledek: snížení rozlišení, R Wiley-McLarenův zdroj pro plynné vzorky: nastavením napětí na střední mřížce umožňuje kompromis distribuce v a x za účelem dosažení optimálního rozlišení (Wiley, W. C.; McLaren, I. H.; Rev. Sci. Instrum., 1955, 6, 1150) 34
Iontový zdroj (detail) Pulsní tvorba iontů pro TOFMS Extrakce konstantním elektrickým polem (DC) pulsní ionizační paprsek konstantní extrakční pole a. Pulsní extrakce, zpožděná extrakce (pulsed extraction, PE; delayed extraction, DE) pulsní ionizační paprsek pulsní extrakční pole b.o-tofms s pulsní extrakcí (orthogonal extraction, kolmá extrakce) souvislá tvorba (přívod) iontů pulsní extrakční pole Vlastnosti iontů Př.: Distribuce počáteční rychlosti iontů při MALDI (P v pravděpodbnost výskytu molekuly s počáteční rychlostí v 0 ) Jak zvýšit rozlišení (MALDI-TOFMS)? 1. Vysoké extrakční napětí v lineárním TOF MS.. Reflektor. P v analyt 3. Pulsní extrakce. matrice laser 0 1000 000 v 0 (m/s) Spojení MALDI-TOF MS? 1. Vysoké urychlovací napětí Desorpční metody (MALDI, LDI) - speciální případ: t 0 ~ns x 0 ~mm z 0,y 0 ~ zanedbatelné; (velmi krátký laserový puls) zanedbatelné; (tenká vrstva, malé krystalky vzorku) 50 mm zanedbatelné; (zaostřený laserový paprsek) mv m v 0 zeu v v 0 zeu m v 0 >100 m/s nejvýznamnější příčina nízkého rozlišení příspěvek desorpce příspěvek el. pole a 0 ~10 0 přispívá k dalšímu rozšíření distribuce v Energetická distribuce (v ~ 700 m/s, v > 500 m/s) způsobí, že ionty o stejném m/z přiletí k detektoru v různou dobu. Zvýšením příspěvku elektrického pole se sníží vliv disperze počáteční rychlosti iontů analytu. 35
Vliv urychlovacího napětí Př.: MALDI TOF peptidu o m = 000 Da, z = 1, v 0 = 750 m/s, v 0 (FWHM) = 500 m/s, L = 1 m. ( ionty: v 01 = 500 m/s, v 0 = 1000 m/s.) Konstrukce reflektoru R 1 R 1 R 1 R 1 R 1 R 1 R R R R R R R R R R P v 100% 50% 500 m/s 0 500 1000 v 0 (m/s) U = 1 kv: t 1 = 101.673 ms, t = 101.84 ms R ~ 130 U = 10 kv: t 1 = 3.190 ms, t = 3.177 ms R ~ 1300 (U ) mřížky: definice ekvipotenciálové plochy prstence: elektrické stínění stěn vakuového systému potenciál na prstencích definován sérií rezistorů U 3 >U 1. Reflektor (reflektor, iontové zrcadlo, rtofms) Příklad konstrukce relektoru zdroj U 1 detektor II (-) 1 () deflektor iontové zrcadlo detektor I U >U 1 Ionty 1 a o stejném m/z a různých rychlostech v 1 a v : Rychlejší iont pronikne hlouběji do iontového zrcadla a jeho dráha je delší. Za určitých podmínek dorazí oba ionty k detektoru II současně. Možnost použít více reflektorů (vícenásobný odraz). (Mamyrin, B. A.; Shmikk, D. V.; Sov. Phys. 1979, 49, 76) Konstrukce reflektoru Lineární reflektor... E je konstantní podél osy reflektoru Jeden stupeň... intenzita elektr. pole, E je konstantní v celém reflektoru (Alikhnov) Dva stupně... reflektor je rozdělen na zóny s různou E (B. A. Mamyrin, V. I. Karataev, D. V. Schmikk, V. A. Zagulin, Sov. Phys. JETP 1973, 37, 45) Nelineární reflektor... E se mění podél osy reflektoru Kvadratické pole (D. R. Jardine, J. Morgan, D. S. Alderdice, P. J. Derrick, Org. Mass Spectrom. 199, 7, 1077) Zakřivené pole (T. J. Cornish, R.J.Cotter, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1037-1040) dřívější patenty (Japonsko, SSSR) t TOF Reflektor s jedním stupněm detektor L (-) L m reflektor s L 1 () U s t TOF = t s t L t r... součet časů ve zdroji, driftové zóně a reflektoru v 0 1 s L a v 0 1 s 3L a v 0 t 0 1 1... 8 a a s ar as a s ar as s L a t 0 1 L = L 1 L... driftová zóna, E=0 a s a r a... zrychlení ve zdroji, a=qe s /m a r... zrychlení v reflektoru, a=qe r /m (Moskovets, E. Rapid Commun. Mass Spectrom. 000, 14, 150-155) U r 36
Reflektor se dvěma stupni Reflektor se stupni... reflektor je rozdělen na zóny s různou E Reflektor s nelineárním polem Cíl: t TOF pro ionty všech m/z nezávislý na jejich W kin Pro kladné ionty: V kvadratickém poli k U ( z ) ( z a) C s pozitivním potenciálem na prostřední mřížce, 0 > U > U 3 - různá uspořádání s poměry délek stupňů ~1:, ~:3 aj. - použití krátkého 1. stupně s vyšší intenzitou elektr. pole umožňuje zkrátit celkovou délku reflektoru s negativním potenciálem na druhé mřížce: - vytvoření prostorového zaostření v prvním stupni - různá hloubka průniku v druhém stupni (energetické zaostření) odraz iontu f(w kin0 ) z... osa změny potenciálu a... minimum paraboly k a C... konstanty f... frekvence oscilací (Převzato z: A. A. Makarov, E. N. Raptakis, and P. J. Derrick, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1995, 146/147, 165.) Reflektor se dvěma stupni W kin Reflektor s nelineárním polem Další prakticky využitelná pole: osově symetrický hyperbolický potenciál planární hyperbolický potenciál osově symetrický hyperlogaritmický potenciál U U 3 t TOF = f(w kin, U, U 3 ) energetická disperze... hlavní příčina snížení rozlišení R Mamyrin: Řešení W kin f ( Wkin, U, U 3) 0 a W kin f W, U, U ) 0 ( kin 3 Reflektor se dvěma stupni Reflektor s nelineárním polem Vhodné pro energetickou disperzi do ~0%. Např. pro energetickou disperzi 5% teoretické rozlišení až ~100 000 - Pouze ionty, které proniknou do hloubi reflektoru (85-100%) jsou zaostřeny. - K získání spektra iontů s vyšší energetickou disperzí je třeba zaznamenat sérii spekter pro několik hodnot potenciálu reflektoru a výsledné spektrum složit z kusů těchto spekter. nelineární (zakřivené, kvadratické) pole lineární pole (T. J. Cornish, R. J. Cotter Non-linear field reflector, US Patent 5 464 985) 37
Reflektor s nelineárním polem Zpravidla kvadratické pole nebo jeho aproximace Tvorba nelineárního pole pomocí nestejných rezistorů v sérii pomocí nestejných odstupů mezi prstenci či mřížkami současné zaostření iontů s širokou disperzí W kin, jako např. produktů rozpadu za zdrojem PSD, pro všechny m/z - složitější kalibrace - ideální jen pro ionty pohybující se po ose reflektoru... v praxi omezené R Ortogonální extrakce (otofms) svazek iontů analytu z kontinuálního zdroje repeller, pulsní () driftová zóna, E = 0 detektor napětí, U 1 akcelerační mřížka, 0 V extrakční mřížka, U výstupní mřížka, 0 V Pulsní extrakce pro kontinuální iontové zdroje Proud iontů analytu je extrahován pulsním extrakčním polem kolmým (ortogonálním) k vstupnímu iontovému svazku. Ionty mají zpravidla stejnou v x ( v 0 ~0) Obvykle reflektor pro dosažení vyššího rozlišení 3. Pulsní (zpožděná) extrakce Pulsed (delayed) extraction, Time-lag focusing Opožděné zapnutí extrakčního napětí: 1. Puls laseru (t = 0). Expanze iontů při vypnutém extrakčním poli po dobu t (delay) 3. Rychlé zapnutí extrakčního pole (t = t) V 15 kv 1 kv 0 0 t (Brown, R. S.; Lennon, J. J.; Anal. Chem. 1995, 67, 1998) t V(destička, repeller) V(mřížka) Další faktory ovlivňující rozlišení TOFMS neideální iontový zdroj iontová optika dilatace letové trubice vlastnosti detektoru vzorkovací frekvence A/D převodníku příprava vzorku stabilita urychlovacího napětí Př. vliv kolísání urychlovacího napětí: m = const. Ut dm du d t R 1 const. m U t dt dáno max. frekvencí AD převodníku, rychlostí detektoru a časovou disperzí tvorby iontů du určeno drifty a kolísáním zdroje vysokého napětí Pulsní (zpožděná) extrakce Vliv uspořádání na rozlišení repeller mřížky driftová zóna detektor Striktní požadavek na paralelní uspořádání L 1. t = 0:. t = t : E = 0 např. 1 kv 1 kv 0 kv iontový zdroj MCP s úzkými kanálky driftová zóna MCP detektor E > 0 3. např. 15 kv 1 kv 0 kv t = tof: driftová zóna iontový zdroj MCP (detail) L 3 mm 10 o 38
Rozlišení: Vliv uspořádání na rozlišení m R m t R t L R L m z eu t L t = L/v MALDI analýza početných sérií vzorků 1, 10, 96, 100, 384, 1536... vzorků/terčík Např. pro R = 15 000 a L = 3 m: L 100 mm Pozn: MCP s úhly kanálků 10 o a průměrem 10 mm: L = 10 mm/tan(10 o ) = 57 mm 384 vzorků/terčík Vliv mřížek Mřížky... elektrody transparentní pro ionty... v iontovém zdroji, reflektoru a před detektorem MS s mřížkami přesná definice potenciálu - ztráty na mřížkách (náraz, odklonění, reakce) - tvorba sekundárních iontů z materiálu mřížek MS bez mřížek - vyšší rozlišení, beze ztrát na mřížkách - komplikovanější návrh (extra zakřivení drah iontů jako u čočky) Srovnání rozlišení systemů TOFMS systémgeometrie extrakce R TOFMS lineární DC 500 DE-TOFMS lineární pulsní 5 000 rtofms reflektor DC 10 000 DE-rTOFMS reflektor pulsní 0 000 ortofms reflektor pulsní 10 000 Více podrobností např. v: T. Bergmann, T. P. Martin, H. Schaber Rev. Sci. Instrum. 1989, 60, 347. Další parametry TOFMS Terčík (MALDI): až 384 vzorků na terčíku o velikosti titrační destičky, dostatečná plocha pro sběr eluentu z několika separací Axiální ozáření vzorku laserem vyšší rozlišení Kolizní cela v iontovém zdroji zvýšení výtěžku fragmentace Délka driftové zóny (letové trubice): typicky 1- m, ale i 10 cm nebo 5 m Iontový vodič může být umístěný v trubici pro zvýšení propustnosti iontů Detektor: mikrokanálková destička (MCP) elektronové násobiče hybridní detektory (scintilační vrstva fotonásobič) Vlastnosti TOFMS 1. Max. m/z teoreticky neomezená. Praktický limit: účinnost ionizace a detekce, rozklad iontů během letu.. Celé spektrum je zaznamenáno najednou 3. Vysoká rychlost záznamu spektra (desítky ms). Př.: inzulín (m/z = 5735) urychlený 15 kv překoná 1-metrovou driftovou zónu za ~ 50 ms. 4. Vysoká propustnost iontů (desítky %). 5. Vysoké rozlišení (R > 10 000). 6. Jednoduchost a relativně nízká cena. 7. Dostupné techniky pro MS/MS Detekční elektronika: AD převodník (8 bitů, 0.5-4 GS/s) TD převodník segmentovaný detektor 39
Shrnutí výhod TOF MS Výhodné vlastnosti max. m/z, rychlost a počet analyzovaných vzorků za čas, transmise, rozlišení, relativně nízká cena Obrovský rozmach TOF MS v poslední dekádě MALDI PE TOF, rtof MS API otof MS Nové techniky pro MS/MS (TOF-TOF, LIFT, QTOF) Konkurenční techniky LT, FT-ICR a hybridní MS Simion Příklad: Simulace elektrostatické čočky pomocí programu Simion. Čočka: 3 segmenty průměr, d = 36 mm délky segmentů, y 1 = 8 mm, y = 6 mm, y 3 = 3 mm mezery mezi segmenty, l = mm počátek v xyz [0, 0, 0] mm potenciály, U 1 = 0; U = proměnné; U 3 = 0 Ionty: počet, n = 5 hmotnost, m = 100 kinetická energie, W 0 = 100 ev souřadnice xyz [0, -30, 0] mm a 0 (i) = (-4 i ) o, kde i = 0 n 1 Úkol: Ověřte funkci čočky při napětí na prostředním prstenci, U = 0, 85, 100, 10 a 133 V. Řešení: Viz přílohy Srovnání běžných hmotnostních spektrometrů MS max. m/z [Da] R správnost m/z [Da] náklady Q 10 3 10 3 0,1 IT, LIT 10 3 10 3 0,1 B 10 4 10 4 0,01 TOF 10 5 10 4 0,01 O 10 3 10 5 0,001 FT-ICR 10 4 10 6 0,0001 7 Kolizně indukovaná disociace (CID). Tandemová MS (MS/MS). Další možnosti disociace (ECD, ETD, fragmentace ve zdroji a za zdrojem ISD a PSD). Techniky TOF-TOF, LIFT. Spektrometrie iontové mobility (IMS). Zobrazovací hmotnostní spektrometrie (MSI). Pozn: Hodnoty v tabulce jsou pouze přibližné a vztahují se k běžným přístrojům, parametery některých vědeckých nebo nových komerčních přístrojů mohou být výrazně vyšší (i řádové odchylky). Simulace pohybu iontů Exaktní výpočet pohybu iontů složitý i pro poměrně jednoduchá elektrická a magnetická pole. Simulace iontového pohybu: program Simion Postup při řešení konfigurace iontové optiky pomocí progamu Simion: 1. Zadání geometrie (nákres elektrod).. Zadání potenciálů elektrod, definice magnetického pole. 3. Definice iontů (počet n, v 0, x 0, y 0, z 0, a 0, f 0 ). 4. Simulace výsledek (grafická reprezentace, text). Sken: záznam hmotnostního spektra S(m/z) = f(x) = f(t) Skenující přístroje Skenovaná veličina Doba skenu magnetový sektor (B) B, U ~ 1 s kvadrupólový filtr (Q) UV, f ~ 0.1 s iontové pasti (IT, LT) U, V, f ~ 1 s Neskenující přístroje (přímý záznam signálu v čase): průletový analyzátor (TOF) ~ 100 ms iontový cyklotron (FT-ICR) ~ 1 s orbitrap (O) ~ 1 s Další neskenující přístroje mohou používat plošné detektory (array). 40
Jednoduchá hmotnostní spektrometrie Záznam celého spektra Základní typy MS/MS 1. Skenování iontů produktů, dceřinných iontů Product ion scan, daughter ion scan, fragment ion scan Nastavení MS1, skenování MS kompletní informace Záznam části spektra (zoom scan) vybraný interval m/z www.jimkellyjr.com/008_07_01_archive.html. Skenování iontů prekurzorů, výchozích látek, mateřských iontů Precursor ion scan, parent ion scan Skenování MS1, nastavení MS 3. Skenování ztráty neutrální částice Neutral loss scan Skenování MS1 a MS zároveň, m/z = konst. 4. Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí Selected reaction monitoring/multiple reaction monitoring Nastavení MS1 a MS3 na vybrané m/z Jednoduchá hmotnostní spektrometrie Záznam signálu vybraného iontu (selected ion monitoring, SIM) Záznam signálu vybraných iontů (peak switching) Skenování produktových iontů (Product ion scan) Nastavení MS1: propustit ionty o vybrané m/z Skenování MS: spektrum produktů vybraného prekurzoru užitečné při objasňování struktury... fingerprint analyzované sloučeniny zjednodušení spektra... zvýšení poměru signálu k šumu (S/N) pozor: MS1 není zárukou izolace jediného výchozího iontu Techniky, 3 a 4: úspora dat, vyšší frekvence (spektra/s) významné uplatnění v chromatografii s MS detekcí MS n... hmotnostní spektrometrie n-tého stupně Tandemová hmotnostní spektrometrie Analýza iontů fragmentace analýza iontů Q 1 q Q 3 MS1 CID MS Př.: skenování produktových iontů MS MS Fragmentation Patterns of Cholesterol Oxidation Products B. Rossmann, K. Thurner, W. Luf Monatsh Chem 138, 437 444 (007) ionty prekurzorů mateřské ionty precursor/parent ions produktové ionty dceřinné ionty product/daughter ions APCI QqQ toxikologicky relevantní produkty oxidace cholesterolu Klasický přístroj pro nízkoenergetickou CID: trojitý kvadrupólový filtr (triple quad, TQ, QQQ, QqQ, Q3) Q 1 : 1. analyzátor (MS1) q : kolizní cela (pouze RFQ) Q 3 :. analyzátor (MS) 41
Př.: skenování produktových iontů Př.: skenování iontů prekurzorů Parent ion scans of unseparated peptide mixtures M. Wilm, G. Neubauer, M. Mann Anal. Chem. 68, 57-33 (1996) (A) Pozitivní MS fosfopeptidu EPQY P EEIPIYL, M r,mono = 1471,6; c = 1 fmol/ml. (B) Sken iontů prekurzoru pro fosfoskupinu (m/z = 79 Da) v negativním modu při stejné koncentraci vzorku Skenování iontů prekurzorů (Precursor ion scan) Skenování MS1: spektrum iontů prekurzorů Nastavení MS: detekce produktových iontů o dané m/z pro identifikaci skupiny podobných sloučenin, sloučenin s totožnou funkční skupinou či strukturním motivem zjednodušení spektra... zvýšení S/N Skenování ztráty neutrální částice (Neutral loss scan) Současné skenování MS1 a MS Konstantní rozdíl m/z propouštěných MS1 a MS ztráta stejné neutrální částice... vhodné pro látky se stejnou funkční skupinou zjednodušení spektra... zvýšení S/N Př.: skenování iontů prekurzorů Parent ion scans of unseparated peptide mixtures M. Wilm, G. Neubauer, M. Mann Anal. Chem. 68, 57-33 (1996) MS peptidu GLHINDYALNITKSFLLDK M r,avg = 175,5; c = 10 fmol/ml (B) Sken iontů prekurzoru pro immoniové ionty isoleucinu a leucinu (m/z = 86 Da) (C) Sken produktových iontů [M3H] 3 Př.: skenování ztráty neutrální částice Constant neutral loss scanning for the characterization of bacterial phospholipids desorbed by fast atom bombardment D. N. Heller, C. M. Murphy, R. J. Cotter, C. Fenselau, O. M. Uy Anal Chem 60, 787-791 (1988) fosfoethanolamin: m/z = 141 fosfoglycerol: m/z = 17 methylfosfoethanolamin: m/z = 155 4
Spojení MS s chromatografickými technikami Kredit: Zbyněk Zdráhal, IT Bruker HCT Ultra Př.: skenování ztráty neutrální částice MS MS/MS NLS, m/z = 141 fosfoethanolamin MS/MS NLS, m/z = 155 methylfosfoethanolamin Spojení MS s chromatografickými technikami (MS chromatogram, ion chromatogram) záznam intenzity iontu(ů) v průběhu separace Celkový iontový proud (Total ion current, TIC) monitorování širokého intervalu m/z (stovky a.m.u.) vhodný pro celkový obrázek o chromatografii a nalezení nových píků nevhodný při analýze komplexních směsí Monitorování vybraného iontu (Selected ion monitoring, SIM) detekce při vybrané m/z pro experiment navržený pro monitorování pouze vybraného iontu pro více iontů peak switching Monitorování vybrané reakce (Selected reaction monitoring, SRM) analogie SIM s využitím tandemové MS pro více rekcí multiple reaction monitoring, MRM Př.: skenování ztráty neutrální částice MS Spojení MS s chromatografickými technikami Při vícerozměrných analýzách (LC-MS, GC-MS, CE-MS) jsou často zaznamenávána celá spektra v průběhu separace. Z těchto dat pak může být získán celkový proud, průběh intenzity pro daný m/z Extracted ion chromatogram, XIC, EIC Reconstructed ion chromatogram, RIC MS/MS NLS, m/z = 17 fosfoglycerol Rekonstruovaný chromatogram je obvykle horší kvality než pravý SIM, resp. MRM získaný na Q, resp. QqQ Base peak intensity chromatogram, BPC... intenzita dominantního píku vs. retenční čas... může vypadat přehledněji než TIC díky ignorování sumy minoritních píků Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí TIC: MS analogie SIM a peak switching v MS/MS Monitorování vybrané reakce (selected reaction monitoring, SRM) Nastavení MS1: ionty prekurzoru o dané m/z Nastavení MS: produktové ionty o dané m/z velmi selektivní důkaz analytu, resp. jeho reakce Monitorování více reakcí (multiple reaction monitoring, MRM) Nastavení MS1: peak switching ionty prekurzorů o daných m/z Nastavení MS: peak switching produktové ionty o daných m/z velmi selektivní důkaz analytů, resp. jejich reakcí Vysoký S/N, používáno v kombinaci s chromatografickými technikami TIC: MS/MS XIC: MS @ 701 MS @ 19,8 min 43
Př.: Monitorování více reakcí, MRM MRM: TIC a XIC (A) TIC pro několik vybraných peptidů alkoholdehydrogenázy (B) XIC specifického peptidu alkoholdehydrogenázy, prekurzor: z = 3 (C) XIC specifického peptidu alkoholdehydrogenázy, prekurzor: z = (navíc standard pro kvantifikaci) A multiple reaction monitoring method for absolute quantification of the human liver alcohol dehydrogenase ADH1C1 isoenzyme B. Rossmann, K. Thurner, W. Luf Monatsh Chem 138, 437-444 (007) D. J. Janecki, K. G. Bemis, T. J. Tegeler, P. C. Sanghani, L. Zhaib, T. D. Hurley, W. F. Bosron, M. Wanga, Anal.Biochem. 369, 18-6 (007) Př.: HPLC APCI SRM Skenování v MS/MS Objasnění struktury organických sloučenin Analýza směsí analytů jako náhrada spojení separace - MS Při MS/MS se všechny analyty ionizují současně, izoluje se jeden analyt po druhém (MS1) a po fragmentaci (CID) se identifikují (MS). Pozor! U složitých směsí dochází k vzájemnému rušení při ionizaci. Zlepšení poměru signálu k šumu, S/N Zvýšení selektivity snížení šumu Zjednodušení spekter Všechny druhy skenů MS/MS Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí SRM pro dominantní reakce z předchozí tabulky Př.: HPLC APCI MRM Hmotnostní spektrometry pro MS/MS Trojitý kvadrupólový filtr (QqQ) Iontové pasti (IT, LT, O, FT ICR) Dvojitý magnetický sektor s obrácenou geometrií (BE, MAG-ESA) Průletový analyzátor (TOF) Hybridní spektrometry kombinace výše uvedených, např. LT - FT ICR Klasifikace tandemové spektrometrie fragmentace v prostoru: 1, 3, 4, 5 fragmentace v čase: 44
Další hmotnostní spektrometry pro MS/MS Dvojitý magnetický sektor s obrácenou geometrií (BE, MAG-ESA) Izolace mateřského iontu, fragmentace v kolizní cele Analýza kinetické energie, W Pro dceřinné ionty platí W = f(m/z) První technika MS/MS (MIKES, Mass-Analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry) Dokonalejší varianty: EBE, EBEB EBqQ EB: dokonalá selekce výchozího iontu q 1 : kolizní cela Q : selekce produktů Tandem kvadrupólový filtr - otof (QTOF) TOF-TOF Typy disociace 1. srážky s molekulami okolního plynu v kolizní cele při zvýšeném tlaku, p ~100 Pa CID/CAD collisionally induced/activated dissociation. srážky s povrchem: SID, surface induced dissociation - povrch: vrstva organické látky (polymer nebo monovrstva malých organických molekul, např. alkanthiolů) na vhodném substrátu (Au) - srážky v důsledku urychlení el. polem, př.: napětí nozzle- skimmer 3. fotodisociace RMPI, resonant multiphoton ionization 4. záchyt elektronu ECD, Electron capture dissociation ETD, Electron transfer dissociation 5. nadměrná excitace při ionizaci (např. vysoká energie při LDI a MALDI) ISF, in-source fragmentation (fragmentace ve zdroji) v TOF MS PSD, post-source decay (rozklad vně zdroje) v TOF MS Další hmotnostní spektrometry pro MS/MS Tandem kvadrupólová iontová past - TOFMS (IT-TOFMS) IT: možnost akumulace a MS n v prvním stupni. TOF: citlivý detektor s vysokým rozlišením jako koncový stupeň. Iontové pasti: kvadrupólová IT a FT-ICR-MS možnost MS n tentýž spektrometr jako pro MS, pouze jiný software Postup: izolace výchozího iontu (po akumulaci všech iontů) excitace výchozího iontu (zvýšení amplitudy) po delší dobu sken produktů (případně zpět k bodu 1 pro MS n, n >) Tandem LT FT-ICR-MS mnoho možných režimů skenů Stabilita iontů 1. Stabilní: poločas rozpadu, t > 10-6 s Iont prolétne celým MS, aniž by se rozložil.. Metastabilní: poločas rozpadu, t ~ 10-7 - 10-6 s Iont se rozládá v průběhu letu hmotnostním spektrometrem. 3. Nestabilní: poločas rozpadu, t < 10-7 s Iont se rozloží ještě ve zdroji. Historické rozdělení - časy podle doby pobytu v magnetickém sektoru Reakce: unimolekulární, bimolekulární Typy disociace Disociace... monomolekulární reakce, t(indukce) << t(disociace) Fragmentace může být způsobena: 1. Kolizí s atomem nebo molekulou kolizně indukovaná disociace (collision-induced dissociation, CID). Kolizí s povrchem povrchem indukovaná disociace (surface-induced dissociation, SID) 3. Fotonem - fotodisociace (photodissociation, PD) např. infrared multiphoton dissociation, IRMPD 4. Elektronem disociace v důsledku záchytu e - (electron capture dissociation, ECD a electron transfer dissociation, ETD) Pozn.: Určení hlavní příčiny fragmentace někdy není jednoznačné, např. fragmentace během MALDI (ISD and PSD) může být indukován jak fotony, tak i kolizemi. Srážky iontů Fragmentace cílená fragmentace za účelem studia struktury iontu obvykle s molekulami vzácných plynů He, Ar Elastické srážky Kinetická energie zůstává zachována. Neelastické srážky Část kinetické energie se po srážce přemění na vnitřní energii iontu: E in <= E(M t /(M t M i )) t = terčík (target), i = ion Těžší terčík možné přenést více energie na iont 1 ev/iont ~ 100 kj/mol (100kJ/5 g oplatků) 45
Nízkoenergetické srážky iontů Mechanismus McLaffertyho přesmyku Energie srážek: 1 100 ev vibrační charakter excitace, interakce mezi iontem a terčem ~ 10-14 s Účinnost srážek obvykle dostatečná díky mnoha srážkám iontu v kolizní cele Instrumentace trojitý kvadrupólový filtr, iontové pasti, hybridní přístroje V současnosti nejrozšířenější technika, nízkoenergetická CID Vysokoenergetické srážky iontů Energie srážek: kev elektronový charakter excitace, interakce mezi iontem a terčem ~ 10-15 s přeměněná energie ~ 1 3 ev Účinnost srážek He snižuje úhlový rozptyl produktů Ar, Xe umožňuje účinnější konverzi energie Instrumentace hybridní sektorové přístroje, TOF-TOF ECD, ETD Electron capture dissociation interakce iontů s termálními elektrony (nízká E) aplikace: fragmentace peptidů (ionty c, z ), nevede k fragmentaci bočního řetězce FT-ICR-MS Electron transfer dissociation transfer elektronu z reagentu tentýž charakter fragmentace jako ECD kvadrupólové pasti (Syka J.E.P,. Coon J.J., Schroeder M.J., Shabanowitz J., Hunt D.F. PNAS 101, 958-9533, 004) Příklad: McLaffertyho přesmyk ECD Štěpení karbonylových sloučenin s vodíkem v g pozici na enolický fragment a olefin indukované EI: F. W. McLafferty, Anal. Chem. 31, 8 (1959). D. G. I. Kingston et al., Chem. Rev. 74, 15 (1974); K. Biemann, Mass Spectrometry (New York, 196) p 119; Djerassi et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 817 (1965); 91, 069 (1969); 94, 473 (197) M. J. Lacey et al., Org. Mass Spectrom. 5, 1391 (1971); G. Eadon, J. Am. Chem. Soc. 94, 8938 (197); F. Turecek, V. Hanus, Org. Mass Spectrom. 15, 8 (1980). 46
ETD ISD. Analyt: 0 pmol KGF analogu. Matrice: kyselina sinapová. Laser: N. (V. Katta, D. T. Chow, M. F. Rohde Anal. Chem., 70, 4410-4416, 1998.) Fragmentace ve zdroji In-Source Fragmentation (ISF), In-Source Decay (ISD) Využívaná zejména v MALDI TOFMS peptidů. Zvýšení energie laseru při MALDI vede k nadměrnému "zahřátí" molekul/iontů analytu (vibrace) a fragmentaci analytu přímo v iontovém zdroji. Intenzita fragmentů << intenzita mateřského iontu ([MH] ). Pulsní metody (Delayed Extraction) nutné pro: dosažení dostatečné citlivosti prodloužení délky pobytu iontů v iontovém zdroji (více srážek). Převážně monomolekulární reakční mechanismus (narozdíl od CID). ISD Analyt: Matrice: Laser: oxidovaný B řetězec hovězího inzulinu thiomočovina Er:YAG (l = 936 nm) (http://medweb.uni-muenster.de/institute/impb/research/hillenkamp/publicat/abs-cm99.html) Charakteristika ISD Fragmentace za zdrojem (Post-Source Decay, PSD) Není třeba reflektor. - Vyžaduje pulsní extrakci. - Příprava čistého analytu nutná (chybí možnost izolace výchozího iontu). - Může vyžadovat speciální přípravu vzorku, např. zvýšenou koncentraci solí. Použití: MALDI TOFMS peptidů, sacharidů. Převážně monomolekulární reakční mechanismus (narozdíl od CID). Iontový selektor (ion gate): výběr výchozího iontu (m/z interval 1-0 Da). Analýzu produktů v reflektoru: Ionty fragmentů analytu se tvoří během letu driftovou zónou (v důsledku nadměrné excitace), např.: ABCH AB CH ABCH ABH C atd. Bilance kinetické energie pro první rovnici: m ABCH v / = m AB v / m CH v /. Čím těžší je fragmentový iont, tím vyšší má kinetickou energii a tím hlouběji pronikne do reflektoru delší doba letu. 47
Prekursor ABC v ABC Fragmentace 1 Fragmentace Fragmentace za zdrojem A v BC mabc v mab v ma v v AB v C v MALDI PSD derivatizovaného peptidu YLYELAR [Abs. Int. * 1000] a Y y R A 3.6 3.4 3. 3.0.8.6.4..0 1.8 1.6 1.4 1. 1.0 0.8 0.6 0.4 0. 0.0 100 00 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z Spektrum složeno z několika spekter získaných při různém potenciálu reflektoru. Zaostřeny pouze píky iontů, které pronikly hlouběji do reflektoru. Použit reflektor se stupni. (Zdroj: Z. Zdráhal) PSD: reflektor jako analyzátor energie a m/z MALDI PSD peptidu U 1 zdroj detektor ABCH ABH CH (-) () deflektor/selektor reflektor 0 U (U > U 1 ) detektor 1 pro neutrály (AB, C atd.) a.i. 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 Klasický reflektor umožňuje zaostřit ionty produktů s disperzí energie (a m/z) < 0%. Celkové PSD spektrum je proto nutné složit z více PSD spekter získaných při různém potenciálu reflektoru. 5 0 0 Kvadratický reflektor umožňuje zaostřit ionty v širokém intervalu m/z. 0 100 00 300 400 500 600 700 800 900 m /z MALDI PSD reflektor se stupni. (Zdroj: Z. Zdráhal) TOF s CID? CID (používané v QqQ, IT...) ISD nebo PSD Fragmentace v důsledku kolize iontu prekursoru s molekulou plynu Kolizní komoracollision chamber - přídavná kolizní komora ve zdroji TOF má zanedbatelný vliv Dva způsoby CID v TOF 1. QTOF (přesněji QqTOF). TOF/TOF Intensity [%] 80 60 40 0 0 B a 1 b 1 y 3 a b a 3 y 5 y 4 b 3 MALDI PSD peptidu a 4 y 6 b 4 b 5 y a 7 7 y b 8 a 6 6 00 400 600 800 1000 100 1400 1600 Mass/Charge b 7 [MH] pglu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh MALDI PSD reflektor s kvadratickým polem. (O. Šedo et al. Anal. Chim. Acta 004, 515, 61-69) 48
Ortogonální TOF: QTOFMS Hybridní instrument pro API a MALDI Nejběžnější příklad otof Vhodný pro MS/MS (nízkoenergetické CID) Svazek iontů je po výstupu z Q3 široký (disperze x 0 ), ale ionty mají zanedbatelnou disperzi v 0 ve směru letu v TOF API, AP MALDI... laser (MALDI) Q1: výběr prekursoru Q: CID orthogonální TOF: typicky pro API, ale i pro MALDI axiální TOF: typicky pro MALDI iontová optika Q3: iontový vodič, zaostření detektor reflektor () QTOF Ultima (Micromass/Waters) QTOFMS: hybridní TOF MS TOF-TOF Využití výhod obou analyzátorů Q: vhodné pro 1. MS, jako kolizní cela a pro úpravu iontového svazku TOF: dobré parametry pro. MS Výměnný iontový zdroj oddělení ionizace od analyzátoru vhodné pro kontinuální, kvazikontinuální i pulsní ionizační techniky Př.: QTOFMS: API (kontinuální iontový zdroj) AP MALDI (pulsní, kvazikontinuální iontový zdroj) (Medzihradszky, K. F.; Campbell, J. M.; Baldwin, M. A.; Falick, A. M.; Juhasz, P.; Vestal, M. L.; Burlingame, A. L. Anal. Chem. 000, 7, 55). Hybridní instrument pro API a MALDI LIFT TOF MS MS-MS s využitím TOF principu, dokonalejší PSD (LIFT) kv zdroj 6 kv LIFT cela 15 kv (puls) reflektor QTOF Ultima LIFT cela: vstupní mřížka trubice s mřížkami výstupní mřížka (Micromass/Waters) 15 kv (puls) 49
Spektrometrie iontové mobility Ion mobility spectrometry (IMS) 1970 Cohen, Karasek Charakteristika Technika na pomezí hmotnostní spektrometrie a elektroforézy Separace v důsledku tření iontů s okolním prostředím Ionty neseparovány podle m/z, ale podle své mobility Dokáže rozlišit i izomerii nebo počet nábojů (odlišná migrace M a M ) Ve srovnání s MS je rozlišení IMS nízké V praxi často použita jako jedna z technik multidimenzionální analýzy, např. ve spojení s běžnou MS; lze použít jako náhradu separace; časově vhodně odstupňované: separace: >s, mobilita: >ms, MS: <ms Př.: ESI - IT - IM - TOFMS digestu koňského albuminu Aplikace bezpečnost (výbušniny), vojenské aplikace (jednoduchá přenosná zařízení) studium konformace látek (malé molekuly, proteiny...) v plynném stavu Myung S. et al. Anal. Chem. 003, 75, 5137-5145. Př. 1: IMS Q Př. : IMS TOF Driftová trubice: rovnováha elektrické a třecí síly prstence s klesajícím napětím podobně jako v reflektoru zvýšený tlak p ~ 10 Torr (He, Ar, N ), E ~ 10-50 V/cm, l ~ 10-100 cm Odlišné řešení driftové trubice: průběh potenciálu na prstencích připomíná pohyb mořských vln Menší ionty (s vyšší mobilitou) surfují ochotněji na vlnách potenciálu a dorazí na konec driftové zóny dříve Clemmer D. E., Jarrold M. F. J. Mass Spectrom 1997, 3, 577-59. Kredit: waters.com IM spektra lysozymu v závislosti na jeho konformaci IMS - TOF Clemmer D. E., Jarrold J. F. Mass Spectrom 1997, 3, 577-59. Triwave: ciprofloxacin, m/z = 33,141 Kredit: waters.com 50
Př. 3: DMS, FAIMS Differential (ion) mobility spectrometry Field assymetric waveform ion mobility spectrometry - zařazení jednoduché cely před vstup do hmotnostního spektrometru - různá konstrukční řešení cely Laterální rozlišení v MSI 1873 Ernst Abbe: difrakční limit n sinθ numerická apertura (NA), ~ 1.4-1.6 v moderních mikroskopech Abbeho limit d ~ λ/ ~ stovky nm Louis de Broglie (199 Nobelova cena) dualita částic a vlnění Vis foton... 400-800 nm... - 3 ev... optická mikroskopie, LDI, MALDI e -, Xe... 5 kev... 1 nm... elektronová mikroskopie, SIMS Pozn.: DESI MSI není limitována zaostřením částic ve vakuu Využití IMS MSI Separace izomerů, dle konformace Odstranění matrice vzorku Dostupné v kombinaci s vysoce rozlišujícím MS i MS/MS Multidimenzionální analýza Jednoznačnější identifikace Separace intramolekulárních protonovaných specií Studium místa protonace Rozdílné typy fragmenatce Výpočet kolizního průřezu Stoeckli, M.; Staab, D.; Staufenbiel, M.; Wiederhold, K.H. Anal. Biochem., 00, 311, 33-39 Zobrazovací hmotnostní spektrometrie, MSI MSI... mass spectrometry imaging - přímá vizualizace bez derivatizace - možnost MS/MS - analyzátory: TOF (rychlost), FT-ICR a O (rozlišení) - rozlišení: laterální, hloubkové a hmotnostní - 3D MSI Ionizační techniky (a limit laterálního rozlišení): SIMS: nm MALDI: mm DESI: 100 mm 8 Detektory a detekční elektronika. Principy vakuové techniky. Spojení separace a hmotnostní spektrometrie: Hmotnostní instrumentace spektrometrie biomolekul (on-line, 017off-line, čipy) 51
Detekce iontů Faradayův pohár, Faradayova miska Elektronový násobič Channeltron Mikrokanálková destička (MCP) Indukce (FT-ICR-MS, orbitrap) Daly detektor Plošné multikanálové detektory (array detectors) Fotografická deska Kombinace MCP a diodového pole (MCP-diode array) aj - -3 kv Channeltron Skleněná trubice s vrstvou polovodivého PbO uvnitř. Proud tekoucí polovodivou vrstvou vytváří gradient potenciálu podél trubice (místo dynod s diskrétním gradientem). Násobení elektronů jako v elektronovém násobiči. Pro detekci kationtů nutná konverzní dynoda. Zisk ~ 10 6 0 V -100 V Faradayův pohár (Faraday cup) Mikrokanálková destička (microchannel plate, MCP) MCP s mikrokanálky -100 V - Velmi malé proudy Př.: 100 iontů/s 1.6x10-17 A -10 V Rozměry MCP tloušťka ~1 mm průměr 1-10 cm. Mikrokanálky orientovány šikmo, průměr ~ 3-0 mm. Chevronová struktura v sestavách více MCP. pokryté polovodivou vrstvou PbO,... vznik gradienu napětí podél mikrokanálku (kontinuální dynoda, násobení elektronů) Plošný detektor vhodný pro TOFMS Zisk jednoho MCP ~10 3, dvojitého MCP ~10 6. kolektor 0 V -. kv -00 V -1. kv Elektronový násobič Daly detektor - kv dynody vyleštěná kovová elektroda, -30 kv atd. kolektor, 0 V vrstvička fofosforu tenký kovový film fotonásobič Obdoba fotonásobiče: konverzní elektroda se sérií dynod (s potenciálem vzrůstajícím zleva doprava) a kolektorem. Elektronový násobič není zapouzdřen ve skleněné baňce. Konverze iontu na elektron(y) na první elektrodě (např. Cu-Be). Znásobování elektronů na dynodách. Záchyt elektronů na kolektoru, vznik proudu. Zisk ~ 10 6 Iont elektron(y) 4 fotony (fosfor) Velmi nízký šum. Velmi vysoký výkon (fotonásobič obvykle v režimu počítání fotonů). - Ruší světlo. - Vyžaduje nízké tlaky (p < 10-5 Pa). 5
Plošné multikanálové detektory (Array detectors) např. pro magnetický sektor Fotografická deska - historický detektor, zdlouhavé zpracování Signál v MS Osa y: návoj, proud, napětí, počet iontů??? a.u. (arbitrary units) nebo relativní intenzita Kombinace MCP a diodového pole (MCP-diode array) fosfor diodové pole MCP svazek optických vláken Zařazení optických vláken umožňuje dosežení vyššího plošného rozlišení. %Int. 100 90 80 70 60 50 40 normalizace iontového signálu Další detektory... kombinace výše uvedených detektorů Př.: MCP a fosforový scintilátor izolace vysokého napětí 30 0 10 0 600 700 800 900 1000 1100 100 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 000 100 00 300 400 500 Mass/Charge Záznam dat v MS Záznamová zařízení ionty elektrony proud náboj, q konverze (konverzní účinnost, amplifikace) I = q/t (t... čas) digitální převodníky A/D převodník (analog to digital) T/D převodník (time to digital) fotografická deska (historický) zapisovač signálu (historický) analogový osciloskop s fotoaparátem (historický) napětí U = IR (R... impedance) záznamové zařízení Odlišná schemata pro fotografickou desku a scintilační detektory Záznam dat v MS I(m/z) = f(x) = f(t) Skenující přístroje Skenovaná veličina Doba skenu MAG magnetický sektor B, U ~ 1 s Q kvadrupólový filtr U, V, f ~ 0.1 s IT, LT iontové pasti U, V, f ~ 1 s Přímý záznam v čase: TOF FT-ICR iontový cyklotron ~ 100 ms ~ 1 s Další neskenující přístroje mohou pužívat plošné detektory (array). Detekční elektronika - A/D převodník Měřění (digitalizace) napětí Základní parametry počet bitů (rozlišení převodníku) vzorkovací frekvence, počet vzorků za sekundu [vz/s, sample/s] max. frekvence (cut-off frequency) polarita: unipolární (negativní), bipolární rozsah vstupního napětí max. vstupní napětí počet bodů (délka paměti, velikost pufru) stabilita aj. 53
Iontový signál (a.u.) A/D převodník (analog/digital) Př.: -bitový převodník s rozsahem 0-3V a vz. frekvencí 10 vz/s počet úrovní = : úroveň high-bit low-bit perioda, T = 1/10 = 0.1 s S A (V) 3 1 0 0 0. 0.4 0.6 t (s) 0 0. 0.4 0.6 t (s) S D (#) 0 0 0 1 0 1 1 0 3 1 1 Rychlost záznamu spektra... dána vzorkovací frekvencí AD převodníku Faktory: doba skenu rozsah skenu požadované rozlišení požadovaná kvalita píku (počet bodů/pík) Př. 1: Požadavky na Q: doba skenu = 0.1 s, jednotkové rozlišení v rozsahu m/z = 00 000, >10 bodů/pík. Minimální vzorkovací frekvence? min. vzorkovací frekvence = ( 000-00)x10/0.1 = 180 ksample/s délka paměti = ( 000-00)x10 = 18 000 vz. pro 16-bitový převodník 36 kbyte Přesnost záznamu Přesnost (a správnost) měření dána počtem bitů AD převodníku Např. pro 8-bitový převodník 8 = 56 úrovní: nepřesnost odpovídá 1/ úrovně min. rel. chyba > (x(počet úrovní - 1)) -1 = (1/x55) -1 ~ 0. % Př. : Jak rychlý musí být A/D převodník pro TOFMS, abychom zaznamenali iont letící 0 ms s rozlišením 000, chceme-li definovat pík 10 body? t = 0 ms, R = 000 Rychlost A/D převodníku Signál 100% počet bitů 1 8 1 16 4 počet úrovní 56 4 096 65 536 16 777 16 R = m/ m = t/( t) t = t/r = 0 ms/4000 = 5 ns (FWHM) 50% t 5 ns min. rel. chyba (%) 50 0. 0.01 8x10-4 3x10-6 celý pík (~10 bodů) 10 ns t sample = 1 ns (1 ns/vz) 0 ms t dyn. rozsah (rel. chyba < 10%) - 50 800 13 000 3 000 000 vzorkovací frekvence, f = 1/ t sample = 1 Gsample/s Iontový signál 10 8 6 4 0 100 10 104 m/z Příčiny: nízká úroveň signálu převodník s nízkým počtem bitů Volba A/D převodníku Řešení: vyšší zisk detektoru převodník s vyšším počtem bitů akumulace více spekter (průměrování) Iontový signál 50 00 150 100 50 0 100 101 10 103 104 105 m/z 5000 0000 15000 10000 5000 Vliv vzorkovací frekvence AD převodníku (TOFMS) 5000 Gsample/s 1 Gsample/s 500 Msample/s 10 ns 0000 15000 10000 5000 10 ns Time of flight ( ms) 0000 18000 16000 14000 1000 10000 8000 6000 4000 10 ns 54
A/D - současný stav Vysoký počet bitů: 4 bitů ale pouze při nízké vzorkovací frekvenci (1 khz) Vysoké vzorkovací frekvence: 0 Gsamples/s ale pouze pro nízkobitové A/D (8 bitů) Vysoký výkon akumulace (průměrování) dat přímo v kartě komprese v kartě (algoritmy bez ztráty i se ztrátou dat) rychlý přenos dat z karty do PC... PCI karta v počítači, přímé adresování PC paměti T/D převodník (time/digital) Ze skupiny iontů dopadajících na detektor během jedné periody je využit pouze jeden. Vhodný pro záznam signálu s vysokou opakovací frekvencí přijatelná (statistika po naakumulování dostatečného počtu spekter). Nižší cena (oproti A/D). Aplikace: TOFMS s vysokou frekvencí extrakčních pulsů (>khz) ESI - otofms AP-MALDI otofms TOFMS s nízkým počtem iontů PD TOFMS T/D převodník (T/D converter, TDC) Počítání pulsů Náraz iontu na detektor puls zesilovač diskriminátor čítač T/D převodník (time to digital) 1-bitový A/D převodník úrovně: 0 a 1 Parametry: časové rozlišení (počet kanálů) aj. T/D převodník (time/digital) Vícekanálové T/D převodníky... ke zvýšení dynamického rozsahu... pomocí skupiny T/D převodníků se segmentovaným detektorem Klasický TOF detektor MCP T/D 1 bit S A (V) 100 % S D1 (#) 1 S Dn (#) n 0 0 0 40 60 t (ms) 0 0 0 40 60 t (ms) Analogové spektrum (1 puls) prahová úroveň signálu 0 0 0 40 60 t (ms) Digitalizované spektrum (1 puls) Akumulace n spekter Akumulované digitalizované spektrum (n pulsů) Segmentovaný TOF detektor Seg. MCP T/D převodník (time/digital) T/D T/D T/D T/D 1 bit 1 bit 1 bit 1 bit 4 bity Ionty dopadají na čtyři segmenty se stejnou pravděpodobností...celkový tok iontů může být vyšší 55
Hardware: nejrozšířenější PC (IBM) Software: Windows XP Informatika Exponenciální růst výkonnosti: Mooreův zákon Př.: Vyhodnocení MS/MS spekter programem SEQUEST SCX - LC - MS/MS digestu směsi proteinů (YH kvasnice) Evangelista Torricelli (1608-1647) Jednotka tlaku: 1 Torr = 1 mm Hg Základy vakuové techniky Tlak, p p = síla/plocha [Pa, N/m ] 1 atm = 760 Torr = 101 35 Pa = 101.35 bar = 14.70 psi 1 Torr = 133 Pa Vakuum stav plynu s p < 10135 Pa Střední volná dráha molekuly Střední dráha, kterou urazí iont mezi srážkami l = ( ps n ) -1 l(cm) = 0.66/p(Pa)... pouze hrubý odhad pro vzduch při 5 C Režimy toku plynu SCX-LC 1. Turbulentní tok. (p > 10 kpa) velmi malá l mnoho srážek mezi molekulami. Viskózní, kontinuální tok. (p = 1000-0.1 Pa, "hrubé" vakuum) l = mm - cm: stále mnohem menší než rozměry vakuových aparatur více kolizí molekula - molekula než molekula - stěna MS/MS 3. Molekulární tok. (p < 0.01 Pa, "vysoké" vakuum, HV, UHV) l > m: převládají kolize molekul se stěnami vakuové aparatury obvyklá situace v hmotnostním spektrometru pozn.: UHV = ultra high vacuum Př.: klastr pro vyhodnocení SCX-LC-MS/MS 1x master PC ( procesory P4, 3 GHz) 8 x slave PC ( procesory P4, 3 GHz) vše propojeno 1-Gbitovou sítí Průtok plynu, Q [Q] = Pa m 3 /s, Pa L/s Průtok plynu C konduktance trubice o průměru D a délce L C = f(d, L, p, plyn, T), [C] = L/s Při molekulárním toku C nezávisí na tlaku p: C D 3 /L (aproximace) Při viskózním toku C závisí na tlaku p: C pd 4 /L (aproximace) Návrh vakuových aparatur Krátké tlusté spoje C rychlejší dosažení požadovaného tlaku. Sériové spojení trubic - nejúzší místo omezuje celý systém: 1/C tot = S1/C i 56
Rychlost pumpování Turbomolekulární pumpa Rychlost pumpování, S Q S p [S] = L/s Série velmi rychle rotujícich turbín (až 50 000 rpm). Molekuly plynu jsou odráženy lopatkami turbín. Obvodová rychlost turbíny > rychlost molekul plynu. 1/S komora = 1/S pumpa 1/C tot Správný návrh: C tot > S pumpa tj., nemá smysl koupit výkonnou pumpu a pak omezit celkovou rychlost pumpování komory úzkými spojovacími trubicemi. Pozn.: V režimu molekulového toku pumpa nenasává plyn. Pumpa funguje jako past; molekuly, které dorazí k pumpě, se neodrazí zpět do komory. Rychlost pumpování je různá pro různé plyny (klesá s m plynu). Tlak v celém systému není stejný, záleží na umístění tlakového čidla. Outgassing. Dobu nutnou k dosažení vakua prodlužuje přítomnost plynných a těkavých látek adsorbovaných (vzorek, otisky prstů) a absorbovaných v systému (plyny v těsnění, plastových součástkách). Závislost vstupního a výstupního tlaku na molekulové hmotnosti plynu: ln (p out /p in ) m UHV pumpa, tlak > 10-8 Pa Rychlosti pumpování do ~ 3000 L/s Běžná UHV pumpa v komerčních systémech. Mechanická pumpa Difúzní pumpa Turbomolekulární pumpa Kryopast Vakuové pumpy Difúzní pumpa Speciální netěkavý olej se zahřívá topnou spirálou v základně, páry oleje stoupají trubicí uprostřed, tryskají šikmo dolů na chlazené stěny a stékají na základnu. Speciální olej letící z trysek strhává molekuly okolního plynu. Často přídávána chlazená past (vodou, kapalným N ) nad pumpu zachycení příp. úniku oleje. UHV (ultra-high vacuum) pumpa, tlak > 10-6 Pa. Spolehlivá pumpa, nevyžaduje údržbu. Pomalý ohřev i chladnutí. Kryopast Sorbent (např. dřevěné uhlí) chlazený na 4 K (kapalným He). Nutnost regenerace. Jedno- a vícestupňové. Mechanická pumpa Rotor v oleji - min. tlak omezen vypařováním oleje - nutná past na olejové páry - nutné výměny oleje Ohřev UHV systémů Molekuly plynu se adsorbují na vnitřní stěny hmotnostního spektrometru. Pomalá desorpce molekul plynu zvyšuje tlak a prodlužuje dobu nutnou k dosažení požadovaného vakua. Dosažení UHV je možné urychlit zahřátím systému (např. odporově vyhřívanou vodivou páskou omotanou kolem systému), což posune rovnováhu od adsorpci směrem k desorpci. Tlak > 0.1 Pa "hrubé" vakuum. Rychlost pumpování, S: typicky 1 500 L/s Běžná pumpa v komerčních systémech. 57
Měření tlaku Hydrostatický tlakoměr Stanovení tlaku z rozdílu hladin. Rozsah do 1 kpa, u speciálních konstrukcí až do 0.1 Pa. Mechanické tlakoměry Stanovení tlaku podle výchylky pružné membrány. Snímání vychýlky - mechanické - kapacitní (rozsah 10 5 10 - Pa) Termočlánek (Thermocouple gauge) Bimetalový termočlánek a odporově žhavené vlákno. Přenos tepla z vlákna na termočlánek závisí na tlaku a druhu plynu. Rozsah p: 100 Pa - 0.1 Pa, u speciální varianty (convectron) 100 kpa - 0.1 Pa. Vzájemné rušení MALDI signálu ve směsi peptidů Ion Intensity (V) 0.5 AIII c(peptidů) = 1 mm 0.0 AF 1-7 AII 0.15 AF 3-8 AI 0.10 AG 1-14 0.05 0.00 600 800 1000 100 1400 1600 1800 000 0.5 AII (off scale) 0.0 0.15 c(peptidů) = 1 mm kromě c(aii) = 50 mm 0.10 0.05 0.00 600 800 1000 100 1400 1600 1800 000 m/z Měření tlaku Iontová trubice (Ion gauge) Bayard & Alpert: iontová trubice se žhavenou katodou. Tři elektrody ve skleněné baňce: spirála (), drát (-) ve středu spirály a žhavené vlákno (-) vně spirály (žhavná katoda). Stejná sestava jako u otevřeného iontového zdroje: elektrony ze žhavého vlákna urychleny ke spirále, docházi k ionizaci plynu, záchytu iontů na drátu a měření proudu. p = f(proud). Pozor, proud je funkcí složení plynu! Rozsah p: 10 - - 10-10 Pa (vysoké vakuum, UHV) Penning: iontová trubice se studenou katodou. K tvorbě iontů je použit výboj. Rozsah p: 1-10 -4 Pa Typy interface Plyn vakuum tryskový separátor pro obohacení ABC v nosném plynu (particle beam) membránové interface kapilární kolona (klasická kolona splitter) Kapalina vakuum API ionizační metody (ionizace přímo z kapaliny za atmosferického tlaku) Průtokové sondy (FAB) Nanesení vzorku na tuhý nosič (terčík) - pohyblivý pás (naneseni při atmosferickém tlaku přenos, diferenciální pumpování - ionizace) - Sběr frakcí Pozn: v komerčních zařízeních se používají termočlánky a iontové trubice. Spojení separace a hmotnostní spektrometrie Proč separace?... nutnost analýzy velmi složitých vzorků, směsí mnoha analytů, např. v případě proteomiky vzorek obsahuje běžně >10 peptidů Samotná MS a MS/MS není dostačující z několika důvodů: vysoká pravděpodobnost výskytu nebo více analytů o stejné m/z překryv izotopických obálek analytů s blízkou m/z vzájemné rušení analytů omezený dynamický rozsah hmotnostního spektrometru rozlišení 1. stupně při MS/MS často nedostatečné (R 1 ~ 500) odstranění nečistot zdroj dalších informací o analytech Nejrozšířenější metody: Separace - ESI MS D GE - MS -rozměrná gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu následné vyříznutí zóny a zpracování proteinu běžná planární technika pro separaci proteinů RPHPLC ESI MS kapalinová chromatografie na reverzní fázi ESI MS běžná kolonová technika pro analýzu peptidů Data dependent scan... 1 MS sken následován několika MS/MS skeny (podrobněji v části o aplikacích) 58
ESI MS Separace biomolekul: MALDI nebo ESI? Kompatibilní se separací Komerčně dostupný, rutinní použití Možnost MS-MS Vysoká citlivost Snadná automatizace - Nelze archivovat vzorek - Minoritní složky neanalyzovány v MS-MS modu - Kvantifikace vs. MS-MS - LC gradient často pomalý Archivování vzorku (MALDI) Postup při separaci s MALDI MS a MS/MS detekcí 1. Nanesení eluentu na terčík. MALDI MS analýza (<10% vzorku spotřebováno) 3. Analýza MALDI MS dat 4. MALDI MS-MS vybraných píků (detailní analýza) (Po 1. kroku může být postup kdykoli přerušen.) MALDI MS Jednodušší spektra Oddělení separace od hmotnostní analýzy Možnost archivování vzorku Interface pro MALDI Průtoková sonda (on-line) Obvyklý postup: Nanesení kapalného vzorku na terčík Vysušení vzorku Vložení terčíku do spektrometru a analýza Režim 1. On-line. Off-line 3. In-line Přídavek MALDI matrice 1. Smíchání s roztokem analytu (sheath flow, T, liquid junction). Nanesení roztoku na terčík pokrytý vrstvičkou matrice Sběr eluentu 1. Diskrétní frakce. Spojitá stopa Whittal, R. M., Russon, L. M., Li, L. J. Chromatogr. A 1998, 794, 367-375. Interface pro MALDI Off-line Terčíky s hydrofilními místy (anchorchip). Mikrometody používající piezoelektrické pipetory a mikroterčíky. Nanášení vzorku pomocí elektrospreje Zmlžovač pro tvorbu aerosolu (on-line) On-line Průtoková sonda s fritou Průtoková sonda bez frity Zmlžovač pro tvorbu aerosolu In-line Interface ROBIN Nanášení vzorku na povrch ve vakuu, moving belt interface Off-line vs. on-line Oddělení separace od hmotnostní analýzy Možnost archivování vzorku Fei, X., Wei, G., Murray, K. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1143-1147. 59
Moving belt interface (in-line) Automatizovaný sběr frakcí (off-line) Rozhraní pro kontinuální zavádění netěkavého vzorku v těkavějším solventu do hmotnostního spektrometru horký N LC eluent iontový zdroj vyhřívací element štěrbiny IR vyhřívání pohybující se polyimidový pás k vakuovým pumpám McFadden W. H., Schwartz H. L. and Evans S. J. Chromatogr. 1, 389, 1976. Např.: Probot (zdroj: www.lcpackings.com) ROBIN (rotating ball inlet), in-line Spojení čip hmotnostní spektrometrie (čip, mikročip, microfluidic device) Proč mikro makro?... Možné výhody čipu: integrace více kroků, lab on a chip (dávkování, příprava, separace...) paralelní analýzy (opakující se motiv na jednom čipu) nízká cena čip na jedno použití (při sériové výrobě) veškeré úpravy na čipu, MS detektor Základní typy: 1. D pole afinitní pole: nejprve zakoncentrování specifických látek, poté MALDI MS přímo z čipu pole vialek se špičkami pro ESI: zvýšení reprodukovatelnosti analýzy Orsnes, H., Zenobi, R. Chem. Soc. Rev. 001, 30, 104-11.. Fluidní systém (čipy s kanálky) systémy pro paralelní analýzu pro ESI, MALDI... systémy integrující několik kroků Nanášení vzorku ve vakuu (in-line i off-line) ND GENERATION VACUUM DEPOSITION INTERFACE Mikrometody atmospheric pressure source chamber (p ~ 10-6 Torr) deposition support repeller probe with capillary interface flange source coil Mylar tape target coil rubber wheel repeller center (tape guide) propelled shaft Laurell, T.; Nilsson, J.; Marko-Varga, G. Trends Anal. Chem. 001, 0, 5-31. 60
Příklad návrhu čipu pro paralelní analýzu infúzní kapiláry do sondy společný kapalinový spoj IV. Biologické aplikace MS Genom, proteom, metabolom. Malé organické molekuly - biomolekuly, léky, petrochemické produkty. Biopolymery (DNA, proteiny, cukry). Syntetické polymery. Proteomika separační kanálky Charakterizace peptidů a proteinů proteinového komplementu genomu. V současnosti hlavní a nejperspektivnější aplikace hmotnostní spektrometrie. Genom proteom. Uroveň exprese gen protein různá. kapiláry pro dávkování vzorků z mikrotitrační destičky Genom je v podstatě statický, proteom dynamický: exprese závisí na druhu a funkci proteinu, poloze v buňce, stavu a zdraví buňky. Funkce organismu souvisí bezpprostředně s proteomem. Čip vs. konvenční zařízení Proteomika Analýza proteomu složitější než analýza genomu - více stavebních kamenů, aminokyselin - variabilita - modifikace aminokyselin - neexistuje metoda amplifikace proteinu obdobná PCR - nízká množství mnoha proteinů (např. regulačních proteinů) Diferenční proteomika Stanovení rozdílné exprese proteinů (přítomnosti nebo absence) v ovlivněném a zdravém organismu (orgán, tkáň, buňka). Funkční proteomika Stanovení všech interakcí (protein-protein, protein-dna, atd.) v daném organismu (orgán, tkáň, buňka). 9 Biologické aplikace MS: proteomika. Separační techniky Enzymatické štěpení proteinů. Identifikace proteinů: mapování peptidů, sequence tag, accurate mass tag. IUPAC názvosloví aminokyselin Trivíální název Symboly Vzorec Alanine Ala A CH 3 -CH(NH )-COOH Arginine Arg R H N-C(=NH)-NH-[CH ] 3 -CH(NH )-COOH Asparagine Asn N H N-CO-CH -CH(NH )-COOH Aspartic acid Asp D HOOC-CH -CH(NH )-COOH Cysteine Cys C HS-CH -CH(NH )-COOH Glutamine Gln Q H N-CO-[CH ] -CH(NH )-COOH Glutamic acid Glu E HOOC-[CH ] -CH(NH )-COOH Glycine Gly G CH (NH )-COOH Histidine His H 61
IUPAC názvosloví aminokyselin Trivíální název Symboly Vzorec Isoleucine Ile I C H 5 -CH(CH 3 )-CH(NH )-COOH Leucine Leu L (CH 3 ) CH-CH -CH(NH )-COOH Lysine Lys K H N-[CH ] 4 -CH(NH )-COOH Methionine Met M CH 3 -S-[CH ] -CH(NH )-COOH Phenylalanine Phe F C 6 H 5 -CH -CH(NH )-COOH Proline Pro P Serine Ser S HO-CH -CH(NH )-COOH Současné ionizační techniky v proteomice FAB max. m ~ 10 000 LD ~ 0 pmol (klasický FAB), < 1 pmol (CF-FAB) ESI max. m ~ 100 000 Da (z >> 1) LD < 10 fmol (rutinní) LD ~ amol nebo 10-9 M (vybrané aplikace) MALDI max. m ~ 10 6 (prakticky neomezen TOF analyzátor) relativně nejvíce odolná vůči rušení nečistotami LD < 10 fmol (rutinní) LD ~ amol nebo 10-9 M (vybrané aplikace) IUPAC názvosloví aminokyselin Hmotnostní spektrometry v proteomice Trivíální název Symboly Vzorec Threonine Thr T CH 3 -CH(OH)-CH(NH )-COOH Tryptophan Trp W MALDI MS ESI MS-MS vysoký počet vzorků/čas TOF objasnění struktury QqTOF, IT, FT ICR Tyrosine Tyr Y Valine Val V (CH 3 ) CH-CH(NH )-COOH Nová instrumentace MALDI TOF-TOF, MALDI LIFT TOF MALDI QqTOF rychlá identifikace v MS modu možnost detailní analýzy v MS-MS modu později Historický přehled ionizačních metod vhodných pro analýzu peptidů a proteinů 1969 FD Desorpce polem (Beckey) 1974 PD Plazmová desorpce (McFarlane) 1976 SIMS MS sekundárních iontů (Benninghoven) 1981 FAB Ionizace rychlými atomy (Barber) 1984 ESI Electrosprej (Fenn) 1987 MALDI Laserová desorpce za účasti matrice (Karas, Hillenkamp) 1994 nano-esi Nanoelektrosprej (Wilm, Mann) Separační metody v proteomice GE gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu HPLC vysoceúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi IEC chromatografie na iontoměničích AC afinitní chromatografie CE kapilární elektroforéza Centrifugace běžná centrifugace, gradientová centrifugace 6
Gelová elektroforéza (GE) Př.: RP HPLC směsi peptidů (digest BSA) D SDS PAGE D: -rozměrná elektroforéza 1. rozměr: dle pi (izoelektrická fokusace). rozměr: dle velikosti SDS pro denaturaci (náboj/velikost = konst.) PA: polyakrylamidový gel jako separační médium Vhodná pro separaci tisíců až desetitisíců proteinů, v případě velmi jednoduchých směsí stačí i 1D GE Rychlá identifikace a charakterizace proteinů na D gelu je nejběžnější analýzou současné proteomiky Zhruba 5% proteinů a 30% peptidů migruje anomálně PTM ovlivňují zdánlivou m proteinů (chyba až 50%) Problematický transport proteinů z gelové matrice (elektroblot na membránu) Zdroj: ThermoFinnigan 00 Př.: D GE lidské plazmy protein Enzymatické štěpení proteinů enzym směs peptidů Důvody přechodu z oblasti vysokých m/z do oblasti nízkých m/z: 1. Lepší parametry hmotnostních spektrometrů (vyšší rozlišení, přesnost a správnost stanovení m/z, citlivost). Úžší izotopová obálka (jednodušší spektra, vyšší citlivost) Zdroj: Expasy Pozn.: digestion = enzymatické štěpení, trávení digest = směs tryptických fragmentů, produkt enzymatického štěpení úpravy před štěpením: redukce -S-S- můstků: dithiothreitol (DTT) alkylace SH: jodoacetamid (IAA) m: 57 Da důvod: rozbalení proteinu... lepší přístup enzymu RP HPLC Nterm...-XXX-XXX-Lys-YYY-XXX-XXX-... Cterm ^ / \ trypsin cleaves this peptide bond Enzymatické štěpení proteinů Kolona: klasická, kapilární (f 300 mm) nebo nano LC (f 75 mm) Náplň: C 18, velikost nosiče: 3 10 mm (RP... reverse phase) Gradientová eluce, např: - start: 10% org fáze 90% vodné fáze - konec: 80% org fáze 0% vodné fáze - organická fáze: ACN (acetonitril) 0.1% TFA (kyselina trifluoroctová) - vodná fáze: 0.1% TFA Organický solvent přispívá k rozpustnosti peptidů, umožňuje detekci v UV (30 40 nm) a rychle se vypařuje, což je výhodné pro sběr frakcí např. pro MALDI MS. Standardní technika kolonové separace pro peptidy a proteiny Nejčastěji trypsin (různě upravený, např. TPCK k potlačení chymotrypsinové aktivity, methylací aj.). Další enzymy: lysin, chymotrypsin, CNBr aj. Produkty enzymatického štěpení specifické fragmenty analyzovaného proteinu Např. trypsin štěpí na C-straně aminokyselin K or R, pokud není soused P. (Skutečná pravidla ještě složitější): N terminál-x-x-x-x-x-k (nebo R)-Z-Z-Z-Z-Z-Z-C terminál (Z P) nespecifické fragmenty analyzovaného proteinu artefakty (modifikace aminokyselin, např. oxidací, díky PA gelu atd.) fragmenty enzymu (autolýza) fragmenty keratinu ( ) 63
Enzymatické štěpení proteinů v D gelu 1. Wash the gel slices for at least 1 hr in 500 microliters of 100 mm ammonium bicarbonate. Discard the wash.. Add 150 microliters of 100 mm ammonium bicarbonate and 10 microliters of 45 mm DTT. Incubate at 60 degrees centigrade for 30 min. 3. Cool to room temp and add 10 microliters of 100 mm iodoacetamide and incubate for 30 min in the dark at room temperature. 4. Discard the solvent and wash the gel slice in 500 microliters of 50% acetonitrile/100 mm ammonium bicarbonate with shaking for 1 hr. Discardthe wash. Cut the gel into -3 pieces and transfer to a 00 microliter eppendorf style PCR tube. 5. Add 50 microliters of acetonitrile to shrink the gel pieces. After 10-15 min remove the solvent and dry the gel slices in a rotatory evaporator. 6. Re-swell the gel pieces with 10 microliters of 5 mm ammonium bicarbonate containing Promega modified trypsin (sequencing grade) at a concentration such that a substrate to enzyme ratio of 10:1 has been achieved. (If the amount of protein is not known, add 0.1-0. microgramsof modified trypsin in 10 microliters of 5 mm ammonium bicarbonate).after 10-15 minutes add 10-0 microliters of additional buffer to cover the gel pieces. Gel pieces need to stay wet during the digest. Incubate 4 hrs to overnight at 37 degrees Centigrade.Proceed to step 8 if further extraction of the gel is desired (recommended)- otherwise continue with step 7. 7. Approximately 0.5 microliters of the supernatant may be removed for MALDI analysis and/or the supernatant acidified by adding 10% TFA to a final concentration of 1% TFA for injection onto a narrowor microbore reverse phase column. (If necessary the sample's volume may be reduced~1/3 on a rotatory evaporator.) 8. Extraction (Optional)- Save supernatant from step 7 in tube X, and extract peptides from gel twice with 50 microliters of 60%acetonitrile/0.1% TFA for 0 min. Combine all extracts in tube X (using the same pipet tip to minimize losses), and speed vac to near dryness.reconstitute in 0 microliters of appropriate solvent. Proceed with chromatography or MALDI analysis. Zdroj: http://www.abrf.org/researchgroups/proteinidentification/eposters/pirgprotocol.html Některé užitečné termíny genotyp genetické vybavení organismu, dispozice fenotyp skutečný obraz organismu, výsledek interakce s prostředím in vivo v žijícím organismu in vitro mimo žijící organismus, v umělém prostředí http://www.meta-library.net/gengloss Základní typy analýzy Strategie analýzy v proteomice 1. Identifikace (potvrzení přítomnosti známého proteinu ve vzorku). Relativní kvantifikace v diferenciální proteomice 3. Sekvenace neznámého proteinu/peptidu (de novo sequencing) Vzorek je obvykle směs mnoha proteinů/peptidů Analýza založena na použití separací s MS a MS/MS detekcí Identifikace Sekvence mnoha proteinů již byla popsána a není nutné ji znovu analyzovat. Identifikace proteinu Známé informace: - Původ vzorku (organismus) - Izoelektrický bod (pi) z D PAGE) - Molekulární hmotnost proteinu z D PAGE, příp. MALDI TOF MS - N- a C- část sekvence (Edmanova degradace)... Tyto informace nejsou dostatečné k identifikaci proteinu (nebo je jejich získání nemožné, příp. zdlouhavé) Metody identifikace A. D GE X MS (peptidové mapování) B. D GE X RPHPLC MS a MS/MS (sequence tag, AMT) C. X D LC (např. IEC a RHPLC) MS a MS/MS D. X AC (afinitní chromatografie) MS a MS/MS (IMAC, ICAT) E. Strategie využívající X a izotopové reagenty/standardy X... selektivní enzymatické štěpení Strategie analýzy v proteomice Top-down izolace proteinů zpracování proteinů, enzymatické štěpení analýza peptidů (MS, MS/MS) Bottom-up enzymatické štěpení separace peptidů analýza peptidů (MS, MS/MS) Identifikace proteinu Získání specifických informací o proteinu pomocí MS Srovnání specifických vlastností analyzovaného proteinu s knihovnou (obsahující specifické vlastnosti) známých proteinů. Specificita: 1.Analýza více peptidů se vztahem k proteinu peptidové mapování (PMF, peptide mapping), získání peptidového fingerprintu, analýza m/z produktů enzymatického štěpění.podrobná analýza jednoho peptidu z proteinu a) sequence tag, MS-tag - analýza části sekvence (z fragmenatce peptidu v plynné fázi b) accurate mass tag, AMT analýza složení části proteinu (z přesné m produktu enzymatického štěpění,) Vyžaduje vysokou správnost MS analýzy kvalitní databázi Identifikace používající MS jsou výrazně rychlejší a citlivější než chemické metody (Edmanova degradace) Negativní výsledek hledání v databázi = nový protein!!!!! 64
Mapování peptidů (peptide mapping, peptide mass fingerprinting, PMF) Určení proteinu analýzou produktů enzymatického štěpení 1. Separace a kvantifikace proteinů: D GE. Vyříznutí gelu, úprava, enzymatické štěpení Výsledky: Příklad hledání v databázích: MS Fit buňky, tkáň proteinový extrakt D gelová elektroforéza vyjmutí skvrny izolovaný protein (zpravidla v gelu) chemické úpravy a selektivní štěpení (např. trypsin, CNBr) peptidové fragmenty (digest proteinu) MS Fit - Identifikace proteinu z hmotností peptidových fragmentů pomocí programu na http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3./msfit.htm PMF 3. MS analýza a vyhodnocení výsledků Nedostatky PMF Vyžaduje izolaci čistého proteinu, max. -3 proteiny před enz. štěpením MALDI MS ESI MS peptidové fragmenty (digest proteinu) separace - ESI MS Vyžaduje správnost stanoveni m/z < 100 ppm, mnohem lépe <10 ppm Vyšší správnost stanovení m/z jednoznačnější odpověď hledání v databázi m/z hledání v proteinové databázi (identifikace známých proteinů) m/z ESI MS-MS vybraných peptidů Nepřítomnost očekávaných peptidů v digestu obvykle menší problém než přítomnost nadbytečných peptidů Zpravidla 4-5 peptidů dostačujících k získání spolehlivého výsledku struktura (nové peptidy a proteiny) Zadání: Příklad hledání v databázích: MS Fit PMF: teorie vs. praxe Nadbytečné píky neselektivní štěpení (např. chymotryptická aktivitá trypsinu) nečistoty (např. keratiny) nedostatečná separace (další proteiny ve skvrně) autolýza enzymu post-translační modifikace (PTM), artefakty Chybějící píky špatně rozpustné peptidy adsorpce peptidů vzájemné rušení peptidů neselektivní rozštěpení peptidu nedostatečné štěpení proteinu (sterické zábrany) PTM, artefakty 65
Metoda Sequence-Tag (MS-Tag) Experimentální sestava D LC/MS/MS Identifikace proteinu na základě přesné znalosti malé části jeho sekvence (sequence-tag, MS-tag), zpravidla sekvence jednoho peptidu Přesné stanovení sekvence aminokyselin části proteinu (typicky jednoho peptidového fragmentu z enz. štěpení) - obvykle pomocí ESI-MS/MS nebo MALDI-PSD-MS přímo z tabulky píků nebo spektra Potřebná délka části sekvence cca. 8-10 aminokyselin Čím delší sekvence je známa, tím přesnější je identifikace proteinu Známá část sekvence je hledána v proteinových databázích Další informace o proteinu: druh organismu, m (D GE), pi atd. 1D: Chromatografie na ionexu D: RHPLC ( HPLC kolony... vyšší produktivita) Zdroj: ThermoFinnigan 00 Strategie MALDI MS a LC - ESI MS Experimentální sestava D LC/MS/MS peptidové mapování MS/MS: MS-tag Zdroj: ThermoFinnigan 00 Zdroj: ThermoFinnigan 00 Schema D LC/MS/MS Řízení D LC/MS/MS experimentu Zdroj: ThermoFinnigan 00 Zdroj: ThermoFinnigan 00 66
počet peptidů Výsledky D LC/MS/MS experimentu AMT Zdroj: ThermoFinnigan 00 m/z MS směsi všech možných 10-merů peptidů při různých hodnotách R (a správnosti stanovení m/z): 103 (1000 ppm) (A), 104 (100 ppm) (B), 105 (10 ppm) (C), and 107 (0.1 ppm) (D). Zdroj: T. P. Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Paša-Tolić and R. D. Smith Anal Chem. 000, 7, 3349-3354 m/z LC-ESI MS a MS/MS: AMT Dynamická analýza LC-ESI MS/MS (data-dependent analysis): Jeden MS sken následovaný několika MS/MS skeny hlavních prekursorů V případě složitějších spekter i následující MS 3 skeny (např. pro detekci fosforylací) Zdroj: T. P. Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Paša-Tolić and R. D. Smith Anal Chem. 000, 7, 3349-3354 Accurate mass tag (AMT) Identifikace proteinu na základě znalosti správné hmotnosti jednoho fragmentu po enzymatickém štepení 10 Správné stanovení hmotnosti proteinu (typicky jednoho peptidového fragmentu z enz. štěpení) stanovení m pomocí FT ICR MS atom 1 H 1 C 14 N 16 O 3 S m [Da] 1.00785 1.000000 14.003074 15.994915 31.97071 Typický počet aminokyselin v řetězci peptidu ~ 10. Přesná hmotnost aminokyselin např. m mono (G)=57.0146, m mono (A)=71.03711 atd. Při správnosti stanovení m/z < 1 ppm je vysoká pravděpodobnost, že dané hmotnosti peptidu odpovídá jediné složení aminokyselin viz. následující obr. Aplikace: proteiny a peptidy. Izotopové značení. Metody ICAT a itraq. Stanovení sekvence. Post-translační modifikace. 67
Další strategie pro analýzu proteomu Nejsou pokusem o kompletní analýzu proteomu Spoléhají na kolonové separační techniky (místo D GE) Analýza ICAT (isotope-coded affinity tags) ICAT... isotope-coded affinity tags (R. Aerbersold) rozdíly v expresi proteinů stanovením relativních intenzit peptidů Zahrnují zjednodušení výchozí směsi výběr proteinů/peptidů, které obsahují např. cystein (ICAT), fosforylovanou aminokyselinu (IMAC) aj. Případné ztráty dané nekompletností analýzy nejsou dramatické a jsou vyváženy relativním zjednodušením směsi a kratší dobou analýzy Další přídavné prvky, např. použití izotopových značek, umožnují získat informaci o kvantitě analytu 1. Frakcionace proteinu. Enzymatické štěpení celého vzorku 3. Izotopové značení (ICAT) 4. Smíchání a MS analýza Využití izotopů v hmotnostní spektrometrii Analýza ICAT Značení nestabilním izotopem použití v radiochemii Značení stabilním izotopem běžně v hmotnostní spektrometrii Základní přístupy - použití izotopově značených vnitřních standardů - zabudování izotopově značených látek do organismů (vhodné pro dif. proteomiku nižších organismů) - derivatizace analytu izotopově značeným reagentem Některé zkratky v proteomice GIST Global Internal Standard Technology ( H, 13 C, 15 N) ICAT Isotope-Coded Affinity Tags (cystein) PhIAT Phosphoprotein Istope-coded Afinity Tag (fosforylované peptidy) IMAC Ion Metal Afinity Chromatography (afinitní záchyt fosfopeptidů) AQUA Absolute QUAntification (pomocí uměle syntetizovaných izotopicky značených peptidů jako interních standardů) SILAC Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture (růst kultrury v normálním a obohaceném médiu) MUDPIT Multidimensional Protein Identification Technology (SCX RHPLC MS/MS) Analýza ICAT Pozn. Proteiny lze označit před enzymatickým štěpením (záměna kroku a 3) Nedostatky ICAT první generace Rozdíl m izotopových značek roven 8 občas interference v MS/MS spektrech Nepatrně odlišná retence analytu označkovaných lehkou a těžkou formou značky. Důsledek: poměr lehké a těžké formy nelze zjistit z poměru iontových intenzit během HPLC MS/MS; je třeba integrovat celý LC pík ICAT druhé generace Použití 9 atomů 13 C ve spojovacím řetězci (místo 8 atomů D) Stejný eluční čas lehké i těžké formy v HPLC 68
Výhody Charakteristika ICAT Vhodná pro různé vzorky proteinů (tělesné tekutiny, buňky, tkáně, kultury) Značné zjednodušení směsi Kompatibilita s dalšími metodami vhodnými pro analýzu minoritních proteinů Nevýhody - Relativně velká značka (~500 Da) - Nevhodnost pro proteiny bez cysteinu (např. 8% u kvasinek) Stanovení sekvence proteinu/peptidu Klasická analýza - Edmanovo odbourávání - Určení koncových skupin (N, C) Nedostatky: doba analýzy, relativně nízká citlivost Současná strategie: kombinace více metod - preparativní separace - enzymatické štěpení - MS - MS/MS, ISF, PSD - MS n - další technika diferenciální proteomiky - vzrůst m/z derivatizovaných peptidů stejná (stejný prekurzor, velmi podobná separace) - rozdílná m/z produktového iontu - celkem 4 různá činidla pro derivatizaci peptidů - celková hmotnost stejná, hmotnost reporterů 114, 115, 116 a 117 itraq Stanovení sekvence peptidu MS Kombinace chemického štěpení a MS 1. Tvorba směsi peptidových fragmentů lišících se o jednu aminokyselinu chemickou cestou: a) fenyl izothiokyanát A 1 A A 3.. fenylizothiohydantoina A 3.. A 1 fenyl izothiokyanát A A 3.. fenylizothiohydantoina 3.. A atd. fenylizokyanát v malém množství jako terminační činidlo tvoří malou frakci fenylkarbamátu od každého peptidu b) alternativní strategie je založena na použití karboxypeptidázy po různě dlouhou dobu nebo v různých množstvích vznik několika směsí peptidů http://www.broadinstitute.org/scientificcommunity/science/platforms/proteomics/itraq. MALDI MS směsi fragmentů peptidů. aminokyselina je určena ze vzdálenosti sousedních píků, sekvence aminokyselin z pořadí píků itraq Příklad dvou derivatizačních činidel s reportéry 114 a 116: http://www.proteome.soton.ac.uk/itraq.htm Patterson, D. H., Tarr, G. E., Regnier, F. E. and Martin, S. A., Anal. Chem.1995, 67, 3971. 69
Stanovení sekvence peptidu MS/MS Fragmenty peptidů CID nízkoenergetická CID je v souč. nejrozšířenější metoda fragmentace IT, TQ, QTOF ISD vyžaduje izolaci čisté látky MALDI TOF PSD horší kvalita spekter než z CID, často nutno spojovat spektrum z více částí MALDI TOF Pozn. vysokoenergetická CID, SID, fotodisociace, disociace po nárazu elektronu nejsou používány rutinně Leu/Ile izomery, Gln/Lys... izobary Fragmentace peptidů Schéma fragmentace peptidu a značení fragmentů. Fragmentace 1 nebo vazeb peptidového řetězce - fragmenty obsahující N terminál (a, b, c) - fragmenty obsahující C terminál (x, y, z) - tyto ionty mohou vzniknout i fragmentací vazeb řetězce - ztráta NH 3, H O, CO Fragmentace bočního řetězce (zbytku aminokyseliny) - obvykle ztráta části bočního řetězce aminokyseliny - fragmetny typu d, w, v Vnitřní fragmenty - neobsahují N ani C terminál... menší analytický význam Immoniové ionty - užitečná informace o aminokyselinách; m(im)= m(akres) - 7 Schéma fragmentace peptidu a značení fragmentů. Další fragmenty peptidů x 3 y 3 z 3 x y z x 1 y 1 z 1 H R 1 O R O R 3 O R 4 H N - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - COOH a 1 b 1 c 1 a b c a 3 b 3 c 3 immoniové ionty aminokyselin: Roepstorff & Fohlman, Biomed. MS 1984, 11, 601. 70
aminokyselina m (mono) m (immonium) m (doprovodné ionty) A 71.0371 44 R 156.1011 19 59,70,73,87,100,11 N 114.0493 87 70 D 115.0695 88 70 C 103.00919 76 E 19.0460 10 Q 18.05858 101 56,84,19 G 57.0147 30 H 137.05891 110 8,11,13,138,166 I 113.08407 86 44,7 L 113.08407 86 44,7 K 18.09497 101 70,84,11,19 M 131.04049 104 61 F 147.0684 10 91 P 97.0577 70 S 87.0303 60 T 101.04768 74 W 186.0793 159 77,117,130,13,170,171 Y 163.06333 136 91,107 V 99.0684 7 41,55,69 m... reziduum ISD fragmenty Pravidla fragmentace dle relativní pevnosti vazeb. Typické produkty fragmentace peptidů: R 1 H N - CH - C - a 1 x 3 O b 1 y 3 NH - CH - C - c 1 z 3 R a c, y, z x O b y R 3 O NH - CH - C - c z a 3 x 1 b 3 y 1 NH - c 3 z 1 R 4 CH - COOH H Výpočet molekulové hmotnosti peptidu/proteinu Suma hmotností reziduí aminokyselin Hmotnost koncových skupin: obvykle 1 Da (H) pro N konec (-NH ) a 17 Da (OH) pro C konec (-COOH) Hmotnost protonu 1 Da iont většinou ve formě [MH] (ale i 3 Da pro adukt [MNa] atd.) ISD. Analyt: 0 pmol KGF analogu. Matrice: kyselina sinapová. Laser: N. (V. Katta, D. T. Chow, M. F. Rohde Anal. Chem., 70, 4410-4416, 1998.) CID fragmentace Typy iontů v CID 1. série píků iontů b a y. doprovodné píky 17, ztráta NH 3 z Gln, Lys, Arg 18, ztráta H O ze Ser, Thr, Asp, Glu a (tj. b 8), satelitní série fragmentů typu b (ztráta CO) 3. immoniové ionty aminokyselin. 4. interní fragmenty zejm. od Pro ve směru C konce Výběr prekurzoru v CID MS/MS: z = : [MH] Iont s dvěma náboji poskytuje CID spektra vyšší kvality než při z = 1 a 3 ISD Analyt: Matrice: Laser: oxidovaný B řetězec hovězího inzulinu thiomočovina Er:YAG (l = 936 nm) (http://medweb.uni-muenster.de/institute/impb/research/hillenkamp/publicat/abs-cm99.html) 71
PSD fragmenty Typické produkty fragmentace peptidů: a, b, y, z, d. Doprovodné píky 17 (ztráta NH 3 ) a 18 (ztráta H O). Immoniové ionty aminokyselin. Interní ionty zejm. od Pro ve směru C konce (B. Spengler J. Mass Spectrom. 3, 1019-1036, 1997) PSD bombesinu, zdroj: Bruker Daltonics, GmbH 000 Další typy disociace Electron capture dissociation, ECD Zubarev, R. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. Electron Capture Dissociation of Multiply Charged Protein Cations - a Nonergodic Process J. Am. Chem. Soc. 1998, 10, 365-366. McLafferty, F. W.; Turecek, F. Interpretation of Mass Spectra; Fourth ed.; University Science Books: Mill Valley, CA, 1993. Poskytuje odlišné, často komplementární fragmenty ve srovnání s CID a PSD immoniové ionty aminokyselin: Vyhodnocení MS/MS spekter peptidů Manuální a semiautomatická dedukce sekvence lokalizace iontových sérií typu b a y (doprovodná série a) identifikace immoniových iontů identifikace vnitřních fragmentů interpretace komplikována výskytem dalších fragmentů ne každý peptid po štěpení trypsinem ma má R a K na C-konci (nespecif.)... stanovení sekvence neznámého peptidu z CID je často nemožné Automatické stanovení sekvence MS/MS spektrum neznámého peptidu porovnáno s databází počítačem vygenerovaných spekter všech možných peptidů, které mají hmotnost prekurzoru algoritmus Sequest (J. R. Yates III et. al., 1994)... mnohem úspěšnější než deduktivní přístup PSD, zdroj: B. Spengler J. Mass Spectrom. 3, 1019-1036, 1997 7
Sekvenování proteinu Detekce mutací Postup 1. Enzymatické štepení tvorba více druhů digestů, aby vznikly různé, překrývající se štěpy - různě dlouhá doba štěpení - různé enzymy (trypsin, V8) - nahodilé štěpení, shotgun sequencing. Zjištění (alespoň částečné) sekvence štěpů RPHPLC ESI MS/MS Detekce záměny nebo absence aminokyselin(y) v řetězci proteinu Postup: 1. Enzymatické štěpení. Analýza spekter - chybějící peptidy - nadbytečné peptidy 3. MS/MS analýza neznámých (nadbytečných) peptidů a jejich srovnání s normálními proteiny/peptidy, analýza posunu píků 3. Dedukce sekvence pomocí počítače celková sekvence stanovena z kombinace sekvencí peptidu Pomocné metody při sekvenování Hydrolýza proteinu v H 18 O zjištění terminálu: C-terminál nebude označen Hydrolýza proteinu ve směsi H 18 O a H 16 O (1:1) 1. MS: dublety tryptických štěpů (vyjma fragmentů s C-koncem proteinu). MS/MS: oba dubletové píky peptidu vybrány jako prekurzor pro MS/MS; pouze štěpy obsahující C konec peptidu budou ve formě dubletu... přehlednější spektra Esterifikace (methylace) karboxylových skupin peptidu m = 14 / karboxylovou skupinu (-COOH -COOCH 3 ) porovnání spekter původního a methylovaného peptidu obdobná technika založena na derivatizaci aminoskupin peptidu Post-translační modifikace (PTM) modifikace po přenosu RNA protein uskutečněném na ribozomu nedají se objasnit na základě znalosti genomu souvisejí významně s funkcí proteinu popsáno více než 00 typů PTM (databáze Delta Mass) často pouze malá část proteinu modifikována citlivost vyžaduje selektivní izolaci peptidů s modifikovanou aminokyselinou vazba mezi peptidem a mod. skupinou často slabá Pozn. 1: výměnná reakce však může probíhat i na C terminálu Pozn. : vznikají složitější izotopové paterny s hmotnostmi M (x 16 O), M (1x 16 O,1x x 18 O) a M4 (x 18 O). Př.: využití různě dlouhé doby štěpení se značením terminálu. Zjištění terminálu: hydrolýza v H 18 O (C-terminál nebude označen) Sekvenování proteinu čas: Post-translační modifikace (PTM) Běžné PTM: fosforylace glykosylace acylace (acyly mastných kyselin, acetyl) připojení glykosylfosfatidyl inositolu produkty proteolýzy karboxylace (kyseliny glutamové) deamidace asparaginu a glutaminu Pozn.: výměnná reakce však může probíhat i na C terminálu Některé modifikace mohou být značně složité, např. oligosacharidové modifikace glykoproteinů (mnoho druhů cukrů a mnoho míst proteinu, na která se cukry mohou navazovat O, N). K objasnění slouží kombinované metody používající MS n a enzymatické štěpení (N-glykosidáza, O- glykanáza atd.). HK 73
Fosforylace reversibliní PTM související s regulačními mechanismy v buňce monoesterická vazba skupiny kyseliny fosforečné k hydroxylu v bočním řetězci O 1. serinu (167 Da). threoninu (181 Da) NH CH C 3. tyrosinu (43 Da) R MS/MS identifikace fosforylace 1. Ztráta H 3 PO 4 (neutral loss scan: 98 Da) obvykle poskytuje též iont [MH-98]. Detekce iontu PO 3- (79 Da) v negativním modu skenování výchozích látek pro m/z (produkt) = 79 Další neg. ionty: H PO 4- (97 Da), PO - (63 Da) 3. Posuny píků fragmentů v MS/MS spektrech O HO P OH O Př.: ESI MS/MS oligopeptidu s monofosforylovaným serinem y 15 y 14 y 13 y 1 y 11 y 10 y 9 y 8 y 7 y 6 y 5 y 4 y 3 y y 1 Phe Gln Pse Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys b b 3 b 4 b 5 b 6 Zdroje informací: 1. Molekulární píky MH a (M - H 3 PO 4 )H, rozdíl m = 98 ( m/z = 49). b-ionty: m/z (b 3 -b )= 167 3. y-ionty: m/z (y 14 -y 13 )= 167 (kredit: K. R. Jennings) Fosforylace Postup při identifikaci: 1. Příprava proteolytické směsi peptidů (obsahující fosfopeptidy). Oddělení fosfopeptidů např. HPLC, CE, afinitní chromatografií, např. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC), viz. Porath, J. Protein Expression Purif. 199, 3, 63. 3. MS/MS analýza fosfopeptidů Relativně stabilní monoesterická vazba posun píků v MS/MS spektrech ( m = 80 Da) aminokyselina M (zbytek) M (monoester H 3 PO 4 ) serin 87 167 threonin 107 187 tyrosin 163 43 11 Aplikace: Analýza S-S můstků. Proteiny. MS databáze. DNA, sacharidy, syntetické polymery. Př.: ESI MS/MS oligopeptidu s monofosforylovaným serinem y 15 y 14 y 13 y 1 y 11 y 10 y 9 y 8 y 7 y 6 y 5 y 4 y 3 y y 1 Phe Gln Pse Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys b b 3 b 4 b 5 b 6 x.5 100 MH - H 3 PO 4 b y y 8 y 3 y 4 y 6 MH % y 5 y 11 y 7 y 9 y 1 y y 10 1 b 3 b 5 pser y 13 y 14 b4 b 6 y 15 0 m/z 100 00 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 100 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 000 Analýza disulfidových můstků cystein (-SH) cystin (-S-S-), intra- a inter- molekulární můstky Počet cysteinů pomocí alkylace cysteinu např. alkylace jednoho cysteinu vinylpyridinem zvýší hmotnost proteinu o 105 Da počet cysteinů = m/105 Lokalizace cysteinů v proteinovém řetězci Enzymatické štěpení a rozdělení digestu na alikvoty: 1. alikvot... MS analýza. alikvot... redukce -S-S- (např. dithioerythritolem) a následná MS analýza Porovnání. spektra s 1. spektrem: 1. m = Da peptid s intramolekulární -S-S- vazbou. první pík zmizí, dva další s nižší m/z se objeví intermolekulární můstek mezi peptidy Znalost sekvence aminokyselin (MS-MS) umožní přesnou lokalizaci -S-Smůstků v proteinovém řetězci. 74
CA = carbonic anhydrase, Cy = cytochrome Valaskovic, G. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. Science 1996, 73, 1199. Vliv S-S můstků při ESI-MS Struktury lysozymu (b sheet a a helix) stabilizovány 4 S-S můstky Redukce 1,4-dithiothreitolem (DTT) odstraní S-S můstky Unfolded protein s více obnaženými bazickými rezidui aminokyselin Vyšší počet nábojů iontu Nekovalentní interakce Interakce s nízkomolekulárními ligandy (ionty kovů), jinými proteiny, oligomery atd. Není vždy jasný vztah mezi výskytem komplexu v (g) a (l) Komplexy disociují během ionizace a MS analýzy Př. 1. Komplexy hovězího hemoglobinu se stabilizují ve formě tetrameru vazbami (cross-linking) s glutaraldehydem (přemostění mezi lysylovými rezidui). Poté MALDI MS (viz obr. dále). ESI pro komplexy proteinu s ligandy (např. metaloproteiny s léky) díky šetrné ionizaci, která sotva stačí k odstranění vody. Obtížnější je výzkum interakce mezi proteiny použití měkkých extrakčních podmínek, příhodných podmínek pro tvorbu komplexů v roztoku HK Tetramer známý z roztoku Obnažení bazických reziduí aminokyselin a unfolding apomyoglobinu HK HK Příklady: nanosprej MS Vědecké databáze na internetu Uvedené databáze jsou pouze příklady, ne plný výčet. NCBI (National Center for Biotechnology Information) database Medline: www.ncbi.nlm.nih.gov Scirus: www.scirus.com ScienceDirect: www.sciencedirect.com Databáze pro organickou chemii NIST Chemistry WebBook (NIST) Spectra Online (ThermoGalactic) Spectral Data Base System, SDBS (NI AIST) 75
Vědecké databáze na internetu Internetové zdroje pro identifikaci proteinů pomocí MS metod Eidgenossische Technische Hochschule (MassSearch) www.cbrg.inf.ethz.ch European Molecular Biology Laboratory (PeptideSearch) www.mann.emblheidelberg.de Swiss Institute of Bioinformatics (ExPASy) www.expasy.ch/tools Matrix Science (Mascot) www.matrixscience.com Rockefeller University (PepFrag, ProFound) prowl.rockefeller.edu Human Genome Research Center (MOWSE) www.seqnet.dl.ac.uk University of California (MS-Tag, MS-Fit, MS-Seq) prospector.ucsf.edu Institute for Systems Biology (COMET) www.systemsbiology.org University of Washington (SEQUEST) thompson.mbt.washington.edu/sequest MS nukleových kyselin a oligonukleotidů Ionizace: obvykle vyšší výtěžek negativních iontů. Analýza typicky v negativním módu. Ionizační technika: MALDI (obvykle IR MALDI) Méně úspěšná než v případě proteinů a peptidů Vyšší stupeň fragmentace a více aduktů Důkladné odsolení prevence tvorby četných aduktů se sodíkem, větší problém než u peptidů. MALDI těžkých DNA (>100 kda): lineární přístroj, IR laser, pulsní extrakce Vědecké databáze na internetu Další odkazy: UMIST (pepmapper) wolf.bms.umist.ac.uk/mapper European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg (PeptideSearch) www.narrador.embl-heidelberg.de Scripps, ThermoFinnigan (Sequest) fields.scripps.edu/sequest/ Proteometrics (MS/MS Sonar) www.proteometrics.com Proteinové (peptidové) databáze Genpept NCBI GenBank NBRF - National Biomedical Research Foundation Swissprot - Swiss Institute of Bioinformatics Owl - Leeds Molecular Biology Database Group Delta Mass - databáze posttranslačních modifikací proteinů MALDI MS nuklevých kyselin a oligonukleotidů Typické matrice 3-hydroxypikolinová kyselina,4,6 -trihydroxyacetofenon pikolinová kyselina Typické aplikace charakterizace syntetických a biologických oligonukleotidů (stanovení m) analýza produktů PCR, analýza mutací (záměna bazí) DNA sekvenování - Sangerovo sekvenování (klasická metoda) - Sekvenování pomocí exonukleázy - Fragmentace (v plynné fázi) Další pomůcky na internetu Pomůcky MS-Comp návrh možných kombinací aminokyselin, tabulka hmot dipeptidů MS BLAST krátké sekvence (6 aminokyselin) BLAST a FASTA proteinové homology MS nuklevých kyselin a oligonukleotidů MALDI MS spektra velmi těžkých NA (> tisíce nukleotidů) správnost určení m < 1%... nejlepší ze současných metod výborná citlivost metody: < 1 fmol GlycoSuite DB, GlycoSciences - analýza sacharidů Další programy Kalkulátory hmotností (GPMaw, SHERPA, PAWS, MW Calculator) Berkenkamp, S; Kirpekar, F; Hillenkamp, F Science 1998, 81, 60-6. aj. 76
IR MALDI MS ribonukleové kyseliny Analýza sacharidů Měkké ionizační metody: MALDI, ESI. MS n pro stanovení sekvence a struktury Přídavek soli tvorba iontů kationizací, tvorba aduktů [MNa] Použití enzymů k částečnému štěpení sacharidů před MS analýzou Běžné monosacharidy: glukóza, manóza, galaktóza, fukóza, N- acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin a N-acetylneuraminová kyselina (sialic acid). Stanovení úplné struktury oligosacharidů je obtížnější než u proteinů a nukleových kyselin HK - důsledek izomerické povahy stavebních kamenů a jejich možného větvení. - k objasnění struktury nestačí jen znalost stavebních jednotek a jejich pořadí, ale též způsob větvení, poloha větve a optická konfigurace každé glykosidické vazby Sekvenování NA pomocí exonukleázy a MALDI MS Nomenklatura MS/MS oligosacharidů Nomenklatura MS fragmenty s nábojem na neredukující straně: A, B a C; fragmenty s nábojem na redukující straně X, Y a Z podle toho zda štěpí hruh nebo glykosidickou vazbu. Spodní index u fragmentů B, C, Y a Z iontů udává počet rozštěpených glycosidických vazeb, horní levý index u fragmentů A a X udává vazby, které byly rozštěpeny. Spodní indexy a, b atd. udávají štěpenou větev u větvených sacharidů. Fragmenty B, C, Y a Z spolu s rozdílem hmotností lze použít k určení sekvence a větvení. Zdroj: Juhasz, P.; Roskey, M. T.; Smirnov, I. P.; Haff, L. A.; Vestal, M. L.; Martin, S. A.; Anal. Chem. ; 1996; 68(6); 941-946 MS umožňuje určení optické izomerie glykosidické vazby. Metoda je založena na selektivní oxidaci CrO 3 b-anomeru derivatizovaných hexóz za vziku ketoesteru. Fragmentace oligonukleotidů v plynné fázi MS n oligosacharidů Schéma fragmentace oligonukleotidů v plynné fázi a značení fragmentů w 3 x 3 y 3 z 3 w w x y w 1 x 1 y 1 z 1 B 1 O B O B 3 B 4 O HO O P O O P O O P O OH Ion fragments produced upon (a) MS, (b) MS 3 and (c) MS 4 of permethylated maltoheptaose. OH OH OH a 1 b 1 c 1 d 1 a b c d a 3 b 3 c 3 d 3 Zdroj: Weiskopf, A. S.; Vouros, P. and Harvey, D. J. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1493 1504. 77
MS n characterization of the HexNAc5 Hex5 I isomer from chicken ovalbumin. (a) MS 3 m/z 1169.5 937.7, (b) MS 4 m/z 1169.5 937.7 1333.7 MS n oligosacharidů MS n oligosacharidů MS n oligosacharidů MS n oligosacharidů Lipidy Mastné kyseliny, acylglyceroly, deriváty cholesterolu, fosfolipidy a glykolipidy FAB, DCI (desorpční chemická ionizace) MALDI Negativní mód ([M-H] - ionty) Fragmentace fosfolipidový anion fragmenty sacharidů 78
Zdroj: Esser, E. et al. Polymer 000, 41, 4039 4046 Analýza syntetických polymerů Stanovení izotopových poměrů 13 C: 1 C MALDI TOFMS vysoká M max, jednoduchá spektra, počet nábojů z = 1 alternativa GPC Analýza Stavební jednotka (monomer) Koncové skupiny Absolutní molekulová hmotnost Polydisperzita (střední m, rozptyl m) Komplikace Tvorba aduktů s Na, K Hmotnostní diskriminace ionizační i detekční účinnosti = f(m) Správná transformace z časové do hmotnostní domény Příklad: Carman Jr, H.; Kilgore, D.; Eastman Chemical Company, USA, ASMS 1998 Další témata Fragmentace chemie reakcí v plynném skupenství Preparativní MS Soft landing Izotopové poměry Izotopové zředění/obohacení, kvantifikace v MS Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů Isotope-ratio mass spektrometry, IRMS přesné měření poměrů stabilních izotopů ideálně pomocí multikolektoru, tj. magnetického sektoru se současnou detekcí více m/z ionizace: EI, TI, SIMS, ICP biovzorky: obvykle plynné analyty, spaliny vzorku aj. (H, N, CO, SO ) standard pro C: Pee Dee Belemnite (PDB), vápencový fosilní belemnit, 13 C: 1 C = 0.01137 Příklady 1. radiokarbonová metoda datování, např. 14 C (b čítač, AMS urychlovací MS). určení původu biologického vzorku z izotopového poměru C (d 13 C) metabolismus rostlin: C 3 (85% rostlin: rýže, pšenice, brambory, řepa), C 4 (kukuřice, třtina), CAM (pouštní rostliny) Př.: Preparativní hmotnostní spektrometrie A. L. Yergey, A. K Yergey: Preparative Scale Mass Spectrometry: A Brief History of the Calutron J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 8, 1997, 943 953. Trocha historie: 1931 Ernest Lawrence: cyklotron urychlovač protonů na 1 MeV 1938 Otto Hahn a Fritz Strassman: štěpení atomových jader 1939 anexe Rakouska a přepadení Československa, odliv mozků do USA (Leo Szilard, Enrico Fermi, Edward Teller, Eugene Wigner). 8. 1939 dopis Alberta Einsteina Franklinu D. Rooseveltovi 1. 9. 1939 začátek. světové války a emigrace 11. 10. 1939 dopis doručen prezidentovi 1. 10. 1939 E. Fermi - grant $3 000 na průzkum interakcí pomalých n 0 s U Alfred O. Nier připravil v MS vzorky 35 U a 38 U John Dunning prokázal, že 35 U je zodpovědný za štěpení... položen teoretický základ jaderné bomby 79
1941 Projekt Manhattan - výroba atomové bomby, Oak Ridge, TN 194 E. Lawrence: možnost použití modifikovaného cyklotronu pro separaci izotopů Calutron California University at Berkeley tron (instrument) Homogenní magnetický sektor 180º Až 08 g >85% 35 U/den ve dvou stupních (přírodní zastoupení 0.7%) Celkem 43 kg/bombu během 18 měsíců z > 5 tun přírodního uranu Po r. 1945 na přípravu izotopů pro výzkumné účely Schéma. stupně 1 Otázky & konzultace 80