Kyselina hyaluronová Streptococcus equi subsp. zooepidemicus a jím produkovaná kyselina hyaluronová a glukuronidáza Marcela Tlustá Biotechnologická laborato Meyer a Palmer, 1934 Extracelulární matrix, o ní sklivec, synoviální tekutina, k Kyselina glukuronová (GlcUA) N-acetylglucosamin (GlcNAc) c) 1,3 a 1,4 Od n kolik MDa Kyselina hyaluronová Kyselina hyaluronová Nev tvená vlákna, v roztocích helikální konfigurace Velikost polymeru: kda - MDa Interakce s molekulami vody Velký hydrodynamický d objem Roztoky s vysokou viskozitou a elasticitou Vynikající mazací vlastnosti Výpl prostoru Filtra ní vlastnosti Vazba na receptory CD44, RHAMM Proliferace, lokomoce bun k, interakce s leukocyty, atd.
Kyselina hyaluronová Sklivec oka Synoviální tekutina Extracelulární matrix K P irození mikrobiální producenti: Streptococcus Pasteurela Rekombinantní mikrobiální producenti: E. coli B. subtilis L. lactis Biotechnologická produkce HA Kapsulární polysacharid SEZ Kohoutí h ebínky, sklivec oka hov zího dobytka, kloubní tekutina, pupe ní š ra Streptococcust skupina A a C Bacillus subtilis Kosmetický pr mysl Farmaceutický pr mysl Potraviná ský pr mysl Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Skupina C Nehemolytický Glukuronidáza pozitivní vysokokapsulární 3-5 g/l HA 15 1,5-2 MDa
Myšlenka Deaktivace Intracelulární glukuronidáza UDP-GlcUA substrát pro glukuronidázu UDP GlcUA substrát pro glukuronidázu UDP-GlcUA prekurzor prudukce HA Kompetice HA syntázy a glukuronidázy Deaktivace genu pro glukuronidázu Deaktivace genu pro glukuronidázu Porovnaní míry produkce Transkrip ní úrove Zastavení p episu mrna Zm nami v promotoru (delece) Transla ní úrove Zastavení syntézy proteinu Delece RBS Funk ní úrove Zm na sekvence v ORF inzerce nebo delece sekvencí v ORF Deaktivace genu glukuronidázy Na transkrip ní úrovni homologní rekombinace Delece celé promotorové oblasti Delece za átku ORF Zastavení p episu genu Bez glukuronidázové aktivity Šet ení energie Konstrukce muta ní kazety 2 homologické rekombina ní úseky P ed a za deletovanou ástí Velikost úsek p stejná Primery p stejná teplota topení Vn jší primery modifikované na 5 konci rozpoznávacím místem pro RE Jeden vnit ní modifikovaný na 5 konci reverzní formou druhého vnit ního
Konstrukce muta ní kazety Separace na elfo HRU1 HRU2 HRU1+2 Muta ní kazeta 650 bp 750 bp 1400 bp. Klonování puc19 EcoRI linearizace Defosforilace HRU1+2 extrakce z gelu Št pení EcoRI Ligace puc19 a muta ní kazety Transformace E. coli DH5 Bílomodrá selekce rekombinantních klon Sekven ní analýza plazmid
Bílo - modrá selekce Reklonování Replikovatelný v E. coli i ve S. equi subsp. zooepidemicus Podmín ná replikace (teplota 32 C) Determinanta t antibiotikové tik rezistence it E. coli RR1 Bez selekce rekombinantních klon innost identifikace klon s rekombinantním plazmidem Porovnání Blokování genu Inzercí cizorodé DNA Jednoduchá homologická rekombinace delecí úseku DNA Dvojitá homologická rekombinace Vým nou úseku DNA Dvojitá homologická rekombinace
Inzerce vs. delece Inzerce Vyšší pravd podobnost y p p Jednodušší selekce Nadbyte né sekvence Nadbyte né sekvence Delece podobnost jší selekce jší selekce Bez nadbyte ných sekvencí Muta ní plazmid Kombinovaná mutace 2 tandemové homologické rekombinace Inzerce: jedna homologická rekombinace Delece: druhá homologická rekombinace Pravd podobnost jako p i inzerci Selekce jako p i inzerci Bez nadbyte ných sekvencí jako p i deleci Teplotní zm ny 2 rekombina ní místa P ed a za deletovanou oblastí Determinanta antibiotikové rezistence Realizují se i v E. coli i v SEZ Po átek replikace Realizují se i v E. coli i v SEZ Podmín ná replikace Transformace, 29 C, selek ní tlak Inzerce 37 C C, selek ní tlak Delece 29 C, bez selek ního tlaku Lé ba 29 C, bez selek ního tlaku
Mutace PCR detekce Mutace Funk ní detekce
D kuji za pozornost T ším se na praktickou ást