VYUŢITÍ GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ROSTLIN PRO REMEDIACI KONTAMINOVANÝCH ZEMIN Martina Nováková, Martina Macková, Jan Fišer, Jáchym Šuman, Veronika Kurzawová, Tomáš Macek suram@vscht.cz Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Fakulta potravinářské a biochemické technologie Společná laboratoř VŠCHT Praha a ÚOCHB AVČR, Česká akademie věd
Použití živých organismů pro dekontaminaci životního prostředí Bioremediace je věřejností akceptována a neničí životní prostředí Pro in situ remediace a nízké koncentrace kontaminantů mikroorganismy rostliny fytoremediace
Mikroorganismy široké spektrum enzymů vyvinuto během mnoha let - organické polutanty až mineralizace - akumulace těžkých kovů Rostliny mohou akumulovat nebo metabolizovat organické nebo anorganické polutanty - organické polutanty jako lidská játra - 3 fáze: 1) aktivace molekuly (oxidace, redukce, hydrolýza) 2) konjugace (s cukry, glutathionem, aminokyselinami) 3) uložení ve vakuole nebo do buněčné stěny a ligninu - těžké kovy transport stejně jako u elementárních iontů kovů
Fytoremediace Využití zelených rostlin k akumulaci a degradaci polutantů životního prostředí Rhizoremediace Spolupráce mikroorganismů a rostlin v rhizosféře rostlin Pro zvýšení účinnosti fytoremediace Inserce nových genů do rostlinného genomu Interakce rostlina-mikroorganismus Rhizoremediace
Podle zákona je geneticky modifikovaný organismus takový organismus (kromě člověka), jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací, tj. cílenou změnou dědičného materiálu způsobem, kterého se nedosáhne přirozeně např. křížením, šlechtěním. Tato definice se vztahuje na organismy schopné rozmnoţování nebo přenosu dědičného materiálu, tj. mikroorganismy, rostliny, ţivočichy a buněčné kultury; nevztahuje se na člověka.
mikroorganismy rostliny
Modifikace specifity enzymu, regulace celých drah Geny pro přežití v biotickém a abiotickém stresu Chelátory kovů a geny pro transportéry Geny pro biodegradační enzymy Geny pro regulaci příjmu kovů Geneticky modifikované mikroorganismy Monitoring a kontrola Zvýšení bioremediace pro udržení čistoty životního prostředí Singh, 2011, v tisku
Pro degradaci polychlorovaných bifenylů, toluenu, benzenu. Pro akumulaci těžkých kovů Populární je inserce celé degradační dráhy nebo změna substrátové specifity enzymů Cl BphG Cl Cl Cl BphF BphAE NADH+H + NAD + BphB H BphC O 2 NAD + NADH+H + O2 O H 2 O C H CO http://www.daviddarling.info/encyclopedia/b/bacteria.html
Uvolňování GM mikroorganismů do životního prostředí více problémů než u GM rostlin GMM mohou uniknout, obtížný monitoring Tvorba biofilmů, multibariéry MO Tvorba sebevražedných GMM http://www.multibarrier.vito.be/multibarrier/workplan.asp
mikroorganismy rostliny
Přirozeně rostliny akumulující anorganické polutanty (těžké kovy) Thlaspi cearulescens 1800 mg Cd/kg suché biomasy, 51600 mg Zn/kg suché biomasy Thlaspi rotundifolium 8200 mg Pb/kg suché biomasy Ipomoea alpina Cu - 12300mg /kg suché biom. Nízká hmotnost biomasy
Jak vybrat správnou rostlinu? len topol tabák switch grass http://cs.wikipedia.org/wiki/soubor:tabak_p9290017.jpg http://www.enviweb.cz/zemedelstvi http://www.mahonianursery.com/grasses-sedges/heavy-metal-blue-switch-grass.html
Pro zabránění šíření kontaminace Pro fytoremediaci anorganických polutantů Pro fytoremediaci organických polutantů
Pro zabránění šíření kontaminace Sníţení mnoţství agrochemikálií - GM plodiny s d-endotoxinem nižší množství pesticidů - tabák emitující hmyzí feromon - nižší reprodukce nechtěného hmyzu nižší množství pesticidu Macek T., Kotrba P., Novakova M., Demnerova K. and Mackova M.: Novel roles for genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol 26 (3), 146-152, 2008.
Pro fytoremediaci anorganických polutantů Tolerance a akumulace těţkých kovů Pilon-Smits E. (2005) Phytoremediation, Annu. Rev. Plant Biol. 56, 15-39 MT metalothioneiny PC fytochelatiny GSH - glutathion
Pro fytoremediaci anorganických polutantů Tolerance a akumulace těţkých kovů Pilon-Smits E. (2005) Phytoremediation, Annu. Rev. Plant Biol. 56, 15-39 MT metalothioneiny PC fytochelatiny GSH - glutathion + transportní proteiny + enzymy z metabolismu
Pro fytoremediaci organických polutantů Pro oxygenaci, dechloraci, degradaci... Enzymy z bakteriálních degradačních drah savčí geny pro cytochromy. Cl BphG Cl Cl Cl BphF BphAE NADH+H + NAD + H BphB BphC O 2 NAD + NADH+H + O2 O H 2 O C H CO
tabák Nicotiana tabacum len Linum usitatissimum Pouţívané metody Transientní exprese pro studium exprese Trvalá transformace pro získání transgenní rostliny
MRGSHHHHHHTDPmnqtdtspirlrrswntseiealfdehagridpriytdedlyqleler vfarswlllghetqirkpgdyittymgedpvvvvrqkdasiavflnqcrhrgmricradagna kaftcsyhgwaydtagnlvnvpyeaesfaclnkkewsplkarvetykglifanwdenavdld tylgeakfymdhmldrteagteaipgvqkwvipcnwkfaaeqfcsdmyhagttshlsgilag lpedlemadlapptvgkqyraswgghgsgfyvgdpnlmlaimgpkvtsywtegpaseka aerlgsvergsklmvehmtvfptcsflpgintvrtwhprgpnevevwaftvvdadapddike efrrqtlrtfsaggvfeqddgenwveiqhilrghkarsrpfnaemsmdqtvdndpvypgris nnvyseeaarglyahwlrmmtspdwdalkatr Electrophoresis of plant DNA after PCR -primers bphc1/f and bphc1/r (880 bp) Electrophoresis of plant cdna after RT-PCR - primers bphc1/f and bphc2/r (880 bp)
Které geny? fytoremediace organických polutantů fytoremediace anorganických polutantů
fytoremediace organických polutantů bakteriální gen bphc (2,3-dihydroxybifenyl-1,2-dioxygenasa) Cl BphG Cl Cl Cl BphF BphAE NADH+H + NAD + H BphB BphC O 2 NAD + NADH+H + O2 O H 2 O C H CO bakteriální gen todc1c2 (terminální dioxygenasa toluen-2,3-dioxygenasy) CH 3 NAD + feredoxin reduktasa TOL feredoxintol ISP TOL + O 2 toda todb todc1c2 CH 3 H NADH + H + feredoxin reduktasa TOL feredoxin TOL ISP TOL H
fytoremediace anorganických polutantů Kvasničné geny gsh1 a gsh2 (γ-glutamylcysteinsynthetasa a glutathionsynthetasa) Akumulace těžkých kovů Akumulace těžkých kovů Kvasničný gen CUP (pro metalothionein)
protein Imunochemická detekce BphC/His izolovaného afinitní chromatografií linie H1 linie H2 linie H3 linie H4 Histochemická detekce BphC/GUS Histochemická detekce BphC/LUC
koncentrace 2,3-DHB (%) koncentrace 2,3-DHB (%) koncentrace 2,3-DHB (%) 120 Linie H WSC 38 H1 H3 mrtvé buňky 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 čas (dny) 120 Linie G WSC 38 G1 G2 G3 mrtvé buňky 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 čas (dny) 120 Linie L WSC 38 L1 L2 L3 mrtvé buňky 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 čas (dny)
koncentrace 2,3-DHB (%) úbytek 2,3-DHB [%] koncentrace 2,3-DHB (%) koncentrace 2,3-DHB (%) 120 Linie H WSC 38 H1 H3 mrtvé buňky 100 80 60 úbytek 2,3-DHB v médiu s transgenními rostlinami v porovnání s WSC 38 100 80 60 40 20 0 WSC 38 H3 G2 L1 L3 rostlinná linie 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0 120 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 čas (dny) Linie G WSC 38 G1 G2 G3 mrtvé buňky 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 čas (dny) Linie L WSC 38 L1 L2 L3 mrtvé buňky 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 čas (dny)
Bulharsko Česká republika Estonsko Finsko Nizozemí Slovensko Velká Británie Španělsko Švédsko Kypr Lucembursko Maďarsko Polsko Rakousko Řecko Malta Slovinsko
Děkuji za vaši pozornost Tato práce byla podporována granty: - MSMT 1M06030 - ME-09024-BIOAROM - MSM 6046137305 - EU grantem Minotaurus FP7 KBBE-2010-4-265946 Doporučené přednášky a postery: Ing. Šuman (přednáška) Ing. Fišer (poster) Ing. Kurzawová (poster)