Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav molekulární biologie a radiobiologie. Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav molekulární biologie a radiobiologie Funkční analýza rostlinných a bakteriálních genů kódujících klíčový enzym biosyntézy cytokininů izopentenyltransferázu Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc. Vypracovala: Pavla Surmanová Brno 2010

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Funkční analýza rostlinných a bakteriálních genů kódujících klíčový enzym biosyntézy cytokininů - izopentenyltransferázu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne... Podpis bakaláře..

Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Břetislavu Brzobohatému, CSc., vedoucímu mé bakalářské práce, dále Mgr. Janu Novákovi za odborné vedení a ochotnou pomoc při vypracování mé bakalářské práce a Mgr. Jaroslavu Pavlů za rady a pomoc při laboratorní práci.

ABSTRAKT Cílem bakalářské práce bylo seznámit se s problematikou cytokininů, jejich biosyntézy, metabolismu, transportu a signalizace v rostlinách. Cytokininy jsou fytohormony, které hrají klíčovou roli v regulaci dělení a diferenciace rostlinných buněk, ale mají také vliv na mnoho jiných fyziologických a vývojových procesů. Další část literárního přehledu je věnována chemicky indukovatelným systémům exprese rostlinných a bakteriálních genů se zaměřením na ty, které kódují bakteriální a rostlinné isopentenyltransferasy klíčové enzymy biosyntézy cytokininů. Konkrétně je pozornost věnována geneticky modifikovaným rostlinám Arabidopsis thaliana linie 11.5 s chemicky indukovatelnou expresí bakteriálního genu ipt a mutantním rostlinám pga22 s chemicky indukovatelným zvýšením exprese genu AtIPT8. Tyto rostliny byly využity v experimentální části. Experimentální část se zaměřila na prozkoumání možnosti dosažení a udržení lokalizované aktivace výše uvedených genů pouze v části listů transgenních rostlin cestou omezení aplikace induktorů pouze na tyto části. Míra dosažení pouze lokální indukce byla posouzena stanovením hladin transkriptů ipt a AtIPT8 v aktivovaných a kontrolních listech metodou kvantitativní PCR v reálném čase (qrt-pcr). Paralelně byly sledovány hladiny transkriptu genu ARR5, který slouží jako molekulární marker hladin endogenních cytokininů. Srovnání hladin transkriptů mělo být využito pro posouzení rozdílnosti míry translokace odlišných typů cytokininů syntetizovaných bakteriální a rostlinnou isopentenyltransferasou z aktivovaných do neaktivovaných listů. Klíčová slova: cytokininy, ARR5, pga22, pop/lhgr-n, AtIPT8, ipt

ABSTRACT The aim of this thesis was to become acquainted with the problems of cytokinins, their biosynthesis, metabolism, transport and signaling in plants. Cytokinins are plants hormones, which play a key role in regulation of division and differentiation of plant cells, but they also affect many other physiological and developmental processes. Another part of the literary review is devoted to chemically inducible expression systems of plant and bacterial genes, focusing on those that encode bacterial and plant isopentenyltransferase - key enzyme of cytokinin biosynthesis. Specifically, attention was devoted to genetically modified plants Arabidopsis thaliana line 11.5 with chemically inducible expression of a bacterial gene ipt and mutant plants pga22 with chemically inducible increase in AtIPT8 expression. These plants were used in the experimental work. The experimental part was focused on exploring the possibility of achieving and maintaining localized activation of the above mentioned genes only in part of rosette of transgenic plants by restricted application of inducers only in these parts. The level of local induction was assessed by determination of the level of ipt and AtIPT8 transcripts in activated and control leaves by quantative real-time polymerase chain reaction (qrt- PCR). In parallel, the transcript level of gene ARR5, which was used as molecular marker of endogenous cytokinins, was determinated. The comparision of the level of transcripts should be used for examination of diverse translocation of different types of cytokinins synthetized by bacterial and plant isopentenyltransferase from activated to nonactivated leaves. Keywords: cytokinins, ARR5, pga22, pop/lhgr-n, AtIPT8, ipt

OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK... 9 2. ÚVOD... 11 3. CÍL PRÁCE... 12 4. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 13 4.1 Arabidopsis thaliana... 13 4.2 Růstové regulátory... 13 4.3 Cytokininy... 14 4.3.1 Objev cytokininů... 14 4.3.2 Struktura cytokininů... 15 4.3.3 Funkce cytokininů... 16 4.3.4 Biosyntéza cytokininů... 18 4.3.4.1 Rostlinné IPT... 18 4.3.4.2 Bakteriální ipt... 20 4.3.5 Metabolismus cytokininů... 21 4.3.6 Transport cytokininů... 22 4.4 Dvoukomponentní systémy a cytokininová signalizace... 23 4.4.1 Dvoukomponentní systémy... 23 4.4.2 Cytokininová signalizace u Arabidopsis thaliana... 24 4.5 Chemicky indukovatelné systémy... 25 4.5.1 Transgenní linie 11.5... 25 4.5.2 Mutant pga22... 26 4.6 Kvantitativní PCR v reálném čase... 28 5. MATERIÁL A METODY... 30 5.1 Rostlinný materiál... 30 5.2 Kultivační podmínky, aktivace a sběr vzorků... 30 5.3 Izolace RNA Trizolem... 32 5.4 Měření koncentrace RNA... 32 5.5 Ošetření vzorků DNasou... 33 5.6 Reverzní transkripce... 33 5.7 qrt-pcr... 33 6. VÝSLEDKY PRÁCE... 35

6.1 Kultivace... 35 6.2 Aktivace a exprese genů v transgenní linii 11.5... 35 6.3 Aktivace a exprese genů v linii pga22... 37 7. DISKUSE... 39 8. ZÁVĚR... 42 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 43 10. SEZNAM OBRÁZKŮ... 52

1. SEZNAM ZKRATEK ADP adenosindifosfát AHK Arabidopsis histidin kinasa AHP Arabidopsis histidin obsahující fosfotransferová doména nebo protein AMP adenosinmonofosfát ARR regulátory odpovědi Arabidopsis (Arabidopsis response regulator) AtIPT1-8 Arabidopsis thaliana isopentenyltransferasy ATP adenosintrifosfát BA 6-benzyladenin CaMV 35S promotor 35S viru žluté mozaiky květáku (Cauliflower mozaic virus promoter 35S) cdna komplementární deoxyribonukleová kyselina CYP735A cytochrom P450 rodiny 735 cz cis-zeatin DTT dithiothreitol DEPC diethylpyrokarbonát DMAPP dimethylallyldifosfát DMSO dimethylsulfoxid DNA deoxyribonukleová kyselina dntp deoxyribonukleotidtrifosfát dsdna dvouřetězcová deoxyribonukleová kyselina DZ dihydrozeatin ETR1 ethylenový receptor FSB First Strand Buffer GAL4 DNA vázající transkripční faktor GFP green fluorescent protein GR glukokortikoidní receptor GR LBD ligandově vázaná doména glukokortikoidního receptoru GUS β-glukuronidasa HMBDP hydroxymethylbutenyldifosfát 9

ip isopentenyladenin iprdp isopentenyladeninribosid 5 -difosfát iprtp isopentenyladeninribosid 5 -trifosfát ipt bakteriální gen isopentenyltransferasa IPT isopentenyltransferasa LhGR-C,-N,-I chimerní transkripční faktor systému pop/lhgr LhG4 chimerní transkripční faktor systému pop/lhg4 memt meta-metoxytopolin meot orto-metoxytopolin MEP methylerithriolfosfát mt meta-topolin MVA mevalonát ot orto-topolin PCR polymerasová řetězová reakce PGA plant growth activators pop chimerní promotor pop P450 cytochrom P450 monooxygenasa qrt-pcr kvantitativní PCR v reálném čase RNA ribonukleová kyselina RPM otáčky za minutu RT reverzní transkriptasa RTP primery pro reverzní transkripci Taq pol polymerasa izolovaná z termofilní eubakterie Thermus aquaticus TCS dvoukomponentní systém T-DNA transferová deoxyribonukleová kyselina Ti-plazmid plasmid s geny pro indukci nádoru tmr bakteriální IPT gen trna transferová ribonukleová kyselina tz trans-zeatin tzs trans-zeatin syntetizující protein (IPT gen) UBQ10 ubiquitin 10 XVE fúzní transkripční faktor 10

2. ÚVOD Růst rostlin byl dříve spojován převážně s procesy výživy, ale německý botanik Julius von Sachs ve druhé polovině 19. století předpověděl existenci chemických signálů, kterými mohou jednotlivé orgány rostlin vzájemně komunikovat (Macháčková, 1998). Profesor R. Dostál (1885-1973) tuto ideu pomocí použití experimentálně morfologických přístupů výrazně rozpracoval. Později byly tyto chemické látky regulující růst a vývoj rostlin nazvány jako růstové regulátory. Cytokininy patří mezi přirozené růstové regulátory (tzv. fytohormony), což jsou látky, které si rostlina sama syntetizuje k regulaci svého růstu a vývoje (Šebánek, 2006). Spolu s auxiny jsou cytokininy uváděny jako hlavní růstové regulátory rostlin. Cytokininy patřily donedávna mezi nejméně prozkoumané hormony s ohledem na biosyntézu a signalizaci a to i přes svou rozhodující roli v růstu a vývoji rostlin. V praxi mají cytokininy významné využití v rostlinných biotechnologiích jako složky kultivačních médií, dále např. při stimulaci větvení okrasných rostlin a odnožování obilnin, prodlužování období fotosyntetické produktivity, zvyšování produkce biomasy a zlepšování odolnosti rostlin ke stresovým podmínkám. Při aplikaci na obilniny v době kvetení zvyšují cytokininy počet zrn v klasech (Macháčková, 1998). 11

3. CÍL PRÁCE Cílem mojí bakalářské práce bylo seznámit se s problematikou biosyntézy cytokininů, regulovatelných systémů exprese transgenů a kvantitativní PCR v reálném čase, dále zpracovat literární přehled funkční charakterizace genů biosyntézy a degradace cytokininů u rostlin a porovnat fenotypové a molekulární změny navozené expresí genů kódujících bakteriální a rostlinné isopentenyltransferasy. Praktická část zahrnovala sledování indukované exprese rostlinných a bakteriálních genů kódujících tyto enzymy a sledování přítomnosti takto syntetizovaných cytokininů. Práce rovněž zahrnovala nalezení vhodného způsobu kultivace a aktivace rostlin pro účely experimentu. 12

4. LITERÁRNÍ PŘEHLED 4.1 Arabidopsis thaliana Huseníček rolní (Arabidopsis thaliana) patří spolu s dalšími několika desítkami našich druhů rostlin mezi efeméry (rostliny s extrémně krátkou vegetační dobou). Huseníček rolní, čeleď brukvovitých Brassicaceae je jednou z nejvýznamnějších modelových rostlin (krátký generační cyklus, vysoký počet semen, nenáročné požadavky na pěstování a malý počet velkých chromosomů) v genetice. Je to rostlina schopná samoopylení (autogamie) a dá se snadno pěstovat v podmínkách in vitro. Pro molekulární genetiku je významné, že má jeden z nejmenších eukaryotních genomů (n ~ 125Mb) a pouhých 5 párů chromosomů (Bednář a kol., 2005). Poprvé byl huseníček k experimentálním účelům použit prof. Laibachem v Německu na počátku dvacátého století, ale teprve ve 40. letech se stal předmětem mutačních studií. Jedná se o první rostlinný druh, jehož celý genom byl osekvenován, a to koncem roku 2000. Sekvenování probíhalo od roku 1996 a podílelo se na něm 6 výzkumných týmů v Japonsku, Evropě a v USA v rámci projektu AGI (The Arabidopsis Genome Initiative). Počet v současné době identifikovaných genů A. thaliana přesahuje 25 tisíc. U A. thaliana vyskytující se volně v přírodě byl zjištěn velký počet různých mutací, které zahrnují změny v morfologii, fotosyntéze, fertilitě, v době kvetení, v metabolismu apod. (Bednář a kol., 2005). Byla sestrojena genetická mapa Arabidopsis o délce asi 520 centimorganů, přičemž 1 centimorgan představuje asi 200kb. 4.2 Růstové regulátory Jako růstové regulátory nazýváme látky, které regulují růstové a vývojové procesy u rostlin. Rozdělujeme je na látky přirozené (nativní) a syntetické. Přirozené regulátory jsou syntetizovány přímo rostlinou a slouží k regulaci jejího růstu a vývoje. Tyto regulátory lze dále rozdělit do dvou skupin: rostlinné hormony (fytohormony) a další látky s regulační aktivitou. Syntetické regulátory nejsou součástí metabolismu rostlin, ale při aplikaci na rostliny jejich růst ovlivňují, a to buď povzbudivě (stimulátory) nebo inhibičně (retardanty) (Šebánek 2006). 13

Fytohormony jsou chemické signály syntetizované ve velmi malém množství v určitých částech rostliny. Z místa vzniku jsou pak transportovány vodivými pletivy do jiných částí rostliny, kde regulačně působí na různé růstové, vývojové a pohybové procesy (Šebánek, 2006). Jsou účinné již v koncentracích 10-15 až 10-8 M (Tarkowski a kol., 2004). Za rostlinné hormony je považováno pět skupin endogenních růstových regulátorů: auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselina abscisová a etylen. Auxiny, gibereliny a cytokininy mají převážně stimulační povahu, další dvě skupiny fytohormonů působí inhibičně. Mezi další látky s regulační aktivitou, které se vyskytují v rostlinách řadíme brassinosteroidy, polyaminy, kyselinu jasmonovou, oligosacharidy a fenolické látky. Tyto látky jsou účinné pouze při vyšších koncentracích, proto nebývají řazeny mezi fytohormony (Macháčková, 1998). Na rozdíl od živočišných hormonů jsou fytohormony méně specifické, tudíž každý z fytohormonů může ovlivňovat více procesů, nebo naopak jeden proces může být ovlivněn více fytohormony. 4.3 Cytokininy 4.3.1 Objev cytokininů Cytokininy byly objeveny díky rozvoji technik tkáňových kultur (Jablonski a Skoog, 1954) a to jako látky se schopností regulovat rychlost buněčného dělení (cytokinese) a podle této schopnosti byly také pojmenovány (Miller a kol., 1956). V letech 1940 až 1950 Folke Skoog zjistil, že autoklávovaná DNA sledě má silný podpůrný účinek na buněčné dělení rostlinných pletiv. Z autoklávované DNA byl identifikován derivát adeninu, 6-furfurylaminopurin a byl nazván kinetin (Miller a kol., 1955). Ačkoliv kinetin působí jako regulátor růstu rostlin, nepatří mezi přirozeně se vyskytující rostlinné hormony. Cytokininy byly na základě testování biologické aktivity kinetinu definovány jako látky, které jsou v přítomnosti auxinu schopné stimulovat buněčné dělení (Letham, 1973). Několik let po objevení kinetinu bylo zjištěno, že extrakty z nezralého endospermu kukuřice (Zea mays) obsahují látku, která má stejné biologické účinky jako kinetin. Z obilek kukuřice byla izolována molekula trans-6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purinu, tato látka byla pojmenována zeatin (Letham, 1973). Zeatin byl objeven v mnoha rostlinách a v některých bakteriích 14

(Taiz a Zeiger, 2006). Od identifikace zeatinu bylo objeveno mnoho dalších přirozených i uměle připravených cytokininů, v dnešní době je jich známo více než 30. 4.3.2 Struktura cytokininů Cytokininy jsou deriváty adeninu nesoucí postranní řetězec na pozici N 6, tato substituce je podmínkou jejich biologické aktivity (Macháčková, 1998). Nejvyšší aktivitu mají látky, které mají jako substituent v poloze N 6 isoprenoidní řetězec s dvojnou vazbou (Kamínek, 1992). Podle typu postranního řetězce rozdělujeme cytokininy do dvou skupin: aromatické a isoprenoidní. Isoprenoidní cytokininy se v rostlinách vyskytují častěji a ve větším množství než cytokininy aromatické, patří mezi ně N6-(-2-isopentenyl)- adenin (ip), trans-zeatin (tz), cis-zeatin (cz), a dihydrozeatin (DZ) (Sakakibara, 2006). Hlavními formami cytokininů v Arabidopsis jsou cytokininy tz- a ip-, zatímco podstatné množství czbylo nalezeno v kukuřici (Veach s kol., 2003), rýži (Izumi a kol., 1988) a cizrně (Emery a kol., 1998). Obr.1 Struktura isoprenoidních cytokininů (Sakakibara, 2006) Mezi aromatické cytokininy patří ortho-topolin (ot), meta-topolin (mt), jejich methoxy deriváty (meot a memt) a benzyladenin (BA) (Strnad, 1997). Tyto cytokininy se vyskytují pouze v některých rostlinných druzích. Obr.2 Struktura aromatických cytokininů (Sakakibara, 2006) 15

Nejběžnějším cytokininem ve vyšších rostlinách je zeatin. U vyšších rostlin se vyskytuje v cis i trans konfiguracích, které mohou být vzájemně přeměněny enzymem zeatinisomerasou. DZ a ip se také běžně vyskytují u vyšších rostlin a bakterií. Cytokininy mohou být v rostlinách přítomny ve formě nukleobazí, což jsou nejaktivnější formy, nukleosidů (vazba ribósy v poloze N 9 ) a nukleotidů, nebo glykosidů (Taiz a Zeiger, 2006). Postranní řetězce isoprenoidních cytokininů jsou chemicky příbuzné s kaučukem, karotenoidními pigmenty, rostlinnými hormony gibereliny a kyselinou abscisovou. Všechny tyto látky jsou alespoň z části tvořeny z isoprenových jednotek. Cytokininy obsahují jednu isoprenovou jednotku (Taiz a Zeiger, 2006), která pochází z mevalonátové (MVA) nebo methylerythritolfosfátové (MEP) dráhy. Některé mikroorganismy produkují a vylučují značné množství cytokininů nebo mohou v rostlinných buňkách indukovat tvorbu rostlinných hormonů, včetně cytokininů (Akiyoshi a kol., 1987). Mezi cytokininy produkované mikroorganismy patří tz, ip, cz a jejich ribosidy. Při infekci rostlinných pletiv těmito mikroorganismy může být indukováno dělení pletiv (Taiz a Zeiger, 2006). Patogenní bakterie stimulující dělení buněk jsou např. Agrobacterium tumefaciens (tvorba nádorů na rostlinách), Corynebacterium fascians (růst anomálií zvaných čarovějníky) (Hamilton a Lowe, 1972), Agrobacterium rhizogenes (tvorba kořenů místo kalusových pletiv v místě infekce). 4.3.3 Funkce cytokininů Cytokininy byly objeveny jako látky podporující buněčné dělení, ale mohou stimulovat nebo inhibovat řadu dalších fyziologických, metabolických, biochemických a vývojových procesů (Taiz a Zeiger, 2006). Cytokininy hrají klíčovou roli v regulaci množení a diferenciace rostlinných buněk (Sakakibara, 2006). Dále mají vliv například na stárnutí rostliny (Gan a Amasino, 1995), mobilizaci živin (Eckardt, 2003), apikální dominanci (Dun a kol., 2006), utváření a činnost apikálních meristémů (Jung a kol., 2005), přerušení dormance pupenů (Staden a Dimalla, 1978) a klíčivost semen (Riefler a kol., 2006). Také zřejmě zprostředkovávají mnoho procesů regulovaných světlem, např. některé aspekty deetiolace jako diferenciaci chloroplastů (Chory a kol., 1994; Lochmanová a kol., 2008). 16

U geneticky modifikovaných rostlin tabáku exprimujících geny cytokininoxidasy z Arabidopsis vedla exprese těchto genů ke snížení hladiny endogenních cytokininů a následnému zpomalení vývoje nadzemní části rostliny v důsledku snížení rychlosti proliferace v apikálním meristému stonku. Toto pozorování je důkazem toho, že endogenní cytokininy regulují buněčné dělení in vivo (Werner a kol., 2001). Naopak nadměrná exprese cytokininoxidasy v těchto rostlinách vedla k rozvoji celého kořenového systému. Toto pozorování může indikovat, že cytokininy mají opačné role v regulaci buněčné proliferace v kořenových a stonkových meristémech (Taiz a Zeiger, 2006). Hladiny zeatinu dosahují nejvyšších hodnot v synchronizovaných kultivovaných buňkách rostlin na konci S fáze, mitózy a G 1 fáze. Bylo zjištěno, že diferenciace kalusového pletiva na kořeny nebo stonky závisí na poměru auxinu a cytokininu v kultivačním médiu. Vysoký poměr auxinu k cytokininu stimuluje tvorbu kořenů, naopak nízký poměr vede k formování prýtu (Skoog a Miller, 1965). Mezi další funkce cytokininů patří ovlivňování apikální dominance. Ačkoliv je apikální dominance primárně ovlivňována auxinem, cytokininy hrají významnou roli při iniciaci růstu bočních pupenů (Taiz a Zeiger, 2006). Potlačení apikální dominance, např. v důsledku odstranění apikálního meristému indukuje syntézu cytokininů, která může spustit růst axilárních pupenů (Faiss a kol., 1997). Cytokininy také zpožďují stárnutí listů. I když jejich aplikace nebrání senescenci úplně, při přímé aplikaci na neporušenou rostlinu mají výrazné účinky. Mezi cytokininy spojené s oddálením senescence patří zeatinribosid a dihydrozeatinribosid, tyto látky mohou být transportovány z kořene do listů spolu s transpiračním proudem (Noodén a kol., 1990). Pohyb živin do listů z jiných částí rostlin je také ovlivňován cytokininy. Tento proces byl objeven při radioaktivním značení živin pomocí 14 C nebo 3 H, kdy byly tyto živiny přiváděny do rostlin přes listy nebo byly části listu ošetřeny cytokininy. Tyto experimenty ukázaly, že jsou živiny transportovány přednostně do pletiv ošetřených cytokininy (Taiz a Zeiger, 2006). Transgenní rostliny exprimující bakteriální gen ipt pod kontrolou různých promotorových sekvencí vykazují pleiotropní fenotypové změny, včetně brzkého uvolnění laterálních pupenů z dormance a zpoždění listové senescence (Medford a kol., 1989). Aktivita cytokininů v mutantních rostlinách může být omezena výhradně na místo syntézy, např. nárůst axilárních stonkových meristémů při absenci dalších pleiotropních účinků hormonu (Hewelt a kol., 1994). Lokální indukce bakteriálního ipt 17

genu tetracyklinem v úžlabí listů stimuluje růst ošetřených pupenů (Wickson a Thimann, 1958). Neošetřené pupeny zůstávají inhibovány. Častější aplikace indukční látky vedla u těchto rostlin k indukci lokálních nekróz (Faiss a kol., 1997). U transgenních oddenků exprimujících ipt byl zaznamenán četný růst postranních výhonů. Existují také syntetické cytokininy, které nebyly zjištěny v rostlinách, například thidiazuron, který se komerčně používá jako defoliant a herbicid (Taiz a Zeiger, 2006). Dále bylo zjištěno, že některé molekuly mohou působit jako antagonisté cytokininů, to znamená, že mohou blokovat jejich účinek. Mezi látky s tímto účinkem patří například různé deriváty kyseliny pyrolové a pyrazolové s modifikovaným postranním řetězcem, ve kterém dochází ke zrušení dvojné vazby a navázání methylové skupiny (Macháčková, 1998). Avšak skutečný anticytokinin, který kompetuje o vazebná místa na receptoru, byl popsán teprve v práci Spíchal a kol. (2009). 4.3.4 Biosyntéza cytokininů Biosyntéza cytokininů je obecně řízena vnitřními a vnějšími faktory, mezi vnější faktory patří například neorganické dusíkaté zdroje a mezi vnitřní faktory řadíme působení dalších fytohormonů. Způsob biosyntézy cytokininů v rostlinách infikovaných Agrobacteriem tumefaciens je rozdílný od biosyntézy vyšších rostlin ve smyslu volby substrátu (Sakakibara, 2006). Na rozdíl od plně objasněné biosyntézy isoprenoidních cytokininů v rostlinách zůstává biosyntéza aromatických cytokininů prozatím nejasná. 4.3.4.1 Rostlinné IPT Prvním krokem v biosyntéze cytokininů v rostlinách je převod isopentenylové skupiny dimethylallyldifosfátu (DMAPP) na adenosinovou část molekuly. Enzym katalyzující tuto přeměnu isopentenyltransferasa (IPT) byl poprvé objeven u hlenky (Dictyostelium discoideum) (Taiz a Zeiger, 2006). IPT geny vyšších rostlin byly doposud nalezeny například u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) (Kakimoto, 2001; Takei a kol., 2001), petúnie (Petunia hybrida) (Zubko a kol., 2002) a chmele otáčivého (Humulus lupulus) (Sakano a kol., 2004). U Arabidopsis bylo identifikováno devět rozdílných IPT genů (AtIPT1 AtIPT9), které se účastní biosyntézy cytokininů 18

(Sakakibara, 2006). Z těchto devíti genů dva AtIPT2 a AtIPT9 jsou trnaisopentenyltransferasy, které využívají jako substrát místo nukleotidů molekuly trna. Rostlinné IPT geny zvyšují téměř výlučně hladiny cytokininů typu ip, které jsou narozdíl od cytokininů typu tz produkovaných bakteriálními ipt snadno transportovatelné rostlinným tělem (Zubko a kol., 2002; Faiss a kol., 1997). Isoprenoidní postranní řetězce ip a tz pocházejí převážně z MEP dráhy, zatímco velká část cis-zeatinového postranního řetězce pochází z MVA dráhy (Sakakibara, 2006). MEP dráha je lokalizována v plastidech rostlin a MVA dráha v cytosolu a endoplazmatickém retikulu. Na rozdíl od bakteriálních IPT využívají rostlinné IPT jako substrát zejména adenosintrifosfát (ATP) nebo adenosindifosfát (ADP) a dávají tak vzniku iprtp (isopentenyladeninribosid 5 -trifosfát) a iprdp (isopentenyladeninribosid 5 -difosfát) (Kakimoto, 2001). U vyšších rostlin jsou známé dva způsoby biosyntézy tz, a to ip nukleotidově závislá a ip nukleotidově nezávislá. U ip nukleotidově závislé dráhy je syntéza tz katalyzována cytochromem P450 monooxydasou. U ip nukleotidově nezávislé dráhy jsou tz nukleotidy produkovány přímo pomocí IPT a neznámého hydroxylovaného prekurzoru postranního řetězce (Ästot a kol., 2000). Dalším možným způsobem biosyntézy cytokininů je převod isoprenoidního zbytku na molekulu trna pomocí trna-ipt (např. AtIPT2, AtIPT9) spojený s následnou degradací této molekuly trna. Tato degradace je zdrojem zejména cz (Sakakibara, 2006). 19

Obr.3 Biosyntéza isoprenoidních cytokininů u Arabidopsis (Sakakibara, 2006) 4.3.4.2 Bakteriální ipt Virulentní kmeny Agrobacteria tumefaciens, bakterie způsobující rostlinné nádory, nesou dva ipt geny - tmr a tzs. tmr je kódován v oblasti T-DNA Ti-plastidu, která se začleňuje do jaderné DNA hostitelské buňky (Chilton a kol., 1977) a tzs je lokalizován ve virulentní oblasti nopalinového typu Ti plastidů, jejichž role je podporovat účinnost přenosu T-DNA. Zatímco tzs funguje uvnitř bakteriálních buněk, je tmr po infekci začleněn do hostitelského genomu a jeho produkt isopentenyltransferasa je cílena a funguje v plastidech hostitelských buněk. Ve stromatu plastidů přemosťuje biosyntézu cytokininů užitím primárně hydroxymethylbutenyldifosfátu (HMBDP), meziproduktu MEP dráhy, a adenosinmonofosfátu (AMP), čímž produkuje trans-zeatinribosidmonofosfát, který je dále přeměněn na tz. tz je takto syntetizován bez požadavku na CYP735A zprostředkovanou hydroxylaci (Sakakibara a kol., 2005). Toto přemostění umožňuje A. tumefaciens produkovat vysoké množství tz, což indukuje (ve spojení se zvýšenou biosyntézou auxinu) vznik nádorů na rostlinách. 20

Bakteriální ipt gen katalyzuje biosyntézu cytokininů v rostlinných buňkách a vyvolává fenotypové abnormality již při velmi nízkých hladinách exprese (Böhner a Gatz, 2001; Medford a kol., 1989). Tento gen primárně zvyšuje hladiny zeatinu, zeatin ribosidů a zeatin ribosid O- glukosidů, tyto formy představují netransportovatelné, nebo jen slabě transportovatelné cytokininy (Zubko a kol., 2002; Faiss a kol., Obr.4 Modifikace biosyntézy cytokininů pomocí tmr po infekci Agrobacteriem (Sakakibara, 2006) 1997). Ipt geny se nazývají fytoonkogeny, protože mohou vyvolat vznik nádorů na rostlinách. Nadměrná exprese genu ipt v různých transgenních rostlinách vyvolává v hostitelských rostlinách typické cytokininové odpovědi (Hansen a Chilton, 1999). T-DNA geny nejsou exprimovány v bakteriích, ale jsou transkribovány po včlenění do rostlinných chromozomů (Bomhoff a kol., 1976). Tyto geny pro syntézu cytokininů jsou exprimovány ve všech infikovaných buňkách a to i v buňkách, ve kterých jsou přirozené rostlinné geny pro biosyntézu hormonu obvykle potlačovány (Taiz a Zeiger, 2006). 4.3.5 Metabolismus cytokininů Metabolické přeměny cytokininů lze klasifikovat do dvou základních skupin: modifikace adeninového kruhu a modifikace na postranním řetězci (Sakakibara, 2006). Důležité metabolické kroky jsou sdíleny s purinovou metabolickou cestou (Chen, 1997). Mezi základní procesy metabolismu cytokininů patří: vzájemná přeměna bazí, nukleotidů a nukleosidů; N-glukosylace purinu a konjugace alaninu v poloze N-9; O-glukosylace a acetylace postranních řetězců; redukce dvojné vazby postranního řetězce a jeho odštěpení. Exogenně aplikované cytokininové nukleobáze jsou v rostlinných pletivech rychle metabolisovány do odpovídajících nukleotidů a nukleosidů (Singh a kol., 1988). 21

Glykosylace cytokininů byla zaznamenána na N3, N7 a N9 pozici purinové složky (N-glukosidy) a hydroxylové skupině postranního řetězce tz, DZ a cz (Oglukosidy nebo O-xylosidy) (Sakakibara, 2006). N7- a N9-glukosylace cytokininů je ireversibilní proces a vede k jejich deaktivaci. Jsou tak metabolisovány deriváty DZ, nebo cytokininy, které nesou aromatický postranní řetězec. O-glukosylace je proces vratný, deglukosylace je katalyzována enzymem β-glukosidasou (Brzobohatý a kol., 1993). O-glukosidy jsou narozdíl od N7- a N9-glukosidů biologicky aktivní a představují inaktivní, stabilně skladovatelné formy cytokininů. Další možností inaktivace je degradace cytokininů katalyzovaná cytokininoxydasou / dehydrogenasou, což je enzym, který katalyzuje odštěpení nenasyceného postranního řetězce cytokininů (Sakakibara, 2006) a to cz i tz, zeatinribosidu, ip a jejich N-glukosidů (Taiz a Zeiger, 2006). Dihydrozeatin a jeho konjugáty jsou vůči štěpení cytokininoxidasou rezistentní. Inaktivace cytokininů tímto enzymem je nevratná. Gen kódující cytokininoxidasu byl poprvé zjištěn v kukuřici (Houba-Herin a kol., 1999; Morris a kol., 1999). Obr.5 Metabolismus isoprenoidních cytokininů (Sakakibara, 2006) 4.3.6 Transport cytokininů Biosyntéza cytokininů katalyzovaná pomocí IPT je pletivově a buněčně specifická, cytokininy musí být tedy přesunuty do cílových buněk difuzí nebo selektivním transportním systémem (Sakakibara, 2006). V kultivovaných buňkách Arabidopsis probíhá transport cytokininových nukleobazí přes membrány pomocí protonově spřaženého vysoce afinitního transportního systému (Burkle a kol., 2003). Významným zdrojem syntézy volných cytokininů v rostlinách jsou kořenové apikální meristémy. Cytokininy syntetizované v kořenech se pohybují spolu s vodou a minerály přijatými přes kořeny přes xylém do nadzemní části rostlin, především 22

do listů, v nich přecházejí do floému a v případě různých metabolických přeměn mohou být transportovány do jiných orgánů (Macháčková, 1998). Kořeny ale nejsou jedinými částmi rostliny, které jsou schopné syntetizovat cytokininy. Například mladá embrya kukuřice syntetizují cytokininy, stejně jako vyvíjející se listy nebo mladé plody (Taiz a Zeiger, 2006). V xylémovém exudátu se cytokininy vyskytují hlavně ve formě zeatinribosidů. Po transportu do listů jsou některé z těchto nukleosidů převedeny na volné báze nebo na glykosidy (Noodén a Letham, 1993). Glykosidy se mohou hromadit v semenech a listech. Kultury některých pletiv pocházejících z nadzemních orgánů mají schopnost syntetizovat vlastní cytokininy a stát se nezávislými na přidání cytokininu do živné půdy. Tomuto jevu se říká habituace. U habituovaných kultur probíhá v přítomnosti auxinu dělení buněk i bez přidání cytokininů do živného média. Aktivní cytokininy mohou být syntetizovány v listech, nebo mohou být transportovány z jiných částí rostlin, například z kořenů (Letham, 1994). Podle prací Zubko a kol. (2002) a Faiss a kol. (1997) představují transportovatelnou formu cytokininů převážně cytokininy typu ip syntetizované rostlinnými IPT, zatímco bakteriální ipt syntetizují cytokininy typu tz, které mají převážně parakrinní signál. Důkazem parakrinního účinku cytokininů syntetizovaných bakteriálním ipt je fakt, že přesycení kořenů cytokininy neovlivňuje uvolnění inhibovaných laterálních pupenů z apikální dominance nebo stárnutí listů, ale tyto procesy mohou být ovlivněny lokálním zvýšením koncentrace cytokininů (Faiss a kol., 1997). Při naroubování části rostliny standardního typu na transgenní rostlinu obsahující bakteriální ipt docházelo po jeho indukci pouze k limitovanému zvýšení cytokininů blízko spoje roubu (Faiss a kol., 1997). 4.4 Dvoukomponentní systémy a cytokininová signalizace 4.4.1 Dvoukomponentní systémy Klíčovým mechanismem při vnitrobuněčném přenosu signálu je u prokaryot i eukaryot fosforylace proteinů. U prokaryot je převažujícím mechanismem signalizace tzv. dvoukomponentní systém (TCS) (Horák a Lexa, 2003), který využívá pro přenos fosfátu His a Asp. Nejjednodušší TCS je složen z histidinkinasy s konzervativní histidinkinasovou doménou a z regulátoru odpovědi s konzervativní přijímačovou 23

doménou (Stock a kol., 2000). Tyto systémy se nevyskytují u živočichů, ale kromě bakterií byly objeveny i u některých skupin eukaryotických organismů (kvasinky, houby, rostliny) (Urao a kol., 2000). U bakterií se jedná o nejčastěji využívaný mechanismus pro přenos signálů z vnějšího prostředí (Stock a kol., 1989). U A. thaliana byla v roce 1993 objevena a popsána první histidinkinasa a to ethylenový receptor ETR1, který se stal prvním dvoukomponentním proteinem objeveným u eukaryotického organismu (Chang a kol., 1993). V roce 1998 byly u A. thaliana objeveny další části TCS - proteiny AHP (HPt proteiny) a ARR (regulátory odpovědi). TCS jsou u A. thaliana zapojeny jak v ethylenové, tak v cytokininové signální dráze a účastní se i odpovědí na změny osmotických podmínek a na některé stresové faktory prostředí (Urao a kol., 2000). 4.4.2 Cytokininová signalizace u Arabidopsis thaliana Cytokininová signalizace je u A. thaliana zprostředkována hybridními histidinkinasami (AHK2, AHK3 a AHK4), které mají navíc doménu podobnou přijímačové doméně (Ueguchi a kol., 2001). Na rozdíl od jednoduchých dvoukomponentních systémů prokaryot je cytokininová signalizace zprostředkována vícestupňově a účastní se jí kromě regulátorů odpovědi i HPt proteiny (AHP). Ty fungují při přenosu fosfátu mezi His AHK (Suzuki a kol., 2001) a Asp ARR. AHP jsou lokalizovány v cytoplasmě i v jádře. U A. thaliana bylo objeveno pět AHP proteinů (Suzuki a kol., 1998). V roce 1998 byly nezávisle na sobě několika vědeckými týmy objeveny ARR. Ty byly později Imamurou a kol. (1999) podrobněji popsány a rozděleny na ARR typu A a ARR typu B. Přijímačové domény proteinů ARR typu A jsou kromě krátké variabilní inzerce uprostřed vysoce homologní a mají schopnost přijímat fosfát z AHP proteinů (Suzuki a kol., 1998) Jejich transkripce je indukována různými faktory např. cytokininy, nitráty (D Agostino a kol., 2000) a stresovými podmínkami. ARR-A jsou z části pod přímou transkripční kontrolou ARR-B (Hwang a Sheen, 2001). Po působení cytokininů dochází k velmi rychlému a vysokému zvýšení exprese ARR-A a to díky transkripční aktivaci, která není závislá na de novo syntéze proteinů, z toho vyplývá, že indukce ARR-A je součástí primární cytokininové odpovědi (Brandstatter a Kieber, 1998). Jeden z ARR typu A, ARR5, je primárně exprimován v apikálních meristémech 24

výhonků i kořenů a jeho regulace patří mezi klíčové aspekty v činnosti cytokininů (Taiz a Zeiger, 2006). Gen ARR5 kóduje transkripční represor, který zprostředkovává negativní zpětné vazby v signalizaci cytokininů. ARR-B jsou jaderně lokalizované transkripční faktory, jejichž transaktivační schopnost je regulována fosforylací přijímačové domény. Mají vysoce homologickou přijímačovou doménu, rozsáhlou variabilní C-koncovou oblast, ve které se nalézá společný B-motiv charakteristický pro všechny ARR-B. Tento motiv funguje jako DNA vazebná doména schopná sekvenčně specifické vazby na DNA (Sakai a kol., 2000). Dále se v C-koncové doméně nalézají krátké sekvence sloužící jako signály pro jadernou lokalizaci proteinu (Lohrmann, 1999). 4.5 Chemicky indukovatelné systémy 4.5.1 Transgenní linie 11.5 Transgenní linie Arabidopsis 11.5 byla odvozena ze systému pop/lhg4. Ten se skládá z chimerického promotoru pop, který obsahuje dva lac operátory a transkripčního aktivátoru LhG4, který je exprimován pod promotorem CaMV 35S. LhG4 je fúzní protein vysoce afinitního DNA-vazebného mutantního lac represoru a transkripčně aktivační doménou II GAL4 z kvasinky pivní (Sacharomycetes cerevisiae) (Šámalová a kol., 2005). pop/lhg systém byl poprvé popsán u tabáku (Moore a kol. 1998). Připojení GR domény k LhG4 transkripčnímu faktoru popsané v práci Craft a kol., 2005 a Šámalová a kol., 2005 umožnilo kontrolovat jeho aktivitu přídavkem glukokortikoidních hormonů, jako je například dexamethason (Moore a kol., 2006). Princip transkripčních systémů založených na GR doméně spočívá v tom, že v nepřítomnosti steroidního ligandu je transkripční faktor uvězněn v neaktivním komplexu prostřednictvím interakce mezi GR LBD a proteinem tepelného šoku HSP90. Navázání dexamethasonu na LBD umožňuje uvolnění proteinu HSP90 z tohoto komplexu (Picard, 1993). Ke zjištění schopnosti aktivovat expresi genu ipt byly testovány tři různé konstrukty lišící se pozicí GR domény vzhledem k DNA-vazebné a aktivační doméně LhG4 (Craft a kol., 2005). Doména GR LBD (Picard a Yamamoto, 1987) může být přítomna na karboxylovém konci (LhGR-C), amino konci (LhGR-N), nebo uvnitř (LhGR-I) mezi DNA vazebnou doménou lac represoru a Gal4 aktivační 25

doménou z LhG4. Všechny tři fúze řídí dexamethasonem indukovatelnou aktivitu reportérového genu, ale LhGR-I byla podstatně méně aktivní než LhGR-N nebo LhGR- C, zatímco LhGR-C vykazovala značnou neindukovanou aktivitu. Narozdíl od toho byla aktivita LhGR-N účinně potlačena v nepřítomnosti dexamethasonu a byla efektivně indukována v přítomnosti této látky (Craft a kol, 2005). K maximální indukci reportérového genu v LhGR-N postačil dexamethason v koncentracích 2µM, zatímco 50% z maximální aktivity β-glukuronidasy (GUS) bylo dosaženo již s 0,2µM dexamethasonem. Dexamethason ani LhGR-N nepříznivě neovlivňují vývoj semenáčků Arabidopsis, ale při použití ethanolu jako rozpouštědla pro dexamethason dochází ke snížení čerstvé hmotnosti a rychlosti vývoje rostlin, tyto účinky lze eliminovat rozpuštěním dexamethasonu v dimethylsulfoxidu (DMSO). Rostliny 11.5 se kterými jsem pracovala nesou doménu GR na N-konci. Obr.6 Schéma aktivátorových konstruktů exprimujících LhG4 nebo LhGR z promotoru CaMV 35S (Craft a kol., 2005) Obr.7 Schéma konstruktu s reportérovým genem ipt (Craft a kol., 2005) 4.5.2 Mutant pga22 Linie pga22 byla objevena jako jedna ze 40 pga (aktivátory růstu rostlin) (Zuo a kol., 2002) mutantů při monitorování genů souvisejících s tvorbou výhonů z kalusů za nepřítomnosti exogenně přidaných cytokininů. K identifikaci těchto aktivačních mutantů byla použita transformace vektorem per16 nesoucím fúzní gen XVE pod konstitutivně exprimovaným promotorem G10-90 a promotor O lexa -46. Promotor 26

O lexa -46 se skládá z 8 kopií LexA operátorových sekvencí, které byly použity jako DNA vazebné místo pro chimerický transkripční faktor XVE, jehož aktivita je podobně jako u linie 11.5 závislá na přídavku indukující látky, kterou je v tomto případě 17-β-estradiol. Při začlenění do genomu rostliny může promotor O lexa -46 aktivovat transkripci sekvencí sloučených s promotorem (Zuo a kol., 2002) a na základě této zvýšené exprese byli mutanti pga identifikováni. Později se na základě molekulárních a genetických rozborů zjistilo, že pga22 kóduje isopentenyltransferasu AtIPT8 (Sun a kol., 2003). Mutace v genomu pga22 nemají vliv na normální funkci genu, důkazem toho je fakt, že při růstu na neindukčním médiu neprojevují mutanti žádné abnormality. Ale na médiu s induktorem měly mutantní rostliny pga22 těžké morfologické abnormality: velmi krátké kořeny, bledě žluté děložní lístky, velmi řídká tvorba pravých listů a nakonec úhyn rostlin. Tento fenotyp byl pozorován při růstu v přítomnosti 17-β-estradiolu o koncentracích vyšších než 0,2 µm. U mutantních rostlin pga22 byla po indukci AtIPT8 silně indukována exprese genu ARR typu A, ARR5. Gen AtIPT8 se podílí na biosyntéze cytokininů v kořenech rostlin. Exprese tohoto genu je silně závislá na koncentraci induktoru, stejně jako na době indukce. Maximální indukce bylo dosaženo s 10 µm 17-β-estradiolem po inkubační době 12 až 24 hodin (Sun a kol., 2003). Obr.8 Schéma vektoru per16 s promotorem O LexA -46 a fúzním genem XVE 27

4.6 Kvantitativní PCR v reálném čase qrt-pcr je modifikací klasické PCR a je používána pro určení přesného množství DNA obsaženého ve vzorku. Množství specifického transkriptu lze určit jeho přepisem do cdna pomocí reverzní transkriptasy. cdna je následně použita jako templátová DNA. qrt-pcr je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce přímo během reakce pomocí fluorescenčních barviv, které detekují množství PCR produktu zvýšením své fluorescence. Její výhodou oproti konvenční PCR je možnost přesného stanovení výchozího počtu kopií cílové templátové sekvence DNA. qrt-pcr se provádí pomocí přístrojů zvaných cyklery, které umožňují jak provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu PCR. Jako fluorescenční barvivo se nejčastěji používá SYBR Green I, ten se specificky váže do malého žlábku dsdna. Po navázání na dsdna jeho fluorescence při vlnové délce 530nm výrazně vzrůstá. PCR probíhá v několika opakujících se cyklech, které se skládají ze 4 kroků. V prvním kroku dochází k denaturaci dvouřetězcové DNA při 94 o C. Další krok probíhá přibližně při 60 o C, kdy na denaturovanou templátovou DNA nasedají specifické primery pro daný gen, což jsou krátké úseky DNA (oligonukleotidy). Následující krok probíhá při 72 o C, kdy dochází k polymeraci pomocí Taq polymerasy. Taq polymerasa byla původně izolována z termofilní eubakterie Thermus aquaticus. Dnes se získává jako rekombinantní enzym z Escherichia coli. Tato polymerasa má 5 3 exonukleázovou aktivitu a průměrně zařadí 50 nukleotidů než se odpojí od templátového řetězce (Vondrejs, 2001). V posledním kroku PCR probíhá denaturace vzniklých nespecifických produktů při 80 o C a na jeho konci snímání fluorescence. 28

Obr. 9 Ukázka záznamu průběhu qrt-pcr. Množství templátové cdna v reakci je určeno podle hodnoty Ct (threshold cycle), která představuje počet cyklů, kdy amplifikační křivka překročí fluorescenční práh umístěný do exponenciální fáze reakce (tzv. threshold). Množství kopií cdna pro daný gen je stanoveno dle kalibrační přímky (koncentrační řada cdna). Relativní exprese je pak stanovena po normalizaci na referenční ( housekeepingový ) gen se stabilní expresí. 29

5. MATERIÁL A METODY 5.1 Rostlinný materiál Jako experimentální materiál byly použity transgenní rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana ekotyp Col0) linie 11.5 a mutanti pga22 (Arabidopsis thaliana ekotyp Ws). Rostliny 11.5 mají do svého genomu vnesen dexamethasonem indukovatelný systém exprese bakteriálního genu ipt, genu pro biosyntézu cytokininů. Naproti tomu rostliny pga22 nesou systém indukovatelný 17-β-estradiolem, při jehož přítomnosti dochází ke zvýšené expresi genu AtIPT8, jehož produktem je rostlinná isopentenyltransferasa. 5.2 Kultivační podmínky, aktivace a sběr vzorků Pro experiment byl vybrán hydroponický způsob kultivace. Semena rostlin Arabidopsis byla sterilizována 5 minut v 75% etanolu a poté vyseta na 0,5 ml zkumavky eppendorf obsahující Muraschige a Skoog (MS) médium (Duchefa) a 0,5% agarózu (Duchefa). U tuhého i tekutého média bylo upravováno ph na hodnotu 5,7 5,8 před autoklávovaním. Tab.1 Složení kultivačního média Tekuté médium 1 l Tuhé médium 200 ml Muraschige a Skoog medium 2,2g 0,44g agaróza - 1 g 3M KOH na úpravu ph - 3µl Zkumavky byly uloženy do krabiček na špičky (Kartell, k.č.9615) s tekutým MS médiem. Spodní část zkumavky byla ustřižena a vložena do krabičky tak, aby po naplnění krabičky tekutým médiem byly zkumavky ponořeny do média. Takovýto způsob kultivace umožňuje pohodlné přidání jakékoliv látky do média nebo výměnu celého média, aby při dlouhodobých kultivacích nedocházelo k hypoxii kořenů. Krabičky byly přikryty víčkem, aby nedocházelo ke kontaminaci média. Kultivace probíhala po dobu 6 týdnů při krátkém dni (8 hodin den/16 hodin noc, 21 o C/19 o C, 70% 30

vzdušná vlhkost, při světelné intenzitě 100 µmol * m -2 * s -1 ) v růstové komoře od firmy Weiss Gallenkamp (model komory SGC 110). Obr.10 Způsob hydroponické kultivace rostlin Arabidopsis thaliana Pro aktivaci byly použity roztoky dexamethasonu (Sigma) a 17-β-estradiolu (Sigma) a před aplikací na rostliny byly 1000x naředěny vodou na konečnou koncentraci 20µM a 10µM. Jako rozpouštědlo pro dexamethason i estradiol bylo použito DMSO (Sigma) a jako smáčedlo byl použit 0,02% tenzid Jar (EAN 5413149137059). Aktivační roztoky byly na poloviny růžic aplikovány štětečkem. Na rostliny, které byly použity jako kontroly byla aplikována pouze voda s přídavkem DMSO o koncentracích odpovídajících aktivujícím roztokům. Aktivace proběhla v 6 hodin ráno a po 12 a 24 hodinách se provedl oddělený sběr částí rostlin ošetřených indukčním roztokem a kontrolních rostlin. Každý sebraný vzorek rostlin o hmotnosti 100 mg byl namíchán ze tří různých jedinců a uchováván při -80 o C. 31

Obr.11 Způsob aktivace listových růžic rostlin Arabidopsis thaliana 5.3 Izolace RNA Trizolem Vzorky byly homogenizovány v tekutém dusíku. Po homogenizaci byl ke vzorkům o navážce 100 mg přidán 1ml Trizolu (Invitrogen), vzorky byly protřepány převrácením a nechány 5 minut při laboratorní teplotě. Poté bylo do každého vzorku napipetováno 200µl chloroformu, směs se intenzivně promíchala po dobu 15ti sekund a nechala inkubovat 3 minuty. Vzorky byly centrifugovány při 14 000 rpm 15 minut (Centrifuge 5810 R nebo Centrifuge 5417 C od firmy Eppendorf). Vodná fáze se odpipetovala do nové zkumavky a následně byla přesrážena 500µl isopropanolu a ponechána 10 minut při laboratorní teplotě. Následovala další centrifugace při 14 000 rpm po dobu 10 minut. Supernatant se odpipetoval a pelet na dně zkumavky byl promyt 70% etanolem, ten se po centrifugaci při 7000 rpm po dobu 1 minuty pečlivě odpipetoval a pelet se nechal vyschnout. Poté se rozpustil v 50µl vody ošetřené diethylpyrokarbonátem (DEPC). 2µl získané RNA byly použity na změření koncentrace. 5.4 Měření koncentrace RNA Získaná RNA byla dle potřeby naředěna 50-200x tak, aby se změřená absorbance při 260nm pohybovala v rozmezí 0,1-1. Výsledná koncentrace RNA byla vypočítána podle vzorce: c = 40 * A 260 * ředění / 1000 [µg/µl]. 32

5.5 Ošetření vzorků DNasou Ke vzorkům byla přidána DNasa s příslušným pufrem (Ambion). Vzorky se takto inkubovaly 30 minut při 37 o C, a poté byl enzym teplotně inaktivován při 65 o C po dobu 10 minut (inkubace na termobločku DRI-BLOCK DB.3 od firmy Techne). 5.6 Reverzní transkripce Do reakční směsi se napipetovalo 2,5 µg RNA (v 2,7µl), 1 µl 10 µm RTP (primery pro reverzní transkripci) (Generi Biotech) a 9 µl H 2 O. Zkumavky byly umístěny na cykler (Peltier Thermal Cycler PTC-200 od firmy MJ Research) s naprogramovaným cyklem 70 o C/10min, 4 o C/30 sec, 42 o C/50 min, 70 o C/ 15 min. Po proběhnutí první fáze programu byl cykler zastaven a byl dopipetován zbytek reakční směsi: 4 µl 5x first strand buffer (FSB), 2 µl 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 µl 10 mm směs deoxyribonukleosidtrifosfátů (dntp) a 0,3 µl reverzní transkriptasa (RT). Výsledný objem reakční směsi činil 20 µl. Poté se program opět spustil a po dokončení všech fází programu byla reakční směs 5krát naředěna. Chemikálie byly zakoupeny od firmy Invitrogen. 5.7 qrt-pcr Pro qrt-pcr byla použita komplementární DNA (cdna) připravena v předcházejícím kroku reverzní transkripcí. Každá zkumavka obsahovala následující reakční směs: 5 µl cdna 2,5 µl pufru First Strand Buffer (Top Bio) 1 µl 10 mm dntp (Invitrogen) 1 µl f primer (Generi Biotech) 1 µl r primer (Generi Biotech) 1,2 µl 10x SYBR Green I 0,7 U (µl) Taq polymerázy 1.1 (Top Bio) 12,6 µl H 2 O 33

Tab.2 Seznam použitých primerů a jejich sekvence Gen Název primeru Sekvence primeru ipt fiptrt 5 - ATC CTC CCT CAA GAA TAA GC -3 riptrt 5 - CTG AAA GGA ACG ACG C -3 ARR5 farr5 5 - GCT GAT AGA ACC AAG ACT GA -3 rarr5 5 - CTT CCA AAA TAA CAC ACC AC-3 AtIPT8 fatipt8 5 - ACT GCC AGG ACC ACG AT 3 ratipt8 5 -AAC CAC TTT TTG CT TGT ATG A 3 UBQ10 fubq10 5 -AAC GGG AAA GAC GAT TAC 3 rubq10 5 -ACA AGA TGA AGG GTG GAC 3 Tab.3 Teplotní režim PCR Krok PCR Teplota o C Čas Počáteční denaturace 94 1 min Denaturace 94 15 s Nasedání primerů 62 20 s Elongace 72 20 s Denaturace nespecifických produktů 84 15 s Závěrečná elongace 72 1 min Počet cyklů 34 PCR byla provedena na real time cykleru RotorGene6000 (GeneTiCa, Corbett Research). Každý vzorek byl stanoven ve dvou až třech replikách. Grafy reprezentují aritmetické průměry a směrodatné odchylky dvou až tří různých biologických vzorků. Statistická významnost byla vyhodnocena studentovým testem (P = 0,05). Celý experiment byl opakován jednou se stejnými výsledky. 34

6. VÝSLEDKY PRÁCE 6.1 Kultivace Jelikož je tato práce součástí většího projektu, ve kterém se kromě aktivace a sledování změn v prýtové části rostliny počítá s aktivací prýtové části a sledování změn exprese v kořenovém systému a naopak, byla jako nejvhodnější způsob kultivace vybrána hydroponie. Pro účely experimentů bylo zapotřebí vypěstovat co největší listové růžice, přičemž rostliny neměly být na přechodu do generativní fáze růstu, aby výsledky neinterferovaly s hormonálními změnami spojenými s tímto přechodem. Byly testovány dva režimy kultivace dlouhý (16h den/ 8h noc) a krátký den (8h den/ 16h noc). Režim dlouhého dne požadavkům experimentu nevyhovoval, protože se již po 4. týdnu začaly na rostlinách objevovat generativní orgány, přičemž růžice byly ještě malé. Režim krátkého dne požadavkům vyhovoval a umožňoval kultivovat rostliny bez známek přechodu do generativní fáze růstu déle než 6 týdnů, a proto byl vybrán. 6.2 Aktivace a exprese genů v transgenní linii 11.5 Poloviny listových růžic transgenní linie 11.5 byly po šesti týdnech kultivace v hydroponii aktivovány roztokem dexamethasonu o koncentraci 20µM. Vzorky byly sesbírány ve dvou časových bodech - 12 a 24 hodin po aktivaci. Pomocí qrt-pcr byla sledována exprese transgenu ipt a jako marker pro sledování změn hladiny cytokininů byla stanovena exprese genu ARR5, jako referenční gen byl zvolen gen UBQ10. Hladina transkriptu bakteriálního ipt byla zvýšena již po 12 hodinách od aktivace rostlin a to jak v aktivované, tak i v neaktivované části růžice. Hladina transkriptu však nebyla ještě díky velkému rozptylu naměřených hladin statisticky významně odlišná (P < 0,05) od příslušných potřených kontrol. Po 24 hodinách byla již hladina ipt zvýšena, v porovnání s kontrolami byla statisticky významně odlišná jak v aktivované tak i neaktivované části růžice. Hladina transkriptu ipt v neaktivované části rostliny dosahovala přibližně 80% hladiny aktivované části, přičemž nebyl mezi hladinami statisticky významný rozdíl, což naznačuje dobrou prostupnost 35

dexamethasonu pletivem rostliny. U kontrolních rostlin nebyly zaznamenány žádné rozdíly v expresi ipt mezi potřenou a nepotřenou části růžice. V porovnání s kontrolními rostlinami dosahovaly hladiny ipt u aktivovaných rostlin desetinásobné zvýšení exprese. ipt / UBQ10 Relativní poměr transkripce 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 * * 12 hod 24 hod Doba sběru Aktiv. část Neakt. část Potřená část Nepotřená část Graf 1 Relativní hladina transkriptu ipt/ubq10 u rostlin Arabidopsis thaliana transgenní linie 11.5, * označuje statisticky významně odlišné hodnoty (P<0,05) od hodnoty v potřené části Exprese markeru cytokininů ARR5 byla zvýšena již po 12 hodinách po aktivaci, ale po 24 hodinách dosahovala daleko vyšších hodnot. Hladina byla zvýšena jak v aktivované, tak i neaktivované části. Hladina transkiptu ARR5 v neaktivované části dosahovala po 24 hodinách přibližně poloviční hodnoty části aktivované. V porovnání s kontrolami dosahovala hladina ARR5 v aktivované části více než desetinásobku hladiny v kontrolních rostlinách. 36