Centrum biokatalýzy a biotransformací BIOTRANS. Centra základního výzkumu LC06010

Transkript

1 1 Centrum biokatalýzy a biotransformací BIOTRANS Centra základního výzkumu LC06010 Cíle projektu Vyvinout software (2007); Zavést techniky rekombinantní DNA (2008); Studovat ES komplexy (2009); Připravit knihovnu hydrolas (2009); Připravit knihovnu glykosidas (2009); Zorganizovat odborná a výuková setkání (2010) Doba řešení Řešitelská pracoviště Mikrobiologický ústav Akademie věd České republiky, v.v.i. - příjemce - koordinátor řešitelské pracoviště - Mikrobiologický ústav AV ČR Křen Vladimír Prof. Ing. DrSc. - řešitel koordinátor Masarykova univerzita v Brně - příjemce řešitelské pracoviště - Masarykova univerzita v Brně Damborský Jiří doc. Mgr. Ph.D. - řešitel Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích - příjemce řešitelské pracoviště - Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Kutá Smatanová Ivana Mgr. PhD. - řešitel Ústav systémové biologie a ekologie Akademie věd České republiky, v.v.i. - příjemce řešitelské pracoviště - Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR Ettrich Rüdiger RNDr. PhD. - řešitel Termín zahájení činnosti Centra Postup plnění úkolů k 31. srpnu 2008: Materiál se předkládá Radě Centra Nové Hrady

2 2 Studium bakteriální nitrilhydratasy a amidasy Zpráva 2008 MBÚ AV ČR Praha Genové manipulace u kmenů Rhodococcus erythropolis: Byly zavedeny metody používající plazmidové vektory (klonovací, expresní, integrativní a promoter-probe) u rhodokoků. Technika manipulací v chromosomu (mutace, delece, inzerce), využívající systém pozitivní selekce dvojité rekombinace a izolace modifikovaných kmenů bez vektorových sekvencí, byla ověřena delecí zkoumaných genů nha1, nhr2 z R. erythropolis A4 a R. erythropolis CCM2595. Jednoduchá rekombinace a vyštěpení úseků chromosomu sousedících s klonovanou oblastí (plasmid rescue) byla využita při izolaci a sekvenování kompletního souboru genů metabolismu aldoximů, nitrilů a amidů. Transkripční analýza genů metabolismu aldoximů, nitrilů a amidů z R. erythropolis A4: Kompletní sekvence souboru genů (9552 bp, 9 genů) kódujících enzymy a regulační proteiny podílející se na konverzi aldoximů, nitrilů a amidů nhr4, oxd, nhr2, nhr1, ami, nha1, nha2, nhr3, orfb z Rhodococcus erythropolis A4 byla uložena v databázi GenBank (Acc. No. AM946017). RNA hybridizace s využitím specifických sond pro jednotlivé geny neprokázala velký společný transkript těchto genů (všechny jsou přepisovány v témže směru), ale kratší transkripty pokrývající 1 až 4 geny. Gen pro amidasu (ami) je přepisován samostatně (transkript 1,6 kb), dále společně s geny pro podjednotky nitrilhydratasy nha1, nha2 (transkript 3 kb) a do společného transkriptu genů ami, nha1, nha2 a nhr3 (5 kb). Geny nha1 a nha2 jsou také přepisovány do kratšího společného transkriptu (1,5 kb). Transkripční profil tohoto souboru genů je tedy komplexní, soubor genů obsahuje interní promotory a terminátory. Vznik kratších transkriptů lze vysvětlit terminací transkripce nebo specifickou degradací delších transkriptů. Ve všech případech byly intenzity signálů při použití RNA izolované z indukovaných a neindukovaných kultur srovnatelné. Expresní systém pro bakteriální amidasu: Gen kódující amidasu z R. erythropolis A4 byl klonován v expresních vektorech pext20 (replikujících se v Escherichia coli) a pfex16 (replikujících se v R. erythropolis). Aktivita enzymu produkovaného buňkami E. coli po indukci exprese potvrdila, že pro expresi genu pro amidasu v heterologním systému není potřeba přítomnost dalšího genu (např. aktivátoru). Biokatalytické aplikace: Enzymy byly využity k dvoukrokové přípravě řady alifatických a aromatických hydroxamátů z nitrilů (1. krok: enzymová hydratace nitrilu nitrilhydratasou, 2. krok: transacylace amidasou v přítomnosti hydroxylaminu). Výhodou tohoto postupu je použití snadno dostupných výchozích látek (nitrilů) bez izolace meziproduktu (amidu). Ke katalýze obou reakcí byl využit buněčný extrakt z Rhodococcus erythropolis. Amidasová aktivita byla v prvním kroku inhibována síranem amonným, aby se zabránilo vzniku vedlejšího produktu (karboxylové kyseliny). Alternativně byly použity rekombinantní nitrilhydratasy postrádající amidasovou aktivitu. Studium nitrilas z vláknitých hub Screening nitrilas: Selekcí na mediu s 3-kyanopyridinem bylo z různých vzorků z životního prostředí získáno asi 20 nových isolátů vláknitých hub hydrolyzujících nitrily. Nejlepším induktorem nitrilasy byl u všech kmenů 2-kyanopyridin. To potvrzuje náš dřívější předpoklad, že hyperindukce nitrilas touto látkou má u vláknitých hub obecnou platnost. Heterologní exprese nitrilas: Z celkové RNA extrahované z mycelia kmene Aspergillus niger K10 produkujího nitrilasu byla připravena cdna a použita pro amplifikaci genu pro nitrilasu. Primery byly navrženy podle hypotetického genu pro nitrilasu z Aspergillus fumigatus. Gen

3 pro nitrilasu z A. niger K10 byl sekvenován a ligován do vektorů pet-30(+) and prset B. Z 9 testovaných kmenů byla nejvyšší celková aktivita enzymu dosažena u E. coli BL21 Gold. Studium substrátové specificity, stereo- a diastereoselektivity nitrilas: Ve spolupráci s TU Graz jsme použili pro testování substrátové specifity nitrilas z A. niger K10 a Fusarium solani O1 soubor 15 karbocyklických aminotrilů a nearomatických heterocyklických nitrilů (derivátů pyrrolidinu a piperidinu). Oba enzymy byly schopny hydrolyzovat většinu těchto substrátů. Racemické nitrily byly zpravidla transformovány s nízkou enantioselektivitou (E < 7). Naopak se tyto enzymy ukázaly jako vhodné pro rozlišení cis- a trans-isomerů karbocyklických nitrilů. 3 Imobilizace enzymů Nitrilhydratasa a amidasa z R. erythropolis A4 a nitrilasa z F. solani O1 byly imobilizovány ve formě zesítěných proteinových agregátů a použity pro dvoustupňovou konverzi 4- kyanopyridinu na kyselinu isonikotinovou v sériově zapojených reaktorech s ultrafiltrační membránou. V prvním stupni probíhala konverze substrátu nitrilasou na produkt o složení kyselina isonikotinová : isonikotinamid, 98:2; ve druhém stupni hydrolýza isonikotinamidu na kyselinu isonikotinovou, takže výsledný produkt obsahoval více než 99.9 % žádané kyseliny. Výhodou imobilizovaných enzymů je zvýšení jejich operační stability. Vývoj rychlých metod pro stanovení enzymů transformujících nitrily Pro rychlé stanovení nitrilas a nitrilhydratas byly vyvinuty metody založené na rozdílných absorpčních spektrech aromatických substrátů a produktů v UV oblasti (pro celkem 16 látek (benzonitril, 3-hydroxybenzonitril, 3-tolunitril, 4-kyanopyridin atd.). Tyto metody se osvědčily také pro kontinuální měření a použití v mikrotitračních destičkách. Jako alternativní spektrofometrická metoda pro stanovení aktivity nitrilhydratas byla použita výše popsaná bienzymatická metoda založená na hydrataci nitrilu na amid a následném přenosu acylu z amidu na hydroxylamin za vzniku hydroxamátu, který tvoří se železitými ionty barevné produkty. Při enzymové hydrolýze nitrilů vznikají karboxyláty a protony, které však způsobují jen malou změnu ph pro pufrovací kapacitu dalšího produktu reakce amoniaku. Nicméně jsou pro detekci této změny ph vhodné některé indikátory (bromthymolová modř, fenolová červeň, neutrální červeň, thymolová modř). Použitelnost těchto metod je však omezená, protože jsou velmi citlivé na složení reakční směsi. Pro přesnější stanovení těchto enzymů se jeví jako nezbytné HPLC metody, které lze významně zrychlit použitím monolitických kolon. V případě řady aromatických a heterocycklických substrátů a produktů jsme nalezli vhodné podmínky pro tento typ analýzy, u níž se retenční časy analytů pohybují maximálně kolem 5 min. Studium glykosidas Nově izolované geny pro glykosidasy byly klonovány a sekvenovány a především sekvence α-galaktosaminidasy a α-galaktosidasy z A. niger poslouží pro srovnání evolučních závislostí a též určení kritických míst pro vývoj jednotlivých aktivit. β-n- Acetylhexosaminidasa z Talaromyces flavus byla podrobena proteomické analýze a dále bude testována s modifikovanými substráty (6-aldehyd a 6-sulfát) pro využití v syntéze imunoaktivních glykomimetik. Zásadním poznatkem je, že některé hexosaminidasy jsou schopné akceptovat značně modifikované substráty - kromě již prokázaných aldehydu a kyseliny na C-6, ještě též sulfát a dále 4-deoxy a 4,5- substráty. Tyto poznatky byly predikovány pomocí molekulárního modelování na modelu hexosaminidasy z A. oryzae (R.

4 Ettrich, N. Kulik). Všechny modifikované substráty (kromě sulfátů) byly připraveny na našem pracovišti původními postupy. Sulfáty hexosaminů byly připraveny ve spolupráci s dr. S. Williamsem (Austrálie). α-galaktosaminidasa, která byla purifikována v předchozí části projektu byla využita k syntetickým reakcím, založeným na enzymově katalyzované kondenzaci N- acetylgalaktosaminu za vzniku α-n-acetylgalaktosaminidů (oligosacharidy a glykokonjugáty aminokyselin). Byla připravena serie nových glykokonjugátů, které byly spektrálně charakterizovány, v současnosti se připravuje publikace. Na tematu bude v r. 08/09 řešena diplomová práce (K. Michálková). Biotransformace flavonoidů Byla studována oxidativní biotransformace silybinu pomocí monooxygenas a peroxidas, za účelem popisu mechanismu antioxidativní aktivity těchto látek. Dále byla studována enzymová hydrolýza glykosidů flavonoidů pro získání některých biologicky aktivních a komerčně zajímavých glykosidů (např. štěpení rutinu na isoquercitrin). Enzymová příprava isoquercitrinu byla optimalizována a rozpracována ve čtvrtprovozním měřítku (30 l). Pro tyto objemy byly vyvinuty fermentační procedury přípravy enzymu a též separační a purifikační procedury. V současnosti se jedná o komercionalizaci s tuzemskými a zahraničními partnery a připravuje se patentová přihláška. 4 Personální zajištění a vědecká výchova V r nadále pracují na 100% pracovní úvazek v Centru LC06010 Ing. Monika Knoppová, Ing. Ondřej Kaplan a Ing. David Kubáč (všichni PGS studenti). Od 1. ledna byla přijata RNDr. Pavla Bojarová, PhD (biochemik) na 100 % úvazek po odchodu Mgr. Dany Manglové, dále na projektu pracuje na 100 % úvazek Ing. Petr Marhol specialista na analytickou chemii a separační metody. Doktorandi: Kristýna Slámová (PGS - VŠCHT), Mgr. Vojtěch Vejvoda (PGS-UK), Olga Volkova (PGS-UK). Diplomanti a pregraduální studenti: Anna Drozdová (UK), Kateřina Purchartová (UK), Hilda Kroupová (UK), Klára Michálková (VŠCHT), Pavla Minksová (VŠCHT), Barbora Štěpánková (VŠCHT), Alena Petříčková (UK), Alžběta Davidová (VŠCHT), Michaela Novotná (VŠCHT), Matěj Rázga (VŠCHT), Ondřej Šveda (UK), a v rámci projektu Otevřená věda studentky střední školy Anna Rinágelová a Zuzana Karásková. Zuzana Karásková obdržela za práci vypracovanou na našem pracovišti Cenu Učené společnosti pro středoškolské studenty. Na řešení úkolů Centra se podílejí též další pracovníci Laboratoře biotransformací Ing. Bronislava Uhnáková PhD, Ing. Lenka Weignerová, PhD a Ing. Anna Malandra (absolventka Univ. L Aquila, It.), Ing. Karel Křenek, Dr. Radek Gažák. V rámci tématik řešených v Centru byla v MBÚ v r obhájena diplomová práce Jan Kadlček Modifikované substráty glykosidas (VŠCHT) (školitelka L. Weignerová). Rozvoj mezinárodních spoluprací: Evropské projekty Laboratoř působila jako spolukoordinátor nově připraveného EU projektu COST CM 0701 Multistep/cascade chemoenzymatic synthesis new synergies in biocatalysis, zahrnujícího 20 laboratoří z Evropy. Tento projekt byl udělen ESF, v dubnu 2008 proběhla ustavující

5 schůzka v Bruselu. Naše skupina působí jako kordinátor dvou pracovních skupin (ze čtyř), a to WG1 Exploiting oxidoreductases for the selective modification of bioactive natural compounds with multienzymatic protocols (koordinátor V. Křen) a pracovní skupiny WG3 - Cascade reactions at the nitrile group, (koordinátor L. Martínková WG3), která navazuje na pracovní skupinu s podobnou tématikou, která byla součástí akce D25. Spolupráce s některými partnery účastnícími se obou akcí (TU Graz, Univ. L Aquila) kontinuálně pokračovala. V září 2008 se zástupci MBÚ zúčastní zahajovací schůze pracovních skupin akce CM0701 (Como, IT). Dále naše laboratoř pokračuje v práci na EU COST CM0602 projektu Inhibitors of angiogenesis: design, synthesis and biological exploitation Angiokem ( ); a na COST projektu D34 Molecular Targeting and Drug Design in Neurological and Bacterial Diseases Bilaterální projekty Pokračuje 2. rok bilaterální projekt s Itálií (CNR Milano) Enzymatic multistep modification of biologically active natural compounds návštěvy (Daniela Monti, Amedeo Prandelli). V závěru roku 2007 byl úspěšně ukončen dvouletý projekt AV ČR DAAD (D10-CZ25/06-07) s Univ. Hohenheim (Prof. L. Fischerem). Byly publikovány dva společné články (viz publikace) a připravuje se další článek (téma: Příprava hydroxamátů z nitrilů). Zahraniční hosté na pracovišti navštívil naše pracoviště Dr. Spencer J. Williams ze School of Chemistry and Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute University of Melbourne, Australia, přednesl přednášku na téma New drugs for the treatment of cardiovascular disease: Drawing inspiration from Nature Dále navštívil LB Prof. Michihiko Kobayashi (The University of Tsukuba, Jap.) součástí programu návštěvy byla jeho přednáška Microbial nitrile metabolism: from biochemical and genetic studies to industrial application. V rámci projektu LLP Erasmus je na studijním pobytu v LB postgraduální studentka University L Aquila (IT) Ing. Anna Malandra (program: studium nitrilas z vláknitých hub). Na podzim jsou plánovány další stáže zahraničních studentů ze spolupracujích laboratoratoří na našem pracovišti (každá cca 1 měsíc) Dr. Anabella Tramice (Univ. Neapoli, I) Claudia Rech (Univ. Aachen, D) Amedeo Prandelli (CNR Milano, I) Katarina Schmidt (Univ. Aachen, D) Stáže našich pracovníků v zahraničí: K. Slámová: Summer Course Glycosciences, Wageningen (NL), R. Gažák Université J. Fourier, Départemenet de Chimie Moléculaire, Grenoble (F), Stav financí: investiční prostředky nebyly pro letošní rok přiděleny mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem neinvestiční prostředky jsou čerpány minimálně z 90% v souladu s návrhem

6 Plán prací pro rok 2009: Kmeny exprimující enzymy nitrilového operonu z Rhodococcus erythropolis (homologní a heterologní producenty) budeme studovat z hlediska jejich možných aplikací ve formě celobuněčných katalyzátorů a porovnáme dostupnost purifikovaných enzymů z těchto kmenů a ze zdrojového kmene. Bude pokračovat také studium nitrilas z vláknitých hub a zaměří se hlavně na tyto oblasti: heterologní expresi nitrilas v E. coli nebo v Pichia pastoris pokus o zvýšení produkce enzymu, charakterizaci enzymu produkovaného v heterologních hostitelích, sledování operační stability enzymů. Bude pokračovat studium glykosidas, a to konkrétně hexosaminidasy z T. flavus (sekvenace, heterologní exprese), dále studium modifikovaných substrátů pro hexosaminidasy a to s cílem i) objasnit reakční mechanismy, ii) vyvinout nové metody syntetických reakcí a iii) připravit strategii pro cílenou mutagenezi aktivního centra. Budou pokračovat práce na biotransformacích bioflavonoidů, a to další optimalizace a scaleup reakce. Budou vyvíjeny enzymové metody pro chirální diskriminaci silybinu a jeho derivátů. Změny ve složení řešitelského týmu: V r nedošlo k neplánovaným změnám v řešitelském týmu. Publikace: 1. Kubáč D., Kaplan O., Elišáková V., Pátek M., Vejvoda V., Slámová K., Tóthová A., Lemaire M., Gallienne E., Lutz-Wahl S., Fischer L., Kuzma M., Pelantová H., van Pelt S., Bolte J., Křen V., Martínková L.: Biotransformation of nitriles to amides using soluble and immobilized nitrile hydratase from Rhodococcus erythropolis A4. J. Mol. Catal. B: Enzymatic 50, (2008) IF = 1, Vejvoda V., Kaplan O., Bezouška K., Pompach P., Šulc M., Cantarella M., Benada O., Uhnáková B., Rinágelová A., Lutz-Wahl S., Fischer L., Křen V., Martínková L.: Purification and characterization of a nitrilase from Fusarium solani O1. J. Mol. Catal. B: Enzymatic 50, (2008) IF = 1, Martínková L., Vejvoda V., Křen V. Selection and screening for enzymes of nitrile metabolism (a review). J. Biotechnol. 133, (2008). IF = 2, Winkler M., Kaplan O., Vejvoda V., Klempier N., Martínková L. Biocatalytic application of nitrilases from Fusarium solani O1. and Aspergillus niger K10, J. Mol. Catal. B: Enzymatic v tisku (2008), doi: /j.molcatb IF = 1, Martínková L., Uhnáková B., Pátek M., Nešvera J., Křen V. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus. Environ. Int. (2008), v tisku IF = 2, R. Gažák, P. Sedmera, M. Marzorati, S. Riva, V. Křen: Laccase-mediated dimerization of the flavonolignan silybin. J. Mol. Catal./B Enzymatic 50, (2008). IF = 1, P. Bojarová, K. Křenek, M. Kuzma, L. Petrásková, K. Bezouška, D.-J. Namdjou, L. Elling, V. Křen: N-Acetylhexosamine triad in one molecule: Chemoenzymatic introduction of 2-acetamido-2-deoxy-β-D-galactopyranosyluronic acid residue into a complex oligosaccharide. J. Mol. Catal./B Enzymatic. 50, (2008). IF = 1, B. Sauerzapfe, D.-J. Namdjou, T. Schumacher, N. Linden, K. Křenek, V. Křen, L. Elling: Characterization of recombinant fusion constructs of human β1,4- galactosyltransferase 1 and the lipase pre-propeptide from Staphylococcus hyicus. J. Mol. Catal./B Enzymatic. 50, (2008). IF = 1,973 6

7 9. E. Attolino, F. Bonaccorsi, G. Catelani, F.a D'Andrea, K. Křenek, Karel Bezouška, V. Křen: Improved Preparation of β-d-mannac-(1 4)-D-Glc and β-d-tallnac- (1 4)-D-GLC Disaccharides and Evaluation of their Activating Properties on the Natural Killer Cells NKR-P1 and CD69 Receptors. J. Carb. Chem. 27, (2008). IF = 0, L. Weignerová, T. Filipi, D. Manglová, V. Křen: Induction, purification and characterization of a α-n-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79, (2008). IF = 2, L. Weignerová, P. Simerská, V. Křen: α-galactosidases and their applications in biotransformations. Biocat. Biotrans. in press IF = 0, B. Sauerzapfe, K. Křenek, J. Schmiedel, W. W. Wakarchuk, H. Pelantová, V. Křen, L. Elling: Chemo-enzymatic synthesis of poly-n-acetyllactosamine (poly-lacnac) structures and their characterization for galectin-mediated binding of ECM glycoproteins to biomaterial surfaces. Glycoconjugate J. in press IF = 1, V. Křen, T. Řezanka: Sweet antibiotics the role of glycosidic residues in antibiotic and antitumor activity and their randomization. FEMS Microbiol. Reviews 32(5), (2008). IF = 9,250 Kapitoly v knize: 1. Martínková L., Kaplan O., Vejvoda V., Bezouška K., Cantarella M., Křen V. (2008) Nitrilases from filamentous fungi. In (Anthonsen T., Fessner W.-D., eds) Modern Biocatalysis. Wiley-VCH, v tisku. 2. Cantarella M., Gallifuoco A., Spera A., Cantarella L., Kaplan O., Martínková L. UF- Membrane bioreactors for kinetics characterization of nitrile hydratase-amidase catalyzed reactions: a short survey. V (Anthonsen T., Fessner W.-D., ed.) Modern Biotechnology, Wiley-VCH, v tisku. Přednášky a postery: i. Vejvoda V., Martínková L., Kaplan O., Křen V.: Nitrilases in filamentous fungi. Kick-off Meeting COST CASCAT, Como (IT), (přednáška). ii. Křen V., Slámová K., Gažák R., Křenek K., Bojarová P.: Enzymatic synthesis of immunoactive oligosaccharides containing N-acetyl-β-D-galactosaminiduronates: Three enzymes in play, 11th Japanese Symposium of the Chemistry on Biocatalysis, Tottori University (Japan), iii. Křen V.: Silybin and silymarin in cancer prevention... and treatment?, University Osaka (Japan). iv. Křen V.: Silybin in cancer treatment, University Okayama (Japan). v. Martínková L., Křen V.: Sekvenční a integrované chemoenzymové reakce - nové trendy v aplikaci biokatalýzy. XXI. Biochemický sjezd České Budějovice (přednáška). vi. Slámová K., Bojarová P., Gažák R., Macková M., Křen V.: β-n- Acetylhexosaminidase from Talaromyces flavus: Characterization and application with unnatural substrates, XII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno (ČR), Book of abstracts p. 94. vii. Bojarová P., Křen V.: Modified substrates in enzymatic glycosylations: a simple route to complex saccharides, BioTech 2008 and the 4 th Swiss-Czech Symposium, Wadenswil (Switzerland), Book of abstracts p. 28. (invited plenary lecture) 7

8 viii. Slámová K., Bojarová P., Křenek K., Gažák R., Bezouška K., Williams S.J., Macková M., Křen V.: Unnatural substrates of β-n-acetylhexosaminidases: synthesis of new immunoactive glycosides, Summer Course Glycosciences, Wageningen (Holandsko), Book of abstracts p. 59 ix. Křen V., Gažák R., Sedmera P.: Laccase-mediated dimerization of the flavonolignan silybin: Use of oxidases for the study of antioxidant mechanisms, 4 th European meeting on Oxizymes, Helsinki (Finland), (poster - 1. prize for poster) x. Bojarová P., Křenek K., Slámová K., Bezouška K., Elling L., Riva S., Křen V.: Laccase and galactose oxidase an elegant way to glycomimetics, 4 th European Meeting in Oxizymes, Helsinki (Finland), Book of abstracts p. 29, oral presentation No. O6.2. xi. Křen V., Gažák R., Slámová K., Bojarová P., Křenek K., Ettrich R.: Substrate Engineering for β-n-acetylhexosaminidase: Ways to Enzymatic Synthesis of Glycomimetics, XI Italian Conference-School on Carbohydrate Chemistry, RL-5, Certosa dipontignano, Siena (IT), (invited lecture) xii. Bojarová P., Slámová K., Křenek K., Gažák R., Bezouška K., Williams S. J., Křen V.: N-Acetylglucosaminides with Negative Charge at C-6: Strong Ligands of Natural Killer Cells, 24 th International Carbohydrate Symposium, Oslo (Norway), Poster No. C-P039. xiii. Křen V., Gažák R., Slámová K., Bojarová P., Křenek K., Ettrich R.: Substrate Engineering for β-n-acetylhexosaminidase: Ways to Enzymatic Synthesis of Glycomimetics, C-O th International Carbohydrate Symposium, Oslo (Norway), (oral communication) xiv. Kaplan O., Martínková L., Kavan D., Bezouška K., Vejvoda V., Plíhal O., Pompach P., Benada O:, Šveda O., Vaněk O., Kumar V., Křen V.: Heterologous expression of a nitrilase from Aspergillus niger K10. 4th International Congress on Biocatalysis, Hamburg (DE) (poster). xv. Malandra A., Uhnáková B., Vejvoda V., Kaplan O., Kubáč D., Cantarella M., Martínková L.: Operational stability of fungal nitrilases in a continuous ultrafiltration membrane reactor. 4th International Congress on Biocatalysis, Hamburg (DE) (poster). xvi. Vejvoda V., Rinágelová A., Křen V. Martínková L.: High throughput methods for nitrilase, nitrile hydratase and amidase screening. 4th International Congress on Biocatalysis, Hamburg (DE) (poster). xvii. Davidová A., Kubáč D., Vejvoda V., Martínková L.: Purifikace nitrilas vláknitými houbami Fusarium solani a Penicillium multicolor. XXI. Biochemický sjezd České Budějovice (poster). xviii. Vejvoda V., Šveda O., Rinágelová A., Křen V. Martínková L.: Nové metody pro stanovení aktivity nitrilas. XXI. Biochemický sjezd České Budějovice (poster). xix. Kaplan O., Martínková L., Kavan D., Bezouška K., Vejvoda V., Plíhal O., Pompach P., Vaněk O., Kumar V.: Heterologní exprese nitrilasy z Aspergillus niger K10. XXI. Biochemický sjezd České Budějovice (poster). xx. Slámová K., Bojarová P., Křenek K., Gažák R., Bezouška K., Williams S.J., Macková M., Křen V.: Nepřirozené substráty β-n-acetylhexosaminidas: Syntéza nových imunoaktivních glykosidů, XXI. Biochemický sjezd ČSBMB, České Budějovice (ČR),

9 9 Deponované sekvence: Rhodococcus erythropolis strain A4, aldoxime dehydratase, amidase and nitrile hydratase gene cluster (nhr4, oxd, nhr2, nhr1, ami, nha1, nha2, nhr3, ORFb) bp. GenBank Acc. Number AM Aspergillus niger nitrilase, 1068 bp.genbank Acc. Number ABX75546.

10 10 Zpráva 2008 společné pracoviště ÚSBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady Postup plnění úkolů 2008: Předmětem výzkumné činnosti oddělení struktury a funkce proteinů, společné laboratoře Ústavu systémové biologie a ekologie Akademie věd ČR, v.v.i. a Ústavu fyzikální biologie Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích se sídlem v Nových Hradech, je vývoj a aplikace výpočetních metod, metod pro sledování změn v kvarterní struktuře ovlivňující enzymovou aktivitu. Adaptace metod molekulární dynamiky a počítačového dokování pro předpověď katalytické aktivity enzymů. Vývoj a zavedení nových nestandardních a pokročilých krystalizačních metod pro získání difraktujících krystalů enzymů používaných v Centru. S tímto cílem jsou spojeny molekulárně biologické, biochemické a biomolekulární postupy vedoucí k získání definovaných a čistých vzorků proteinů vhodných pro krystalogenezi. V průběhu roku 2008 byly dokončeny krystalizační experimenty tří mutantů DhaA04, DhaA14 a DhaA15 haloalkandehalogenasy DhaA z Rhodococcus rhodochrous NCIMB Difrakční data ze všech tří krystalů byla naměřena na synchrotronu EMBL/DESY v Hamburku do ultra-vysokého rozlišení Ǻ pro DhaA04, 0.95 Å pro DhaA14 a 1.15 Å pro DhaA15. Z naměřených difrakčních dat byly následně vyřešeny struktury mutantů s vysokou přesností s popisem substrátů vázaných v aktivním místě. Krystalové struktury se staly základem pro další především biochemické a modelovací studie s cílem pokusit se o popis nové funkce haloalkandehalogenas. Pokračovalo se v krystalizaci membránového proteinu core komplexu fotosystému II izolovaného z Pisum sativum s cílem připravit difraktující krystaly. Bylo zjištěno, že krystaly uvedeného komplexu je možné připravit pomocí různých krystalizačních technik, pouze krystaly připraveny pomocí pokročilé krystalizační techniky známé jako counter-diffusion technique, vyvinuté jedním ze španělských kolegů ze spolupracujícího týmu z Univerzity v Granadě (Španělsko), jsou schopny difraktovat. Naměřená difrakční data není možné použít k vyřešení struktury, proto jsme se nyní zaměřili na vylepšení purifikační strategie. Byla dořešena struktura HsdR podjednotky bakteriálního restrikčního enzymu EcoR124I z E.coli a z ní odvozen předpokládaný mechanismus působení tohoto enzymu. Pomocí kombinace počítačového modelování a analýzy krystalové struktury bylo možné detailně popsat fungování celého restrikčního-modifikačního systému a dále navrhnout všeobecný mechanismus translokace DNA dvoušroubovice u RecA-like helikas. Pochopení uvedeného mechanizmu se může stát základem pro budoucí generace antibiotik resp. jejich alternativ jako bakteriofágní terapie nebo jiných látek ovlivňujících resp. regulujících životní cyklus bakterií. Byly vykrystalizovány nové haloalkandehalogenasy DbeA a DbeAloop. Krystaly jsou připraveny k difrakčním měřením. Bylo dokončeno studium apo a holo forem proteinu WrbA. Struktury nyní slouží k modelovacím studiím. Byly zahájeny krystalizační experimenty uvedeného enzymu s různými substráty. Byly připraveny nové druhy enzymů rekombinantních proteinů RhsA, RhsB a Lhr, které se mohou podílet na mobilitě DNA fragmentu nesoucího geny pro restrikčně modifikační systém E.coli K12. Krystalizační experimenty methyltransferasy EcoR124I, proteinů RhsA, RhsB a Lhr budou zahájeny v listopadu Enzymy budou krystalizovány pomocí standardních, pokročilých a také pomocí alternativních krystalizačních metod vyvíjených v naší laboratoři. Firma Triana Sci&Tech (Granada, Španělsko), zabývající se výzkumem pokročilých krystalizačních technik, jež je známa po celém světě, projevila zájem

11 spolupracovat při testování nových proteinů pomocí jimi navrhovaných krystalizačních sad roztoků a na podzim 2008 pravděpodobně proběhne založení její pobočky ve vědeckotechnickém parku Centrum biologických technologií Nové Hrady. V oblasti výpočtů byly používány GROMACS a YASARA pro širší spektrum substrátů i jiných ligandů a pokračoval vývoj parametrů jako jsou např. parciální náboje, vazebné hodnoty aj., pomocí kvantově mechanických výpočtů a byly vytvořeny topologie pro použité substráty a solventy. Intenzivně se pracovalo na výpočtech komplexů substrátů a enzymů jako hexosaminidasy, galaktosidasy, galaktosaminidasy a WrbA. V případě WrbA byl zahájen screening substrátové databáze k nalezení optimálního substrátu, a první výsledky ukazují na látky ze skupiny chinonů. V oblasti vývoje metodického postupu pro sledování aktivace proteinu přes změny v kvartérní struktuře pokračovalo pozorování kooperativních efektů a změn kvartérní struktury pomocí metod molekulární dynamiky na modelových systémech hexamerického bakteriálního represoru argininového regulonu, na tetrameru TRPA1, a na tetrameru WrbA, a první výsledky byly poslány k publikaci. Byla dokončena adaptace souboru programů molekulární dynamiky GROMACS k popisu selektivity enzymatických reakcí. Na enzymech z pracoviště v Brně byl zahájen projekt s cílem popisu vlivu různých solventů na enzymovou aktivitu dehalogenas. Akce pořádané v roce 2008: 11 3.ročník FEBS Advanced Course PLC s názvem Advanced methods in macromolecular crystallization III, hlavním organizátorem kterého je Ivana Kutá Smatanová, se bude konat v AUC na Nových Hradech ve dnech od 3. do 10. října Z celkového počtu 60 přihlášených zájemců z celého světa bylo vybráno 25 uchazečů, kteří dostali možnost se kurzu zúčastnit. Pozvání přijali přední světoví krystalografové, kterí stráví na NH celý týden (info na V květnu 2008 se uskutečnil II. Bioinformační workshop pro postgraduální studenty centra s 12 účastníky a v létě jsme se už tradičně zapojili do organizace letních škol Schola Ludus. Původně plánované II. Nové Hrady Symposium on Structure and Function of Proteins, které se mělo konat srpna 2008, bylo po domluvě s organizátory XXI. biochemického sjezdu přeloženo do první půlky roku 2009, protože hrozila konkurence obou akci ve stejném termínu, a většina potenciálních účastníků dalo najevo, že by nechtěli dvakrát během dvou týdnů jet do Jižních Čech. Zahraniční styky AUC Nové Hrady: Oddělení struktury a funkce proteinů v Nových Hradech aktivně spolupracuje s řadou významných zahraničních pracovišť zabývajících se biochemií, krystalogenezí, proteinovou krystalografií a strukturní bioinformatikou. Tyto spolupráce jsou aktivně rozvíjeny také v rámci Centra. Od roku 2002 spolupracujeme s Univerzitou v Princetonu (NJ, USA). Tato spolupráce se odehrává na úrovni vědecké strukturní a proteolytické studie proteinů, a také na úrovni vzdělávací díky projektu Kontakt ME640 (do roku konce 2006) a také díky letním školám Schola ludus (od r. 2006) se každoročně zúčastňují studenti z naší laboratoře a Laboratoře biochemie University v Princetonu výměnných 10-týdenních pobytů a pracují na vědeckých projektech. Do dnešní doby navštívilo AUC v Nových Hradech 11 studentů

12 z Princetonu v celkové délce pobytu 11 měsíců a 3 naši studenti působili na Univerzitě v Princetonu celkem 5 měsíců. Od roku 2003 spolupracujeme s Laboratoří krystalografických studií Univerzity (LEC) v Granadě (Španělsko) na výzkumu a způsobu aplikace pokročilých krystalizačních technik, které jsou rozvíjeny ve španělské laboratoři a v naší Laboratoři krystalogeneze a biomolekulární krystalografie jsou testovány na rozpustných i membránových proteinech. Od roku 1999 aktivně spolupracujeme s kolegy z Univerzity v Lübecku (Německo) (dříve působili na Ústavu molekulární biotechnologie v Jeně) při strukturních studiích a také organizování krystalizačních kurzů a FEBS Advanced kurzů, a také dlouhodobě s Univerzitou v Linci (Rakousko) a od r s Univerzitou v Miláně (Itálie). V roce 2004 byla zahájena spolupráce s Biological Research Center of the Hungarian Academy of Sciences (BRC) Szeged (Maďarsko). Za nejvýznamnější letošní návštěvy se dá považovat návštěva Prof. Carey z Princetonu, která v Nových Hradech byla dvakrát jeden měsíc (v lednu a srpnu), dále Philip Jaszczuk z De Paul University v Chicago, který byl v Nových Hradech měsíc a půl (červenec-srpen) a spolupracoval na krystalizačních experimentech tetracyklinu a WrbA. V roce 2007 absolvovali studenti a postdoci centra v oddělení struktury a funkce proteinů v Nových Hradech tyto zahraniční stáže: Babak Minofar (Dr. Thomas Stockner, ARC Seibersdorf, Rakousko), jeden týden, Vasilina Zayats (Dr. Thomas Stockner, ARC Seibersdorf, Rakousko), Iryna Kishko (Prof. Jannette Carey, Princeton University, NJ, USA) jeden měsíc. Mikalai Lapkouski získal cestovní grant Keystone Symposia Scholarship for International Students, aby se mohl zúčastnit konference Frontiers of Structural Biology organizované Wolfgangem P. Baumeisterem, Elenou Conti a Gerhardem Wagneemr v lednu 2008 v Steamboat Springs, Colorado. Dále získal Mikalai Lapkouski cestovní grant Finn Wald Travel Award, aby se mohl účastnit konference 22 nd Annual Symposium of the Protein Society: Machines of Life organizovaná Doug Barrickem a Leemor Joshua Torr v července 2008 v San Diego, California. Dále získal Abdul Samad cestovní grant od FENS, aby se mohl účastnit konference 6 th FENS Forum on European Neuroscience v červenci v Ženevě (Švýcarsko). 12 Změny ve složení řešitelského týmu: Ing. Manuel Acosta vyjel k na dlouhodobý zahraniční pracovní pobyt. Jeho místo bylo od nově obsazeno Ing. Marianem Pavelkou, PhD. Stav financí: pro rok 2008 nebyly investice plánovány mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem neinvestiční prostředky jsou čerpány minimálně z 95% v souladu s návrhem Plán prací pro rok 2009 včetně odborných akcí: (Plán prací pro rok 2009 je uveden také v přehledu výsledků z roku 2008) Cíle projektu budou zaměřeny na použití nových alternativních krystalizačních technik, které byly vyvinuty v naší laboratoři a na optimalizaci krystalizačních podmínek za účelem získat krystaly nových druhů proteinů v kvalitě a velikosti vhodné k difrakčním

13 experimentům. Nově budou zahájeny další krystalizační analýzy, výsledky kterých budou diskutovány v průběhu následujícího roku. Cíle projektu budou spočívat 1) v aplikaci našich nejnovějších poznatků z krystalizace rozpustných a membránových proteinů na krystalizaci nových rozpustných a membránových proteinových komplexů pomocí standardních, pokročilých a alternativních technik, 2) ve snaze získat monokrystaly proteinů v kvalitě vhodné k difrakčnímu měření, a v neposlední řadě 3) v použití nově vyvinutých GCB sad krystalizačních roztoků, které budou aplikovány pro rozpustné i membránové proteiny. V oblasti výpočtů pokračuje intenzivní používání metod a parametrů pro výpočty komplexů substrátů a enzymů jako hexosaminidasy, galaktosidasy, galaktosaminidasy a WrbA. V případě WrbA bude dokončen screening substrátové databáze k nalezení optimálního substrátu. V oblasti vývoje metodického postupu pro sledování aktivace proteinu přes změny v kvartérní struktuře pokračuje pozorování kooperativních efektů a změn kvartérní struktury pomocí metod molekulární dynamiky na modelových systémech hexamerického bakteriálního represoru argininového regulonu, na tetrameru TRPA1, a na tetrameru WrBA. Pro argininový regulon bude navržen mechanismus fungování alosterické vazby L-argininů a v případě TRPA1 způsob interakce s PIP2 na c-koncovou doménu. Na enzymech z pracoviště v Brně pokračuje projekt s cílem popisu vlivu různých solventů na enzymovou aktivitu. V první polovině 2009 se koná II. Nové Hrady Symposium on Structure and Function of Proteins, kde se předpokládá mezinárodní účast asi 80 účastníků. Hlavním organizátorem je Rüdiger Ettrich. Z důvodu enormního zájmu bude FEBS komisi předložen návrh projektu zorganizovat 4. ročník FEBS Advanced course Advanced methods in macromolecular crystallization IV, který by se měl konat v AUC na Nových Hradech od 1. do 8. října Noví studenti: Marina Sviatlova Katsiaryna Shamayeva Tatsiana Baikova Morteza Khabiri Zofie Sovova (dokončila Mgr., zahájila doktorské studium) Publikace 2008: (V přípravě dalších 5) Julie Wolfová, Jiří Brynda, Jeroen R. Mesters, Jannette Carey, Rita Grandori and Ivana Kutá Smatanová, Crystallographic study of Escherichia coli favoprotein WrbA, a new NAD(P)Hdependent guinine oxidoreductase. Materials Structure 15, 1, (2008). Alena Stsiapanava, Tana Koudelakova, Mikalai Lapkouski, Martina Pavlova, Jiri Damborsky and Ivana Kuta Smatanova, : Crystals of DhaA mutants from Rhodococcus rhodochrous NCIMB diffracted to ultra high resolution: crystallization and preliminary diffraction analysis. Acta Cryst. F64, (2008). (IF= 0.645) Mikalai Lapkouski, Santosh Panjikar, Pavel Janscak, Ivana Kuta Smatanova, Rudiger Ettrich, Eva Csefalvay, Structure of the motor subunit and translocation model for EcoR124I 13

14 restriction-modification complex, submitted to Nature Structural and Molecular Biology, under review. (IF= ) Jan Benedikt, Abdul Samad, Rudiger Ettrich, Jan Teisinger, and Viktorie Vlachova, Essential role for the putative S6 inner pore region in the activation gating of the human TRPA1 channel, submitted to Proceedings of the National Academy of Sciences PNAS, Under review. (IF= 9.598) Csefalvay E., Lapkouski M., Komarek O.: Expression, purification and preliminary crystalization study of RpaC protein from Synechocystis sp. PCC6803. Photosynthetica, submitted, (IF= 0.976) J.Ristvejová, I. Kutá-Smatanová, J.Brynda, N.Lapkouski, J.L. Revuelta., J.B Arellano., R.Ettrich, Crystallization and preliminary crystallographic characterization of the PsbP protein from oxygen-evolving complex of photosystem II from Spinacia oleracea, submitted to Acta Crystallographia F (IF= 0.645) Natallia Kulik, Lenka Weignerová, Tomáš Filipi, Petr Pompach, Petr Novák, Hynek Mrázek, Karel Bezouška, Vladimír Křen, and Rüdiger Ettrich, The α-galactosidase type A gene from Aspergillus niger encodes a fully functional α-n-acetylgalactosaminidase, submitted to Biochemical and Biophysical Research Communications, (IF= 2.749) Ivana Kuta Smatanova, Julie Wolfova, Jiri Brynda, Mikalai Lapkouski,, Peter Palencar, Michal Kuty, Jeroen R. Mesters, Rita Grandori, Rudiger Ettrich and Jannette Carey Crystallographic Characterization of E. coli WrbA and its Complex with FMN, prepared for submission to Biochemistry Jannette Carey and Rudiger Ettrich, Applications of molecular dynamics simulations to study protein quarterny structure changes involved in allostery, Methods in Enzymology (book series), invited review with deadline 15 th October 2008, (IF= 2.122) Peter Palencar, Jakub Psencik, Tatyana Prudnikova, Frantisek Vacha, Michal Kuty: The effects of light induced reduction of the Photosystem II reaction center. Submitted to Journal of Molecular Modeling, (IF= 1.669) Samad A, Minofar B, Stockner T, Kulik N, Teisinger J, Ettrich R, Vlachova V (2008) Complex role of PIP2 in the regulation of TRPA1. In preparation for Journal of Neuroscience J. Ristvejová, M. Lapkouski, V. Kopecky Jr., K. Hofbauerova, Z. Sovova, S. Gonzalez-Perez, I. Kutá-Smatanová, J.L. Revuelta., J.B Arellano., R.Ettrich, Structure and Dynamics of the PsbP protein from oxygen-evolving complex of photosystem II from Spinacia oleracea, prepared for submission 14 Přednášky: R.Ettrich, Young Scientist Talk, Structure of the motor subunit and model for translocation by the type I restriction enzyme EcoR124I, 22nd Annual Symposium of the Protein Society, 22 nd July 2008, San Diego, California, USA

15 R.Ettrich, Structure of the motor subunit and translocation model for EcoR124I restrictionmodification complex, 15 th April 2008, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (Accomodation covered by NIH) R.Ettrich, Structure of the motor subunit and translocation model for EcoR124I restrictionmodification complex, 21 st April 2008, Princeton University, New Jersey, USA (Accomodation and local expenses covered by Princeton University) J. Ristvejová,Cross-linking studies of the oxygen-evolving complex proteins PsbP and PsbQ from Spinacia oleracea, Institute of Organic Chemistry, Johannes Kepler University, Linz, Rakousko, 15. January 2008 Ristvejová J., Lapkouski M., Sovová Ž., González-Pérez S., Kopecký V. Jr., Revuelta J. L., Arellano J. B., Ettrich R.: Structural analysis of PsbP protein of the oxygen-evolving complex from Spinacia oleracea, XXI. biochemický sjezd - České Budějovice, September 2008 (presented by JR) M. Lapkouski, 25 th July 2008, Macromolecular Structure Group, University of California in San Franscisco, California, USA (Expenes partially covered by a Finn Wald Travel Award to ML) M. Lapkouski, 17 th July 2008, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (Accomodation and local expenses covered by NIH) A. Stsiapanava, J. Dohnalek, M. Kuty, M. Lapkouski, Jose A. Gavira, Tana Koudelakova, Jiri Damborsky and I. Kuta Smatanova: Preliminary structure characterization of DhaA mutants from Rhodococcus rhodochrous. Materials Structure 15, 2a, k33 (2008). Colloquium of CSCA Structure 2008, Valtice, Czech Republic Tatyana Prudnikova, José A. Gavira, Pavlína Řezáčová, Michal Kutý, František Vácha, Jakub Pšenčík, Juan M. Garcia-Ruiz and Ivana Kutá Smatanová: Crystallization study of high plants photosystem II and chlorosomal bacteriochlorophyll c aggregates. Materials Structure 15, 2a, k57 (2008). Colloquium of CSCA Structure 2008, Valtice, Czech Republic Jiri Brynda, Jannette Carey, Julie Wolfova, Rita Grandori, Tobias Gustavsson, Rudiger H. Ettrich and Ivana Kuta Smatanova: WrbA bridges bacterial flavodoxins and eukaryotic NAD(P)H:quinone oxidoreductases. Materials Structure 15(1), 60 (2008). 276 th CSCA seminar (Rozhovory) Bratislava, Slovensko 15 Konferenční příspěvky publikovány ve vědeckých časopisech prezentace formou posterů: Natallia Kulik, Lenka Weignerová, Karel Bezouška, Vladimir Křen and Rüdiger Ettrich: Structural modeling of a-galactosidase and a-galactosaminidase from Aspergillus Niger. German Conference on Bioinformatics 2008, Dresden, Germany, September Samad A., Minofar B., Zayats V., Kulik N., Stockner T. & Ettrich R.: Building a structural model for transient receptor potential channels: possibilities and limitations., 6 th FENS Forum

16 on European Neuroscience, July 12-16, Geneva, Switzerland (Expenses partially covered by FENS travel award to AS) Rudiger Ettrich, Natallia Kulik, Vladimir Kopecky Jr, Katerina Hofbauerova, Petr Pompach, Jan Sklenar, Ondrej Plihal, Vladimir Kren, Karel Bezouska, Structure, Function and Dynamics of fungal beta-n-hexosaminidase, The 2008 Protein Structure Initiative "Bottlenecks" Workshop, April 14-16, 2008, Natcher Conference Center, Bethesda, Maryland, USA R. Ettrich, R. Strawn, M. Melichercik, T. Stockner and J. Carey., Allosteric Activation of Hexameric Arginine Repressor: A Molecular Dynamics Study, 22nd Annual Symposium of the Protein Society, July 2008, San Diego, California, USA M. Lapkouski, S. Panjikar, P. Janscak, I. Kuta-Smatanova, J. Carey, R. Ettrich and E. Csefalvay, Structure of the Motor Subunit and Translocation Model for EcoR124I Restriction- Modification Complex, 22nd Annual Symposium of the Protein Society, July 2008, San Diego, California, USA Lapkouski Mikalai, Panjikar Santosh, Kuta Smatanova Ivana, Csefalvay Eva, Structural studies on the 120 kda motor subunit (HsdR) of the EcoR124I endonuclease from E. Coli, January 6th-11 th 2008, Frontiers of Structural Biology, Steamboat Springs, Colorado (Expenses partially covered by Keystone Symposia Scholarship for International Students to ML) Ivana Kuta Smatanova, Jose A. Gavira, Pavlina Rezacova, Michal Kuty and Juan M. Garcia- Ruiz: Application of advanced crystallization methods on crystallization of membrane and soluble proteins. ICCBM12 Program and Abstract Book, 53 (2008). 12 th International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules, Cancun, Mexico Alena Stsiapanava, Tana Koudelakova, Mikalai Lapkouski, Martina Pavlova, Jiri Damborsky and Ivana Kuta Smatanova : Crystallization and preliminary diffraction analysis of Rhodococcus rhodochrous NCIMB DhaA mutants. ICCBM12 Program and Abstract Book, 100 (2008). 12 th International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules, Cancun, Mexico Tatyana Prudnikova, Michal Kutý, José A. Gavira, Pavlína Řezáčová, Juan M. García-Ruiz and Ivana Kutá Smatanová: Crystallization study of higher plants photosystem II. ICCBM12 Program and Abstract Book, 137 (2008). 12 th International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules, Cancun, Mexico Protein Structures deposited to the PDB-database: 2W00 Crystal structure of the HsdR subunit of the EcoR124I restriction enzyme in complex with ATP, Authors: Lapkouski, M., Panjikar, S., Janscak, P., Ettrich, R., Kuta Smatanova, I., Csefalvay, E. 2VU4 Structure of PsbP protein from Spinacia oleracea at 1.98 A resolution M.Lapkouski, R.Ristvejova, J.B.Arellano,J.L.Revuelta,I.Kuta Smatanova, R.Ettrich 16

17 17 Zpráva 2008 MU Brno Postup plnění úkolů 2008: Ve shodě s grantovým návrhem byly v roce 2008 dále rozvíjeny a zdokonalovány softwarové nástroje pro racionální design proteinů - počítačové programy umožňující studium struktury a dynamiky komplikovaných proteinových struktur: (i) program CAVER pro počítání velikosti a průchodnosti tunelů v proteinových strukturách, (ii) program HOTSPOT WIZARD pro racionální design mutantů se změněnou substrátovou specifitou a (iii) databáze HADES pro uchovávání informací o enzymech. Tyto programy byly současně použity v projektech zaměřených na konstrukci enzymů s novými užitnými vlastnostmi. Byla provedena série měření vlivu organických solventů na strukturu a funkci enzymů halogenalkandehalogenas. Na základě potenciálního využití v environmentálních a průmyslových aplikacích byly vybrány tři halogenalkandehalogenasy. LinB izolovaná ze Sphingobium japonicum UT26 a DhaA z Rhodococcus rhodochrous NCIMB byly vybrány pro svou širokou substrátovou specifitu a schopnost degradovat bis(2- chlorethyl)sulfid (yperit); DbjA izolovaná z Bradyrhizobium japonicum USDA110 je zajímavá vysokou enantioselektivitou, která řadí DbjA mezi biokatalyzátory vhodné pro průmyslové syntézy chirálních sloučenin. Bylo prokázáno, že halogenalkandehalogenasy mohou pracovat nejen ve vodném prostředí, ale také v přítomnosti nekonvenčních solventů, jako jsou vodou mísitelná organická rozpouštědla. Nejvyšší tolerance k testovaným organickým rozpouštedlům byla detekována u DbjA. Dále byla provedena strukturní charakterizace enzymů metodou cirkulárního dichroismu a fluorescenční spektroskopie. Měření ukázala, že zatímco v případě LinB mužeme vyloučit konformační změnu jako hlavní příčinu ztráty aktivity, u DhaA a DbjA bylo potvrzeno, že pokles aktivity v přítomnosti organických rozpouštedel je spojen se strukturními změnami. V navazující části projektu bude studována příčina neobvykle vysoké aktivity DbjA v přítomnosti organických rozpouštědel. Projekt bude nově řešen nejen experimentálně na pracovišti MU, ale i teoreticky ve skupině Dr. Rüdigera Ettricha na pracovišti SBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady v rámci spolupráce CBB. V podprojektu zaměřeném na konstrukci vylepšených biokatalyzátorů kombinovanými metodami racionálního designu a řízené evoluce (zavedených v 1. a 2. roce projektu CBB) jsme řešili problém odstraňování organického polutantu 1,2,3-trichlorpropanu (TCP). TCP se do životního prostředí dostává z řady chemických syntéz a setrvává v podzemních vodách desítky let, je toxický a potenciálně karcinogenní pro člověka. Cílem projektu bylo vylepšit katalytickou účinnost přírodního enzymu DhaA s touto nebezpečnou látkou. Několik zahraničních laboratoří pracujících v oblasti proteinového inženýrství se tímto problémem v minulosti zabývalo a došlo k vylepšením nedostatečným pro praktické aplikace (např. 4-násobné vylepšení fy Diversa Corp., USA). Námi zkonstruovaný mutantní protein DhaA31 dosáhl 36-násobného vylepšení a otevírá nové možnosti v ekologické likvidaci TCP. Mutant byl navržen s použitím programu CAVER a strukturní mechanismus zlepšení aktivity je v současné době studován termodynamickou analýzou, počítačovým modelování a krystalografickou analýzou prováděnou ve spolupráci se skupinou Dr. Ivy Kuté-Smatanové na SBE AVČR a ÚFB JU Nové Hrady v rámci spolupráce CBB.

18 18 Akce pořádané v roce 2008: Ve dnech května 2008 proběhlo v Brně pracovní setkání EU Outreach Workshop on Industrial Biotechnology. Setkání bylo spoluorganizováno CBB a Jihomoravským inovačním centrem na žádost Evropské komise s osobní účastí zástupců Evropské komise, EuropaBio a SusChem. Hlavním tématem pracovního setkání bylo projednání možnosti růstu a posílení pozice České republiky na poli průmyslových biotechnologií, zhodnocení současného stavu a příprava dokumentu jako základního materiálu pro účely podpory biotechnologického výzkumu, vývoje a průmyslu České republiky. Vypracovaný materiál bude poskytnut autoritám v Bruselu a ministerstvům v České republice. Ve dnech října 2008 se bude v Sant Feliu ve Španělsku konat mezinárodní konference Protein Design and Evolution for Biocatalysis. Tuto konferenci spoluorganizuje CBB. Cílem konference je umožnit celosvětové setkání teoretiků a experimentátorů působících v oblasti proteinového inženýrství. Program konference obsahuje 24 prezentací zvaných řečníků, 14 krátkých sdělení začínajících vědců, 2 posterové sekce a 1 panelovou diskusi. Stav financí: pro rok 2008 nebyly investice plánovány mzdové prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem neinvestiční prostředky jsou čerpány v souladu s návrhem Plán prací pro rok 2009: V příštím roce bude studován kombinovaný vliv organických rozpouštědel a anorganických solí na strukturu a funkci halogenalkandehalogenas. Metodami enzymové kinetiky a počítačového modelování bude studován mechanismus aktivace/inhibice proteinů v závislosti na kompozici média. Zahraniční styky a stáže - MU: V roce 2008 absolvovali členové pracovní skupiny na Masarykově univerzitě dvě zahraniční stáže: Táňa Koudeláková navštívila Univerzitu Greifswald (Německo) a Martina Pavlová Univerzitu Groningen (Holandsko). Publikace: 1. Otyepka, M., Banáš, P., Magistrato, A., Carloni, P., Damborský, J., 2008: Role of Electrostatics for Enzyme Catalysis: the Case of Hydrolytic Dehalogenation. Proteins- STRUCTURE FUNCTION AND BIOINFORMATICS 70: IF = 3, Stsiapanava, A., Koudeláková, T., Lapkouski, M., Pavlová, M., Damborský, J., Kutá Smatanová, I., 2008: Crystals of DhaA Mutants from Rhodococcus rhodochrous NCIMB Diffracted to Ultra High Resolution: Crystallization and Preliminary Diffraction Analysis. Acta Crystallographica F64: IF = 0, Grochová, D., Vaňková, J., Ravčuková, B., Damborský, J., Vojtěšek, B., Šmardová, J., 2008: Analysis of Transactivation Capability and Conformation of p53 Temperature- Dependent Mutants and Their Reactivation by Amifostine in Yeast. Oncogene 27: IF = 6, Pavlová, M., Klvaňa, M., Chaloupková, R., Banáš, P., Otyepka, M., Wade, R., Nagata,

19 Y., Damborský, J. Design and Evolution of Haloalkane Dehalogenase with Enhanced Conversion of 1,2,3-Trichloropropane by Modification of Access Tunnels. Nature Chemical Biology IF = (in review). 5. Fohlerová, R., Mazura, P., Janda, L., Chaloupková, R., Jeřábek, P., Damborský, J., Kiran, N.S., Brzobohatý, B. Functional Analysis of the Aglycone-Binding Site of the Maize β-glucosidase Zm-p60.1. FEBS Journal (submitted). 6. Chaloupková, R., Prokop, Z., Straková, M., Sato, Y., Nagata, Y., Damborský, J.: Stereoselectivity and Conformational Stability of Haloalkane Dehalogenase DbjA from Bradyrhizobium japonicum USDA110: The Effect of ph and Temperature. Biochemistry (submitted). Přednášky: Holub P., Pavlová M, Klvaňa M., Prokop Z., Chaloupková R., Oakley A., Tsuda M., Nagata Y., Damborský, J.: Protein Engineering of Haloalkane Dehalogenases: Towards the Change of Reaction Mechanism, XII. Working Meeting of Biochemists and Molecular Biologists, February 6-7, 2008, Brno, Czech Republic, (presented by PH). Bidmanová Š., Prokop Z., Chaloupková R., Kuncová G., Bolyó J., Damborský J.: Development of Enzyme Biosensors for Detection of Toxic Halogenated Compounds, XII. Working Meeting of Biochemists and Molecular Biologists, February 6-7, 2008, Brno, Czech Republic, (presented by ŠB). Dvořák P., Pavlová M., Klvaňa M., Chaloupková R., Prokop Z., Nagata Y., Damborský J.: Semi-Rational Engineering of Haloalkane Dehalogenases DHAA Towards Improved Activity with 1,2-Dichloroethane, XII. Working Meeting of Biochemists and Molecular Biologists, February 6-7, 2008, Brno, Czech Republic, (presented by PD). Brezovský J., Monincová M., Prokop Z., Sato Y., Senda T., Nagata Y., Rebecca C. Wade R.C., Damborský J.: Quantitative Comparison of Binding Sites within the Protein Family of Haloalkane Dehalogenases, XII. Working Meeting of Biochemists and Molecular Biologists, February 6-7, 2008, Brno, Czech Republic, (presented by JB). Hasan K., Monincová M., Jesenská A., Chaloupková R.,Koudeláková T., Prokop Z., Geerlof A., Damborský J.: Characterization of Haloalkane Dehalogenase DmbC from Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Indonesian Student s Scientific Meeting, May , Delft, The Netherlands, (presented by KH). Chovancová, E., Damborský, J.: Bioinformatics - Tool for Solving Biological Problems, 4th International Summer School on Computational Biology, May 29-31, 2008, Brno, Czech Republic, (presented by ECH). Chaloupková, R., Prokop, Z., Damborský, J.: Strukturní a funkční charakterizace enzymů, Exprese rekombinantních proteinů, June 17, 2008, Praha, Czech Republic, (presented by RCH). Stsiapanava, A., Dohnálek, J., Kutý, M., Lapkouski, M., Gavira, J.A., Damborský, J., Kutá- Smatanová, I.: Preliminary Structure and Characterization of DhaA Mutants from Rhodococcus rhodochrous, Struktura 2008, June 16-19, 2008, Valtice, (presented by AS). 19

20 20 Pavlová, M., Klvaňa, M., Dvořák, P., Chaloupková, R., Wade, R.C., Nagata, Y., Damborský, J.: Engineering of Enzymes: Optimization of Access Pathways into Active Site, VIII. Mezioborové setkání mladých vědeckých a výzkumných pracovníků z oboru chemie, biochemie a molekulární biologie, June 10-13, 2008, Milovy, Czech Republic, (presented by MP). Postery: Stsiapanava, A., Koudeláková, T., Lapkouski, M., Pavlová, M., Damborský, J., Kutá Smatanová, I.: Crystallization and Preliminary Diffraction Analysis of Rhodococcus rhodocrous NCIMB DhaA Mutants, 12th International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules, May 6-9, 2008, Cancun, Mexico (presented by AS). Brezovský, J., Wade, R., Damborský, J.: Quantitative Analysis of the Substrate Specificity of Haloalkane Dehalogenases, Biomolecular Simulation, July 1-8, 2008, Paris, France (presented by JB).

21 Přílohy Národní a mezinárodní akce uspořádané v r v rámci aktivit CENTRA BIOKATALÝZY A BIOTRANFORMACÍ 21

22 22 OUTREACH WORKSHOP ON INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY IN THE CZECH REPUBLIC DAY 1 Time Activity People Objective 10:00-13:00 Arrival, registration and refreshment all getting together 13:00-13:10 Welcome and opening J. Damborsky and J. Vanhemelrijck welcome 13:10-13:35 Introduction of participants all learn to know each other 13:35-13:55 Presentation of EuropaBio & SusChem C. Burel inform about organizations and expectations 13:55-14:15 Presentation of Biotechnology in FP7 M. Sormann inform about organizations and expectations 14:15-14:35 Presentation of status of IB in Czech Republic P. Šebo gain an overview of IB in Czech Republic Coffee 15:00-15:15 Presentation of "rules" and objectives M. Kostka organize discussion and move to meeting rooms 15:15-17:15 Group discussion: - R&D - Innovation - Policy groups lead by spokesmen V. Křen, J. Krechl, M. Minárik discuss status of IB in Czech Republic; give recommendations Coffee 17:30-18:30 Preparation of draft summary chairman J. Vanhemelrijck and spokesmen preparation of draft summary 19:00 Dinner and social evening all getting together, informal discussions DAY 2 Time Activity People Objective 9:00-9:40 Presentation of conclusions group discussions spokesmen V. Křen, J. Krechl, M. Minárik information on results from group discussions 9:40-10:00 Presentation of summary by chairman chairman J. Vanhemelrijck information on draft of the summary 10:00-11:30 General discussion & conclusions all finalization of the summary Coffee 12:00-12:30 briefing with media J. Vanhemelrijck, C. Burel, M. Sormann, V. Křen, J. Krechl, M. Minárik state of the art and future of IB in Czech Republic and Europe 12:00 lunch and departure all

23 23 OBJECTIVES OF THE ROUNDTABLE ON INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY General objectives and purpose of the meeting The main purpose of the roundtable is to identify how industrial biotechnology can be further developed in the Member State and how implementation and coordination can be improved between Member State and the EU. This will be done during the workshop by: Identifying needed measures to stimulate research and innovation. Identifying needed policies to develop a strong and competitive biobased economy. Discussing adequacy between European initiatives such as the research and policy agendas developed by Suschem and the priorities and ongoing actions carried-out at national level. Presenting ongoing European research and innovation programmes on biobased economy, focusing on industrial biotechnology so that industrial biotechnology actors in the Member State can more easily take part in European initiatives. Identifying possible cooperation with other Member States and by discussing specific issues (like pilot- and demo- plant financing) where transnational cooperation and coordination at European level is needed and ways to achieve it. Expected outputs of the roundtable Better understanding of the industrial biotechnology sector in each Member State (what kind of enterprise, what policies exist, what kind of research projects are conducted, etc.). Concrete recommendations on how to improve industrial biotechnology in the Member State. Rise awareness of national decision makers on the fact that industrial biotechnology is a growing sector with important potential. Actions after the roundtable What will it be used for? Conclusions of the workshop will be summarized and published in a memorandum. A summary of all roundtables will be published at the end of An exhaustive report on industrial biotechnology status in EU-27 (+ Norway, Turkey and Croatia) will be done and published by the end of Recommendations will be given to the Commission and Member State with the aim of developing industrial biotechnology in the EU. Follow-up actions will be discussed with KBBE-net (representatives of Member State officials to the KBBE theme in FP7)

24 24 RESEARCH CONFERENCES ESF-EMBO Symposium Protein Design and Evolution for Biocatalysis Hotel Eden Roc, Sant Feliu de Guixols (Costa Brava) Spain October 2008 Chair: Jiri Damborsky, Masaryk University, CZ