Struktura a funkce biomakromolekul

Transkript

1 Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 5. Metody určování struktury proteinů Ivo Frébort

2 3D struktury

3 Smysl určování 3D struktur Pochopení funkce proteinů, mechanismu enzymových reakcí, design nových léčiv, atd. Experimentální vyřešení struktury je velmi obtížné. PDB Genebank ~ proteinových struktur ~ proteinových sekvencí Z struktur, tvoří proteiny s méně než 30% identity sekvence a jen je unikátních, reprezentuje proteiny, které jsou výrazně strukturně odlišné

4 PDB Protein Data Bank (PDB) - založena D strukturní data makromolekul Data pocházejí z rentgenostrukturní krystalografie nebo NMR Celkový počet struktur (25/02/2016)

5 Vývoj obsahu PDB

6 Nárůst nových typů struktur v PDB

7 Informační portál PDB

8 Struktury membránových proteinů Unique proteins in database = 595 Number of coordinate files in database =

9 Strukturní databáze virů v PDB

10 Možnost stanovení struktury komplexu ES/EI Cytokinin dehydrogenasa + substrát ip/ip9g

11 Určení funkčních domén proteinu IMUNOGLOBULIN-G

12 Určení struktury neproteinových složek STRUKTURY MYOGLOBINU A HEMOGLOBINU

13 Rentgenová krystalografie proteinů Je nutný extrémně čistý proteinový vzorek Protein musí tvořit relativně velké a kvalitní krystaly. Obvykle největší problém Řadu proteinů není možno zkrystalovat vůbec (např. membránové proteiny)

14 Odpovídá krystalová struktura skutečnosti? Krystaly enzymů vykazují katalytickou aktivitu Proteinové krystaly obsahují velký podíl vody, ~50% Výsledky získané chemickou modifikací a proteinovým inženýrstvím většinou potvrzují krystalové struktury Metody pracující s proteiny v roztoku, zejména NMR potvrzují krystalové struktury

15 Krystalografie proteinů Krystaly lidského insulinu Rentgenokrystalografický experiment

16 MAX FERDINAND PERUTZ ( ) 1962 Nobelova cena za chemii za studium struktury globulárních proteinů

17 Braggův zákon 2d.sin = n. Fourierova transformace: řešení matematického vztahu mezi elektronovou hustotou a difrakcí rentgenova záření F(h) odraz na krystalové mřížce v bodě h, f(x) rozptylová funkce elektronové hustoty v bodě x. F(h) je komplexní číslo (vektor) skládající se z amplitudy a fáze odrazu. Integrace je možná pouze na úrovni celé krystalové jednotky. Každý atom tedy přispívá k amplitudě a fázi každého individuálního odrazu, ale různým způsobem (závisí na počtu elektronů atomového obalu). Tedy i částečná data dávají informaci o kompletní proteinové struktuře. Elektronová hustota ρ(x) v bodě x je dána sumou všech odrazů v krystalové jednotce. Ke získání kvalitní mapy elektronové hustoty (s dobrým rozlišením) je třeba kompletní data.

18 Difrakční záznam proteinového krystalu

19 Princip řešení fáze pomocí metody isomorfní výměny Je možné změřit pouze amplitudu!!!

20 Zařízení pro rentgenovou difrakci Detektor Kapalný dusík se používá ke zmražení a stabilizaci krystalu.

21 Krystalizační kity a metodiky Hanging drop Sitting drop Microdialysis

22 Činidla kitu Crystal screen Hampton Research

23 Molecular Dimensions Mosquito Robot

24 Zdroj záření - synchotron Synchrotronové záření je vyzářeno elektronem letícím téměř rychlostí světla, když je jeho dráha ohýbána magnetickým polem (obj. 1947)

25 Nejvýznamnější synchotrony

26

27 SPring x silnější RTG záření než konvenční zdroje

28

29 SPring-8 Linac akcelerátor urychluje elektrony generované elektronovým dělem na energii 1 GeV pomocí vysokofrekvenčního elektrického pole. Synchrotron je kruhový akcelerátor, který dále urychluje elektrony na energii 8 GeV přenáší je do zásobního okruhu. Zásobní okruh elektrony s energií 8 GeV cyklují a jsou používány k produkci synchotronního záření, které je vyvedeno do jednotlivých výzkumných pracovišť. 1 km světelná dráha slouží ke studiu koherentní optiky rentgenova záření, např. vliv gravitace na světlo.

30 Linac Synchotron Storage ring Experimental station

31

32 Mapa elektronové hustoty Řešení proteinové struktury Modelování Optimalizace Isomorfní výměna Molekulární výměna Řešení fáze Struktura Validace Publikace Zpracování dat Porovnání s PDB Purifikace Záznam dat Krystalizace Synchotron

33 Mapa elektronové hustoty a tvorba modelu

34 Validace struktury - Ramachandránův diagram 3: CORE (dark green), 2: ALLOWED (light green), 1: GENEROUS (yellow), 0: OUTSIDE (red) Morris A L, MacArthur M W, Hutchinson E G & Thornton J M (1992). Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins, 12,

35 Nukleární magnetická resonance NMR lze použít pro řešení struktury malých proteinů (do 20 kda)

36 Určení proteinové struktury pomocí NMR Triple resonance experiments

37 NMR vs. krystalové struktury NMR model Proteinový krystal

38 Struktura vyřešená pomocí NMR priony PrP and PrP* R Riek, S Hornemann, G Wider, M Billeter, R Glockshuber & K Wuethrich: NMR structure of the mouse prion protein domain PrP( ). Nature 382, (1996).

39 Teoretické předpovědi proteinové struktury Sekvence obsahuje všechny informace o struktuře Existuje nepřeberné množství možných konfigurací peptidového řetězce Ab initio modelování zatím neuskutečnitelné Homologní modelování na základě podobnosti aminokyselinové sekvence (nad 25% identity)

40 Literatura Garett, R. and Grisham, C.: Biochemistry 2 nd ed., Harcourt Brace & Company, Orlando, FL, USA Jones, C., Mulloy, B., and Sanderson, M. R.: Crystallographic methods and protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 56, Humana Press, Totowa, NJ, USA Spring-8 web page ( and other Internet resources