Analyzátory iontové pohyblivosti (iontová mobilita)

Transkript

1 Hmotnostní detekce v separačních metodách VI. - Separace iontů podle jejich pohyblivosti. Iontová mobilita v oblasti iontového zdroje a hmotnostního analyzátoru. - Detektory iontů, vakuová technika. - Přehled současné komerčně dostupné instrumentace. Analyzátory iontové pohyblivosti (iontová mobilita)

2 Analyzátor iontové pohyblivosti Analyzátor iontové pohyblivosti separuje ionty na základě jejich pohyblivosti v prostředí neutrálního plynu (obdoba elektroforézy). Analyzátorem je driftová trubice obsahující plyn o daném tlaku, na kterou je vloženo napětí. Ionty se pohybují ve směru elektrického pole, odpor prostředí (plyn) působí v opačném směru. Ionty se dělí na základě svých kolizních průřezů (tj. tvaru a velikosti), náboje a hmotnosti (u molekul větších než 0,5 kda na hmotnosti nezáleží). Kolizní průřez iontu Kolizní průřez iontu (Collision Cross Section, CCS) - efektivní plocha interakce mezi iontem a neutrálním plynem, ve kterém se ion pohybuje - průmět koule získané rotací iontu v prostoru, (uvádí se v jednotkách plochy, Å 2 ) CCS iontu lze experimentálně měřit (reprodukovatelnost měření je lepší než u chromatografických retenčních časů) nebo vypočítat (musí být známá 3Dstruktura). Hodnoty CCS závisí na použitém plynu (např. CCS N2 > CCS He ) Využití porovnání změřených a vypočítaných CCS: - studium struktury iontů v plynné fázi, zejména biomolekuly - nezávislé identifikační kritérium, lze využít při identifikaci neznámých látek

3 Analyzátor iontové pohyblivosti Datový záznam mobilogram. (na ose x je čas ( drift time )). Tofwerk AG Analyzátor iontové pohyblivosti Ionty se v analyzátoru (driftové trubici) působením elektrického polem pohybují rychlostí v. Konstantou úměry je mobilita iontu. d v KE K t E K mobilita iontu v rychlost pohybu E intenzita elektrického pole d d délka driftové trubice t d čas, za který iont překoná délku driftové trubice Parametry, mající vliv na mobilitu: q 2 K 16N kt pozn.: platí jen pro nízké E/N 1 D q náboj iontu N hustota plynu v driftové trubici - redukovaná hmotnost iontu k Boltzmanova konstanta T teplota D kolizní průřez iontu

4 Analyzátor iontové pohyblivosti Využití bez MS: rychlé detektory výbušnin, drog, chemických zbraní (armáda, letištní kontroly) Dva způsoby využití iontové mobility v MS: 1/ separace iontů v oblasti iontového zdroje (FAIMS, DMS) - při tlaku ~1 atm. 2/ separace iontů v prostoru za iontovým zdrojem (častá kombinace s TOF analyzátorem) - ve vakuu I. Mobilitní separace v oblasti API zdroje (DMS/FAIMS) - elektrické pole o vysoké intenzitě (E > 10 kv/cm) rychlost iontu v už není přímo úměrná intenzitě elektrického pole, mobilita K h závisí na E mobilita je méně korelovaná s m/z iontu (šance na lepší separaci izobarických iontů - atmosférický tlak (~1 bar) Anal. Chem. 1999, 71, ; grafika: Waters, Sciex

5 I. Mobilitní separace v oblasti API zdroje (DMS/FAIMS) FAIMS (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry), též DMS (Differential Mobility Spectrometry) - technika separace iontů v plynné fázi, která využívá rozdílných mobilit iontů v elektrickém poli o vysoké a nízké intenzitě Proud plynu MS Ionty jsou unášeny proudem plynu mezi dvěma elektrodami, na které jsou vkládány pulzy vysokého a nízkého napětí (až desítky kv). Ionty se pohybují směrem k jedné z elektrod v závislosti na K h /K 0. J. Chromatogr. A 2004, 1058, 3 19 I. Mobilitní separace v oblasti API zdroje (DMS/FAIMS) Kompenzační napětí (CV): stejnosměrné napětí, které zajistí stabilní trajektorii pro vybraný ion (filtr iontů). CV lze skenovat a získat spektra kompenzačního napětí ( CV spektrum ). Shvartsburg, DIFFERENTIAL ION MOBILITY SPECTROMETRY: Nonlinear Ion Transport and Fundamentals of FAIMS, CRC Press

6 DMS/FAIMS: Geometrie elektrod & využití Geometrie elektrod: - válcovité koaxiální - planární - pole planárních elektrod na čipu Mobilitní separace: ortogonální k LC i MS, v některých případech rychlejší alternativa k LC Skenování CV: spektra kompenzačního napětí (FAIMS spektra, DMS spektra) - separace látek před MS, dělení izobarických iontů Měření při fixním CV: filtrace iontů, potlačení chemického šumu - zvýšení reprodukovatelnosti a robustnosti - zvýšení selektivity, zlepšení S/N - výběr prekurzoru pro in-source CID (tandemová MS na přístrojích bez MS/MS analyzátoru) Int J Mass Spectrom. 2010; 298: 45 54; grafika: Thermo, Sciex, Owlstone DMS/FAIMS: Využití Zvýšení selektivity a S/N při kvantifikaci Analýza kyseliny linolové v buněčném extraktu zvýšení S/N 10x Zvýšení reprodukovatelnosti a robustnosti Nástřik 1000 vzorků plasmy během 66 hodin Buprenorfin Clenbuterol Firemní materiály Thermo (Application Note 400) Firemní materiály Sciex

7 DMS/FAIMS: Využití Separace strukturně podobných látek Separace diastereoizomerů - dělení lipidových tříd pseudoefedrin efedrin Firemní materiály Sciex Int J Mass Spectrom. 2010, 298, DMS/FAIMS: Využití Separace dle místa protonizace Oddělení protonizovaných forem kyseliny 4-aminobenzoové MS 2, m/z 138 ([M + H] + ) Anal. Chem. 2012, 84,

8 II. Mobilitní separace v oblasti za zdrojem - elektrické pole pro mobilitní separaci o nízké intenzitě (E < 1 kv/cm) rychlost iontu v je přímo úměrná intenzitě elektrického pole (mobilita K 0 není závislá na E) mobilita poměrně silně koreluje s hmotností iontu (ionty s blízkými hodnotami m/z se obtížněji separují) - nízký tlak v mobilitním analyzátoru (~mbar) grafika: Waters, Agilent Analyzátor iontové pohyblivosti Separace podle tvaru a velikosti iontů: izobarické trisacharidy Agilent

9 Analyzátor iontové pohyblivosti Separace podle nábojového stavu iontů: vícenásobně nabité ionty proteinů Agilent Detektory iontů Dynoda a konverzní dynoda Faradayův detektor Elektronový násobič Channeltron Mikrokanálová deska Fotonásobič

10 Detektor iontů Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua Detekce iontů Detektor je zařízení, které převádí proud nabitých částic (iontů) na měřitelnou veličinu (el. proud). jednoduché elektrody - kolektory detektory elektronové násobiče fotonásobiče FT-MS přístroje (ICR, orbitrap) neobsahují samostatný detektor signálem je proud indukovaný na stěnách analyzátoru.

11 Dynoda, konverzní dynoda Dynoda je elektroda z materiálu, který je schopen sekundární emise (elektrony, kladně nabité ionty neutrální částice), např. CsSb, GaP or BeO, kovy. Konverzní dynoda dynoda, která je používána před násobičem ke zvýšení sekundární emise (signálu) těžších iontů. Zakřivený povrch konverzní dynody fokusuje emitované částice do elektronového násobiče, gradient napětí je navíc urychlí. + ionty (na konverzní dynodě negativní napětí) -> emise elektronů a negativně nabitých iontů. - ionty (na konverzní dynodě pozitivní napětí) -> emise pozitivně nabitých částic z materiálu elektrody a adsorbovaných plynů. Ke konverzi sekundární emise na elektrony dojde na první dynodě násobiče. Faradayův detektor (pohár) Faradayův detektor je válcovitá elektroda (dynoda). Ionty narážejí na povrch dynody, dochází k sekundární emisi. Vzniklý signál (proud) je zesílen a zaznamenán. Faradayův detektor je relativně málo citlivý, ale velmi robustní. Je vhodný pro přesnou analýzu poměrů izotopů (isotope ratio MS).

12 Elektronový násobič Typický násobič má dynod, zesílení signálu je dosahováno při ~1400 V. Elektronový násobič je detektor iontů obsahující sérii dynod se vzrůstajícím potenciálem. Ionty narážejí na povrch dynody, dojde k sekundární emisi. Emitované částice jsou přitahovány další dynodou, na které dojde k vícenásobné emisi částic. Kaskádovitým efektem tak vznikne velké množství elektronů, které jsou detekovány. Elektronový násobič - channeltron Channeltron je elektronový násobič s tzv. kontinuální dynodou. Princip je obdobný jako u násobiče s diskrétními dynodami. Využívá se u kvadrupólů a iontových pastí.

13 Mikrokanálová deska -MCP Mikrokanálová deska je pole elektronových násobičů s kontinuální dynodou. Je tvořena mikrokanálky, obě strany desky jsou pokoveny. Tím je docíleno paralelního elektrického spojení násobičů. Na MCP se vkládá napětí V. MCP se využívají u analyzátorů doby letu (TOF). Fotonásobič Fotonásobič je citlivý detektor elektromagnetického záření v UV, VIS a IR oblasti. Ionty se detekují tak, že se se před fotonásobič umístí fosforová destička. Na ní dopadají částice z konverzní dynody a dochází k emisi fotonů. Ty dopadají na fotokatodu, kde fotoelektrickým jevem dojde k emisi elektronů. Ty jsou dále zmnoženy stejně jako v elektronovém násobiči. Fotonásobiče jsou uzavřené, nedochází k jejich kontaminaci, čímž se dosahuje dlouhé životnosti.

14 Vakuová technika Vakuum, tlak a jeho jednotky Vakuové vývěvy Rotační olejová vývěva Spirálová vývěva Rootsova vývěva Turbomolekulární vývěva Difúzní vývěva Měření vakua Čerpání plynné fáze příprava vakua Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua

15 Vakuum Vakuum - stav plynné fáze s tlakem nižším než je tlak atmosférický hrubé vakuum nízké vakuum jemné vakuum vysoké vakuum ultravakuum Pa 100-0,1 Pa 0, Pa < 10-6 Pa l < d l = d l > d l >> d l = střední volná dráha (střední hodnota dráhy, kterou molekula urazí mezi srážkami) d = rozměr vakuové komory 1 Pa 0.01 mbar Torr 10-5 atm Vývěvy - zařízení snižující tlak plynu v uzavřeném objemu Typy vývěv: adsorpční - molekuly plynu jsou zachycovány uvnitř vývěvy transportní - molekuly plynu procházejí vývěvou, jsou odčerpávány z evakuovaného prostoru Parametry vývěv: Mezní tlak nejnižší tlak, kterého je vývěva schopna dosáhnout Čerpací rychlost - objem plynu čerpaný za určitou dobu [m 3 /sec, l/hod] Zpětný tlak - tlak proti kterému může vývěva pracovat tlak na výfuku

16 Vývěvy jemné vakuum (předvakuum): -rotační olejová vývěva - spirálová vývěva - Rootsova vývěva vysoké vakuum / ultravakuum: - difúzní vývěva - turbomolekulární vývěva Rotační olejová vývěva Mezní tlak 10-2 Pa (dvoustupňové provedení) Počet otáček za min: do 1500 Rotační olejová vývěva čerpadlo s rotujícími lamelami - má rotor excentricky umístěný ve válcovitém statoru, lamely jsou v těsném kontaktu se statorem. Plyn je postupně stlačován a odchází pružinovým ventilem. Olej slouží k utěsnění, mazání a k odvodu tepla uvolňovaného při stlačení plynu. Nejčastěji používaný typ čerpadla pro výrobu předvakua ( backing/roughing pump )

17 Spirálová vývěva Mezní tlak 1 Pa Počet otáček za min: 2000 Spirálová vývěva je čerpadlo pro přípravu čistého předvakua s jednoduchou údržbou a bez vibrací - dvě spirály, jedna je nepohyblivá, druhá ji obíhá - mezi spirály se kontinuálně uzavírají kapsy plynu - kapsy se směrem ke středu postupně stlačují - plyn odchází střední částí Rootsova vývěva Mezní tlak 1 Pa Počet otáček za min: 6000 Rootsova vývěva přemisťuje plyn dvěma protiběžnými rotory ve tvaru číslice 8. Pro přípravu předvakua v MS se používají vícestupňové vývěvy. Výhodou je nulové tření mechanických částí (mezi rotory i pláštěm je malá mezera), tj. vývěva poskytuje čisté vakuum a má minimální nároky na údržbu.

18 Turbomolekulární vývěva Mezní tlak: 10-9 Pa Počet otáček za min: Turbomolekulární vývěva je čerpadlo pro přípravu vysokého a čistého vakua. Stator i rotor jsou tvořeny lopatkami, vysoká rychlost otáčení, molekuly plynu jsou postupně strhávány do dalších pater čerpadla. Pumpa má rychlý start, ale omezenou životnost. Difúzní vývěva olej: polyfenylether Santovac tepelná odolnost, velmi nízká tenze Mezní tlak: 10-7 Pa Difúzní vývěva je čerpadlo pro přípravu vysokého vakua. Olej je odpařován, páry proudí tryskou zpět velkou rychlostí. Molekuly plynu difundují do vývěvy a jsou strhávány proudem par směrem k výfuku. Olej kondenzuje na stěnách (chlazení) a vrací se zpět. Vývěva je téměř nezničitelná (neobsahuje pohyblivé součásti), má pomalý start, je chlazena vodou. Riziko kontaminace MS systému olejem z čerpadla.

19 Měření nízkého tlaku - vakuometry Neexistuje univerzální vakuometr pro celé tlakové rozmezí (10 5 Pa Pa) Tepelně-vodivostní vakuometr ( Pirani vakuometr ) je založen na principu odvodu tepla z vodiče ohřívaného konstantním proudem. Dvě cely měřící a referenční, obě se žhaveným vláknem (Pt, W, Mo) jsou zapojeny do Wheatstoneova můstku. Molekuly plynu po nárazu na vlákno v měřící cele odvádí část tepla, a tedy mění odpor vlákna. Změnou elektrického příkonu je udržován konstantní odpor vlákna (elektrický příkon je mírou tlaku). V referenční cele je konstantní tlak. Měřící rozsah: Pa Měření nízkého tlaku - vakuometry Ionizační vakuometry měří elektrický proud mezi elektrodami, který je způsoben ionty vzniklými ionizací zbytkového plynu. Ionizační vakuometr se žhavenou katodou (Bayard-Alpert) Žhavené vlákno (W, Ir/ThO 2 ) emituje elektrony, které ionizují molekuly plynů. Vzniklé ionty jsou detekovány na kolektoru. Měří se proud, který je úměrný hustotě plynu (tlaku). Měřící rozsah: Pa Ionizační vakuometr se studenou katodou (Penning) Na elektrody je vloženo vysoké napětí, dochází mezi nimi k výboji ( studený výboj, elektrody nejsou žhaveny). Magnetické pole prodlužuje dráhu elektronů (pohyb po spirále). Plyn je ionizován, tvoří se ionty. Měří se proud, který je úměrný hustotě plynu (tlaku). Měřící rozsah: Pa

20 Přehled instrumentace Výrobci přístrojů Ceny přístrojů Systémy LC/MS v ČR Přehled významných výrobců Výrobce Q QqQ IT Lin IT TOF QqTOF IT TOF sektor Orbitrap ICR Agilent x x x x x SCIEX x x x x x Bruker x x x x x x Jeol x x x Leco x x Perkin Elmer x x x Shimadzu x x x Thermo x x x x x x Waters x x x x x

21 Orientační ceny MS instrumentace (2012) Instrumentace Agilent 6300 Series 3D iontová past Waters Synapt ion mobility trojitý kvadrupól - TOF Bruker - maxis Q-TOF Thermo - LTQ Orbitrap iontová past-orbitrap LECO - Pegasus 4d GCxGC -TOF Sciex QTRAP 6500 trojitý kvadrupól iontová past

22 Kolik hmotnostních spektrometrů je v ČR? ~ 600 Hmotnostních spektrometrů v ČR Počet instalací do roku 2013: LC/MS: 315 GC/MS: 233 ostatní (MALDI-MS, ICP-MS atd.: spektrometr/ 17 tis. obyvatel 1 spektrometr/ 130 km 2 Podklady: M. Holčapek, zástupci firem LC/MS systémy v ČR Počty přístrojů v roce 2012 (celkem 272). Zdroj: M.Holčapek, Škola MS