Hmotnostní spektrometrie

Transkript

1 Hmotnostní spektrometrie

2 MS - ÚVOD Základní pojmy v hmotnostní sp. Hmotnostní spektrometrie = Mass Spectrometry = MS - analytická metoda, která slouží k převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů - vysoce citlivá, univerzální, selektivní a destruktivní metoda s min. spotřebou vz. - k určení molekulové hmotnosti a jiných strukturních informací - je řazena mezi spektrální techniky, ale podle definice by tam patřit neměla, protože spektrální techniky využívají interakce elektromag. záření a hmoty při nichž dochází k výměně energie (UV/VIS, IR, Raman, NMR aj.) - mezi spektrální techniky je MS řazena pouze pro formální podobnost záznamů (hmotnostních spekter) a pro podobné využití techniky (strukturní analýza) Hmotnostní spektrometr = Mass Spectrometer = MS - iontově-optické zařízení, které separuje a detekuje ionty podle jejich m/z Hmotnostní spektrum = Mass Spectrum = MS - závislost relativních intenzit signálů iontů na jejich m/z

3 MS - ÚVOD Základní části MS spektrometru IONTOVÝ ZDROJ- slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (ionty) procesem, který se nazývá ionizace HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTOR - slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) DETEKTOR IONTŮ - slouží k detekci iontů po jejich separaci dle m/z Další části hmotnostního spektrometru: - zařízení pro zavádění vzorku (přímo nebo z jiného přístroje GC, LC, CZE aj.) - vakuový systém - iontová optika (k urychlení a fokusaci iontů) - počítač (na ovládání přístroje a sběr, ukládání a vyhodnocování naměřených dat)

4 MS - ÚVOD Hmotnostní spektrometr - schema Vše je ovládáno pomocí software řídící jednotkou

5 MS - ÚVOD Hmotnostní spektrometr - schema Základní schéma konstrukce prvních hmotnostních spektrometrů

6 MS - ÚVOD Hmotnostní spektrometry - realita Plynový chromatograf s hmotnostním detektorem (GC-MS) kapalinový chromatograf s hmotnostním detektorem (LC-MS) Hmotnostní detektor (MS)

7 MS - ÚVOD Hmotnostní spektrum

8 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY I. IONIZACE probíhá v iontovém zdroji slouží k převedení neutrálních molekul na nabité částice (ionty) existuje mnoho technik volba ionizační techniky závisí na mnoha faktorech: - těkavost (polarita) pro těkavé látky (za podmínek měření) volit např. EI, CI, FI - tepelná stabilita látky pro termolabilní volit šetrné techniky např. ESI - molekulová hmotnost (souvisí s těkavostí) cca do 1000 g/mol EI, CI cca asi tisíce g/mol APCI nad stovky tisíc g/mol ESI, MALDI - volba polarity záporné ionty pro látky snadno podléhající deprotonaci např. sulfonové a karboxylové kyseliny, polyhydroxylované látky apod. - studium nekovalentních interakcí či prostorového uspořádání biomolekul ESI

9 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY Přehled základních ionizačních technik ionizace za sníženého tlaku - elektronová ionizace (EI) - chemická ionizace (CI) ionizace za atmosférického tlaku (tzv. API techniky) - ionizace elektrosprejem (ESI) - chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI) - fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI) desorpční ionizační techniky - ionizace laserem za účasti matrice(maldi) - desorpční ionizace elektrosprejem (DESI) - přímá analýza v reálném čase (DART) ionizační techniky pro anorganickou analýzu - indukčně vázaná plazma (ICP)

10 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) nejstarší ionizační technika (popsáno již v roce 1913) nejtvrdší (nejméně šetrná) ionizační technika existují rozsáhlé knihovny spekter (desítky stovky tisíc spekter podmínky použití EI ionizace: - probíhá v plynné fázi - dostat. těkavost látky za podmínek ionizace- teplota C - vakuum Pa - dostatečná tepelná stabilita látky za podmínek ionizace nepoužívat zastaralý a nepřesný název ionizace nárazem elektronů (Electron Impact)

11 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) nejstarší ionizační technika (popsáno již v roce 1913) používané ve spojení plynovým chromatografem (GC-MS) Iontový zdroj Separace a detekce iontů

12 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) žhavená katoda (W nebo Re vlákno) emituje elektrony, které jsou po průchodu iontovým zdrojem zachyceny na anodě (lapač elektronů) ionizační (urychlující) potenciál mezi elektrodami určuje energii elektronů a vyjadřuje se v elektronvoltech (1 ev = 1,602 x J) přiblížením emitovaného elektronu k valenčním elektronům molekuly analytu dojde k ovlivnění jejich magnetických polí, což může vést k uvolnění valenčního elektronu za vzniku radikálkationtu M + (obecně ionty s lichým počtem e - ). účinnost EI je cca 0,001 % M + e - M + + 2e - vzniklé ionty jsou z iontového zdroje vypuzeny vytěsňovací elektrodou, proud iontů je následně zaostřen a urychlen dalšími elektrodami do analyzátoru iontů

13 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) FRAGMENTACE - v případě, že molekula získá velký přebytek energie - dojde k rozpadu nabité molekuly na menší nabité a nenabité části - při rozsáhlé fragmentaci chybí molekulární iont nenabitá částice ionizace molekulární iont molekulární iont fragmentový iont

14 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI)

15 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Vliv energie ionizujících elektronů na fragmentaci - čím vyšší energie, tím bohatší EI hmotnostní spektrum - čím vyšší energie, tím méně intenzivní molekulární iont - nižší energie se používají ke relativní zvýšení intenzity molekulárního iontu, čímž ale dochází ke snížení citlivosti - obvykle v rozmezí ev - v případě použití příliš velké energie dochází k rozsáhlé fragmentaci a vzniká tzv. molekulární šrot

16 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU CI CHEMICKÁ IONIZACE (CI) konstrukce iontového zdroje i princip analogické jako u EI v iontovém zdroji je navíc přítomen tzv. reakční plyn o tlaku 100 Pa reakční plyn je přítomen v nadbytku ( x více než vzorku) princip ionizace: - nejdříve jsou ionizujícími e - ionizovány molekuly reakčního plynu, které poté ion-molekulárními interakcemi ionizují molekuly analytu - použití tlak 100 Pa zaručuje uskutečnění dostatečného počtu inter. - probíhá zde řada konkurenčních reakcí běžné reakční plyny jsou methan, isobutan a amoniak CI patří mezi měkké ionizační techniky vznikají převážně ionty [M+H] + nebo [M-H] - a jiné podle v závislosti na použitém reakčním plynu (obecně ionty se sudým počtem e - )

17 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY ZA SNÍŽENÉHOTLAKU EI vs. CI Porovnání tvrdosti technik EI a CI EI Mass spectra of PFBHA-derivatized 6-hydroxy-6-methyl-2-heptanone using acetonitrile as chemical ionization reagent. CI

18 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY API TECHNIKY API techniky (ESI, APCI, APPI) API = atmospheric pressure ionization = ionizace za atm. tlaku jiným názvem sprejové techniky průlom v řešení spojení HPLC s MS detektorem (ESI - nobelova cena) ESI a APCI v současnosti standardem pro spojení s HPLC systémy APPI méně časté použití, zejména na nepolární a velmi labilní látky vznikají převážně ionty [M+H] +, [M+Na] +, [M+NH 4 ] +, [M-H] - a jiné (obecně ionty se sudým počtem e - ) chybějící strukturní informace, které lze získat z fragmentačních iontů vznikajících při EI, lze u těchto (a i dalších) měkkých technik získat tandemovou hmotnostní spektrometrii (MS/MS)

19 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY API TECHNIKY API techniky (ESI, APCI, APPI) Volba techniky se řídí podle fyzikálně-chemickými vlastnostmi analytu a kompatibilitou s použitým eparačním systémem (GC, LC, CZE aj.)

20 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY API TECHNIKY ESI IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) analyt je rozpuštěn ve vhodném eluentu a přiveden kovovou kapilárou s napětím 3 5 kv kapalina je rozprášena pomocí zmlžujícího plynu na kapičky, které nesou množství nábojů odpařováním rozpouštědla dochází ke zvyšování hustoty povrchového náboje kapičky po překročení kritické hodnoty povrchového náboje dojde k tzv. Coulombické explozi, tj. k rozpadu na ještě menší kapičky s rozdělením původních nábojů opakování tohoto procesu vede až ke vzniku kvazimolekulárních iontů vstup do IZ výstup z IZ

21 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY API TECHNIKY APCI CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APCI) princip je podobný jako u klasické CI, ale ionizace probíhá: - za atmosférického tlaku - za průtoku mobilní fáze HPLC (0,1 1 ml/min) vstup do IZ na výbojovou elektrodu je vloženo napětí 3 4 kv vzniká koronární výboj nejprve jsou ionizovány molekuly mobilní fáze (jsou v obrovském přebytku) následnými ion-molekulárními interakcemi reakčního plynu (tj. ionizovaných molekul MF) s molekulami analytu dochází k ionizaci molekul analytu vzniklé ionty jsou vytěsňovány elektrodami do analyzátoru iontů protiproud sušícího plynu (N 2 ) slouží k destrukci případných nekovalentních klastrů

22 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY API TECHNIKY APPI FOTOIONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APPI) princip je podobný jako u APCI, ale lze ji použít pro nepolární, konjugované či labilní slouč. zdrojem UV záření je kryptonová výbojka s energií fotonů 10 ev tato energie je větší než ionizační energie nepolárních organických molekul (analytu), ale mešní než ionizační energie složek mobilní fáze nedochází k ionizaci molekul mobilní fáze (ačkoliv jsou v obrovském přebytku) vznikají ionty s lichým počtem elektronů (na rozdíl od ESI a APCI) pro zvýšení účinnosti ionizace se používá tzv. dopant (benzen, toluen, obecně IE < 10eV), který poté reaguje ion-molekulárními interakcemi s molekulami analytu a nikoliv s MF protiproud sušícího plynu (N 2 ) slouží k destrukci případných nekovalentních klastrů vstup do IZ

23 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY API TECHNIKY porovnání technik ESI API techniky - porovnání - pro středně polární až iontové sloučeniny a biopolymery (mnohonásobně nabité) - nejšetrnější ionizační technika - méně vhodné pro bezvodé mobilní fáze a NP-HPLC - optimální průtok MF je jednotky až desítky µl/min, max. do 1 ml/min APCI - pro málo až středně polární sloučeniny s M r do cca 1500 g/mol - vetší tolerance k obsahu solí v MF - menší tvorba adutkových iontů - optimální průtok MF stovky µl/min, max. do 1 ml/min APPI - pro zcela nepolární, konjugované či labilní sloučeniny - přídavek vhodného dopantu umožní selektivní analýzu - vhodné pro RP-HPLC - optimální průtok MF desítky až stovky µl/min, max. do 1 ml/min

24 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI MALDI = matrix assisted laser desorption ionization = ionizace laserem za účasti matrice MALDI a ESI jsou nejvhodnější ionizační techniky pro analýzu biopolymerů (lze i 1MDa molekuly) výhradně se spojení s TOF analyzátorem vznikají převážně ionty [M+H] +, [M+2H]2 + [M+Na] +, [M+K] +, [M-H] - a jiné (obecně ionty se sudým počtem e - )

25 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI princip - vzorek je rozpuštěn, smísen s vhodnou matricí a nadávkován na pozice terčíku - rozpouštědlo se odpaří - aplikace krátkého (ns) a intenzivního pulsu laserového paprsku (ionizační energie) - laserový puls je absorbován matricí - dochází k přenosu absorbované energie z matrice na analyty ze vzorku, což má za následek ionizaci a desorpci iontů analytu ze vzorku vhodná matrice - musí absorbovat UV nebo IČ laserový paprsek o konkrétní vlnové délce - nejčastěji aromatické karboxylové kyseliny (kyselina dihydroxybenzoová, kyselina chlorsalicylová, skořicová aj.) lasery - UV (dusíkový laser, λ = 337 nm) - IR (OPO laser, λ = 2940 nm) dražší ale citlivější

26 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI Pozice na MALDI terčíku jsou určeny a definovány

27 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI Dávkování manuální (na obrázku) nebo automatické z HPLC

28 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI Odpařování rozpouštědla a krystalizace matrice (zde 2,5-DHBA)

29 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI MALDI-TOF přístroje pro MALDI IMAGING techniku

30 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY MALDI MALDI MALDI-TOF přístroje pro MALDI IMAGING techniku

31 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY DESI DESI DESI = desorption electrospray ionization = desorpční ionizace elektrosprejem princip - kapilárou je přiváděno, zmlžováno a ionizováno pouze rozpouštědlo - vzorek je umístěn před špičkou DESI použití - pro přímou analýzu povrchů pevných vzorků - vzorek lze použít bez jakékoliv úpravy, např. rostlinná nebo živočišná tkáň - pro rychlý monitoring výbušnin, drog, MS imaging

32 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY DESI DESI prst rajče bankovky výbušniny

33 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY DART DART DART= direct analysis in real time = přímá analýza v reálném čase princip - reakční plyn (He nebo N 2 ) jsou excitovány výbojem - vznikají ionty, neutrální částice a metastabilní částice reakčního plynu - ionty, neutrální částice jsou odseparovány - ionizace molekul analytu se účastní jen metastabilní částice reak. plynu použití - analýza všech skupenství (plyn, kapalina, pevná látka) bez úpravy vzorku - technika i použití podobné DESI

34 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY DESORPČNÍ TECHNIKY DART DART list tableta inkoust

35 MS IONIZAČNÍ TECHNIKY TECHNIKY PRO ANORGANICKOU ANALÝZU ICP ICP = inductively coupled plasma = indukčně vázaná plazma ICP princip - vznik, vlastnosti i způsob ionizace stejný jako v ICP-OES (viz. přednášky) - vzniklé ionty nejsou detekovány spektrálně dle λ (ICP-OES), ale dle m/z použití - pro anorganickou elementární analýzu (téměř všechny prvky) - lze i pro izotopickou elementární analýzu Iontový zdroj Separace a detekce iontů

36 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY II. HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY slouží k rozdělení iontů podle jejich m/z míra kvality rozdělení jednotlivých m/z určuje kvalitu detektoru je umístěn mezi iontovým zdrojem a detektorem principy separace iontů podle jejich m/z: - zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém (nebo elektrickém) poli magnetické analyzátory - stabilita oscilace iontů v 2D nebo 3D stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí kvadrupóly (Q) a iontové pasti (ITD, LTD) - různá doba letu iontů v oblasti bez magnetického nebo elektrického pole analyzátory doby letu (TOF) - různá absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli iontová cyklotronová rezonance (ICR)

37 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ROZLIŠOVACÍ SCHOPNOST (RESOLVING POWER, RP) slouží k číselnému vyjádření kvality rozdělení iontů podle jejich m/z FWHM (full width at half maximmum = šířka píku v polovině výšky) - univerzální parametr RP M M Na základě překryvu 2 píků - používá se hlavně u magnetických analyzátorů - poměr hmotnosti iontu M1 a rozdílu hmotností iontů M (tj. M2 M1) za splnění podmínek: ionty M1 a M2 mají jednotkový náboj píky jsou stejně vysoké údolí mezi píky je v 1/10 výšky píků M1 RP M M 2 1

38 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY SPRÁVNOST URČENÍ HMOTY (MASS ACCURACY) slouží k číselnému vyjádření správnosti určení m/z iontu přístrojem relativní rozdíl mezi experimentálně zjištěnou hodnotou m/z (naměřená přístrojem) a teoreticky vypočtenou hmotností iontu (správná hodnota) vztaženou k teoreticky vypočtené hmotnosti iontu MASS ACCURACY ( m / z) EXP ( m / ( m / z) TEOR z) TEOR 10 6 bezrozměrná veličina vyjadřovaná v jednotkách ppm vždy uvádět i znaménko (pozitivní nebo negativní odchylka) vysoká správnost určení hmoty (< 5 ppm) umožňuje určení elementárního složení molekuly

39 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR S JEDNODUCHOU FOKUSACÍ IONTŮ princip - při průchodu magnetickým polem dochází k zakřivení dráhy iontu - čím nižší hodnota m/z, tím větší zakřivení dráhy, protože ionty s nižší m/z vykazují menší odstředivou sílu než ionty s větší m/z Plynulou změnou magnetické indukce (B) nebo urychlovacího potenciálu (V) při konstantním poloměru (r = konst.; dáno přístrojem) projdou výstupní štěrbinou (mezi magnetem a detektorem) postupně všechny ionty. Ionty dopadnou na detektor a zaznamená se jejich intenzita podle jejich m/z.

40 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY MAGNETICKÝ ANALYZÁTOR S DVOJÍ FOKUSACÍ IONTŮ princip - při průchodu magnetickým polem dochází k zakřivení dráhy iontu v závislosti na m/z - při průchodu elektrickým polem dochází k zakřivení dráhy iontu v závislosti na E kin bez ohledu na jeho m/z Ionty vznikající v iontovém zdroji mají určitou distribuci energií, což negativně přispívá k větší šířce píků jejich m/z. Pokud jsou tyto ionty po průchodu elektrickým polem (v elektrostatickém analyzátoru) energeticky sjednoceny, dojde k výraznému zvýšení RP

41 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY KVADRUPÓLOVÝ ANALYZÁTOR (Q) princip - ionty o různé m/z jsou z iontového zdroje přivedeny do středu osy kvadrupólu a začnou oscilovat - oscilace jsou vždy stabilní pouze pro určitou hodnotu m/z a pouze ionty o této hodnotě m/z projdou analyzátorem a dopadnou na detektor - oscilace iontů o jiné hodnotě m/z jsou nestabilní a tyto ionty jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu Plynulou změnou hodnot stejnosměrného napětí (U) a střídavého napětí (V), která jsou vložena na tyče kvadrupólu, jsou postupně kvadrupólem propouštěny ionty podle jejich m/z Poměr U a V je vždy konstantní

42 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY IONTOVÁ PAST (IT) princip - ionty o různé m/z jsou z iontového zdroje krátkým napěťovým pulzem přivedeny do iontové pasti - na kruhovou a 2 koncové elektrody je aplikován vhodný poměr napětí, čímž jsou ionty uvedeny do stabilních oscilací a udržovány v pasti - plynulou změnou těchto napětí dojde k vypuzování iontů podle jejich m/z na detektor K ionizaci může docházet buď - v iontovém zdroji - nebo přímo v iontové pasti Přidává se tlumící plyn (He; 0,005 Pa) - tlumí oscilace iontů - zvyšuje RP a záchyt iontů

43 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF) princip - ionty o různé m/z jsou z iontového zdroje (zpravidla MALDI) krátkým napěťovým pulzem urychleny na vstupu do analyzátorové trubice - měří se čas (ns až µs), za který ionty prolétnou trubicí (0,5 2 m) na detektor - doba letu je závislá na m/z Ionty s menší hodnotou m/z o stejné E KIN se v oblasti bez pole pohybují rychleji, takže se rychleji dostanou k detektoru. Skenování je velice rychlé Hmotnostní rozsah teoreticky není omezen Poměrně nízké rozlišení lze zvýšit: - opožděnou extrakcí iontů - použitím reflektronu (iontového zrcadla)

44 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF)

45 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ANALYZÁTOR DOBY LETU (TOF)

46 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ORBITRAP princip - úzký svazek iontů o různých m/z je přiveden do analyzátoru, který je tvořen centrální elektrodou a vnějšími elektrodami - současně se vstupem iontů do analyzátoru je na centrální elektrodu aplikováno rostoucí napětí, čímž jsou ionty přinuceny k oscilacím v podélném směru (zprava doleva) kolem této elektrody - poté se hodnota napětí na centrální elektrodě stabilizuje na konstantní hodnotě, čímž dojde ke stabilizaci trajektorií iontů - frekvence axiálních (podélných) oscilací každého prstence iontů indukuje proudový obraz na vnějších elektrodách - paralelní záznam všech iontů generuje složitý signál, který je pomocí Fourierovy transformace, převeden na frekvenční závislost a následně konvertován do závislosti na m/z - každé hodnotě m/z náleží určitá hodnota frekvence axiální oscilace Výhody - současná detekce všech iontů - vysoká přesnost určení hmoty (< 1 ppm) a vysoké rozlišení (RP > )

47 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ORBITRAP Charakteristické frekvence frekvence rotace ω ϕ frekvence radiální oscilace ω r frekvence axiální oscilace ω z m/z

48 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY ORBITRAP animace

49 MS HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY IONTOVÁ CYKLOTRONOVÁ REZONANCE S FOURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-ICR) princip - v silném magnetickém poli (cca 7 Tesla)se iont pohybuje po cykloidální trajektorii s cyklotronovou frekvencí - rychlý sken (cca 1 µs) vysokofrekvenčních energií přes velký rozsah frekvencí způsobí excitaci všech iontů přítomných v cele - každé hodnotě m/z náleží určitá hodnota charakteristické cyklotronové frekvence Výhody - současná detekce všech iontů - snadná změna polarity Naprosto mimořádný MS detektor - vysoká cena (cca milion Euro) - nejlepší RP a správnost určení hmoty - nutné nejnižší vakuum (až Pa)

50 MS DETEKTORY IONTŮ III. DETEKTORY IONTŮ slouží k - detekci iontů po jejich předchozí separaci podle m/z v hmot. analyzátoru - k určení relativní intenzity těchto jednotlivých iontů elektronový násobič - nejběžnější - ionty dopadají na povrch elektrody, ze které vyrazí elektrony a tyto elektrony jsou dále zesíleny systémem dynod (zesílení až x) - životnost je 1 až 2 roky fotonásobič - ionty dopadají na povrch konverzní dynody, uvolní se elektrony, které dopadem na fosforovou destičku uvolní foton, který je registrován (zesíl. až x) - životnost je delší než u elektronového násobiče Faradayova klec - ionty dopadají na sběrnou elektr. vybití kondenzátoru je úměrné počtu iontů - velmi přesné, používá se na izotopická měření

51 MS TANDEMOVÁ MS TANDEMOVÁ MS = tandem mass spectrometry; ve zkratce jako MS/MS nebo MS n jedná se o provedení několika (cca 2 5) následných MS analýz výhody - možnost selektivního výběru zkoumaných iontů - možnost fragmentace těchto iontů a analýza jejich fragmentů - významné pro strukturní analýzu sloučenin - výrazně vyšší vypovídací hodnota výsledků při kvantitativní analýze

52 MS TANDEMOVÁ MS TANDEMOVÁ MS = tandem mass spectrometry; ve zkratce jako MS/MS nebo MS n Podle způsobu provedení existují 2 varianty: MS/MS - toto provedení obsahuje 2 (a někdy i více ) hmotnostních analyzátorů, které jsou spojeny kolizní celou - vybraný iont (prekurzor) je vyseparovnán v 1. MS analyzárotu - v kolizní cele je tento iont podroben kolizní aktivaci, čímž dojde k jeho rozpadu a vzniklé fragmentové ionty (produktové ionty) jsou měřeny v 2. MS analyzátoru - v tomto případě jsou měřeny pouze ionty z vybraného prekurzoru v iontové zdroji (in source CID) - ionty přítomné v daný okamžik v iontovém zdroji jsou podrobeny kolizní aktivaci - není možnost výběru iontu prekurzoru! - pokud budou přítomny i další sloučeniny, budou analyzovány také - vznikají tedy fragmentové ionty nejen z požadovaného prekurzoru, ale i z nežádoucích nečistot

53 MS TANDEMOVÁ MS TANDEMOVÁ MS MS/MS

54 MS TANDEMOVÁ MS animace TANDEMOVÁ MS trojitý kvadrupól = triple quadrupol = triplequad = QqQ Iontový zdroj První ion selektivní kvadrupólový filtr Kolizní cela (zde probíhá fragmentace zvoleného iontu) Druhý selektivní kvadrupól pro výběr fragmentů

55 MS TANDEMOVÁ MS animace TANDEMOVÁ MS kvadrupól s analyzátorem doby letu = quadrupol time of flight = Q-TOF

56 MS TANDEMOVÁ MS TANDEMOVÁ MS Existuje velmi mnoho kombinací hmotnostních analyzátorů TOF/TOF FT-ICR QqQqQ QqLIT BqQ QqQ Orbitrap BEBE Iontová past Qq-TOF Triple TOF Q-TOF qtrap mnoho dalších ještě existuje a bude jich přibývat.

57 MS POROVNÁNÍ PŘÍSTROJŮ POROVNÁNÍ HMOTNOSTNÍCH DETEKTORŮ Analyzer Mass range [m/z *10-3 ] Resolution [Δm/z] Resolving power, FWHM [*10-3] Mass accuracy [ppm] MS/MS Scan rate [scans/s] Vacuum [Pa] Price [Euro] Q low QqQ low MS/MS IT low MSn LIT low MSn Orbitrap <5 MSn oa-tof < QqTOF <5 MS/MS Double focusing magnetic <5 MS/MS sector FT-ICR <2 MSn This table summarizes typical values of operating parameters valid in February Reported values may not cover all instrument variants on the market, especially prices are subject to changes, but other parameters may change quickly as well due to the fast development in MS instrumentation. The comparison should serve as a first rough guide for newcomers in the field. Zdroj:

58 MS TYPY SKENŮ V MS TYPY SKENŮ MS základní sken změření celého spektra m/z ve sledovaném rozsahu sken produktových iontů změření MS/MS nebo MS n spektra z vybraného prekurzoru sken iontů prekurzoru pro vybraný fragmentový iont je zjištěn původní iont prekurzoru selektivní záznam jednoho nebo více iontů = selected ion monitoring = SIM - měření intenzity signálu vybraného iontů (nebo více iontů) na čase) selektivní záznam jedné nebo více iontových reakcí = selected reaction monitoring = SRM - v prvním hmotnostním analyzátoru je vybrán iont prekurzoru o určité m/z - tento iont prekurzoru je poté v kolizní cele podroben fragmentaci - ze vzniklých produktových iontů je vybrán jeden charakteristický produktový iont o určité m/z, který je sledován

59 MS HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM záznam odezvy hmotnostního detektoru v praxi ve formě tzv. normalizovaných spekter = nejintenzivnějšímu píku je přiřazena relativní intenzita 100 % a relativní intenzity ostatních píků jsou dopočítány osa x = poměr hmotnosti a náboje iontu [m/z] osa y = relativní intenzita [%] ve spektru je obvykle pozorován pík molekulárního iontu a dále píky fragmentových iontů spektra mají čárový charakter (1 čára = 1 hodnota m/z)

60 MS HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM lze měřit hmotnostní spektra i velkých biomolekul (proteiny, DNA aj.)

61 MS HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT - iont s nejvyšší hodnotou m/z v hmotnostním spektru (nesmí ovšem jít o izotopické píky molekulárního iontu) - jedná se o ionizovanou formu molekuly zkoumané látky - intenzita molekulárního píku má přímý vztah ke struktuře látky - u některých sloučenin je velmi intenzivní, i některých chybí

62 MS HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT u některých sloučenin je velmi výrazný

63 MS HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT u některých sloučenin je méně výrazný

64 MS HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM MOLEKULÁRNÍ IONT u některých sloučenin chybí

65 MS FRAGMENTACE FRAGMENTACE FRAGMENTACE fragmentace iontu prekurzoru na produktové ionty může probíhat spontánně nebo cíleně rozsah fragmentace, počet produktových iontů a jejich relativní intenzity úzce souvisí se strukturou iontu prekurzoru interpretace hmotnostních spekter bere v úvahu např.: - hodnota m/z molekulárního iontu - hodnoty neutrálních ztrát a zakázaných ztrát - přítomnost izotopických prvků pro určení přítomnosti heteroatomů - přítomnost dusíku podle m/z iontu (sudé či liché číslo tzv. dusíkové pravidlo) - poměr izotopických prvků 13 C/ 12 C pro určení počtu uhlíků - hodnotu m/z typický ztrát pro aromatickou a alifatickou sérii - hodnoty m/z typické pro různé funkční skupiny a molekulární struktury fragmentace i pravidla pro interpretaci závisí na způsobu ionizace

66 MS FRAGMENTACE FRAGMENTACE FRAGMENTACE existuje mnoho druhů štěpení vazeb, např.

67 MS FRAGMENTACE FRAGMENTACE Např.: fragmentace dodekanu molekulární iont dodekanu (m/z = 170) fragmentace C-C vazeb je častější než vazeb C-H (množství energie potřebné k narušení C-C vazby je nižší) vzniká tak směs iontů hexylu (m/z = 85), pentylu (m/z = 71), butylu (m/z = 57), propylu (m/z = 43), ethylu (m/z = 29) a methylu (m/z = 15) doprovázená vznikem alkenyl karbokationtů (např. m/z = 55, 41 a 27) po ztrátě dvou vodíků

68 MS FRAGMENTACE Např.: fragmentace propanu FRAGMENTACE Např.: fragmentace cyklopropanu

69 MS PROTEOMIKA PROTEOMIKA Způsoby identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Bottom up Protein je štěpen (enzymaticky nebo chemicky) na peptidy a vzniklá směs peptidů je analyzována pomocí MS Top down Protein analyzován pomocí MS bez předchozího štěpení na peptidy. Iont proteinu jsou fragmentován v plynné fázi

70 MS PROTEOMIKA PROTEOMIKA Identifikace proteinů způsobem bottom up - izolace proteinu (chromatograficky nebo v gelu) - enzymatické štěpení (např. trypsinem) proteinu na peptidy (8 15 aminokyselin) - čištění přes C 18 ve špičce - eluce peptidu cca 50 % acetonitrilem do vialky nebo na MALDI terčík - separace peptidů pomocí HPLC (neprovádí se při použití MALDI terčíku!) - MS analýzou se určí hodnoty m/z jednotlivých peptidů - MS/MS analýza vybraného peptidu způsobí fragmentaci tohoto peptidu - na základě hodnot m/z jednotlivých fragmentů je získáno pořadí aminokyselin v peptidovém řetězci (každá aminokyselina je charakterizována určitou hodnotou m/z) - porovnání s teoretickým spektrem z databází

71 MS PROTEOMIKA PROTEOMIKA Identifikace proteinů způsobem bottom up peptidy protein MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS

72 MS PROTEOMIKA PROTEOMIKA Identifikace proteinů způsobem bottom up Obecný vzorec peptidu: Příklad MS/MS peptidu:

73 Děkuji za pozornost