Imunohistochemické vyšetření karcinomu prsu. Absolventská práce

Transkript

1 Imunohistochemické vyšetření karcinomu prsu Absolventská práce Marcela Mášková Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Pavel Holan Datum odevzdání práce: Datum obhajoby: Praha 2011

2 Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Písek Podpis

3 Děkuji prim. MUDr. Pavlu Holanovi za odborné vedení absolventské práce. Děkuji také Michale Velkové a MUDr. Vratislavu Feitovi za cenné rady při zpracování této práce.

4 Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována ve Středisku vědeckých informací Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

5 ABSTRAKT Marcela Mášková Imunohistochemické vyšetření karcinomu prsu Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: MUDr. Pavel Holan Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2011, 50 stran Absolventská práce se zabývá nádorovým onemocněním prsu, jehož výskyt v poslední době stoupá. Karcinomu prsu je věnováno hodně úsilí v medicíně, také proto, že se jejich počet vysoce zvýšil i u mladších pacientek. Podstatnou částí laboratorního vyšetřování tumorové tkáně je i imunohistochemické vyšetření karcinomu prsu. Prognostické markery karcinomu prsu jsou steroidní hormony, které prokazujeme imunohistochemicky. Jejich pozitivita je indikací k hormonální terapii. Proto jsem si toto téma vybrala pro absolventskou práci, abych pozorovala vývoj statistických dat během posledních tří let na oddělení patologie v Nemocnici Písek a upozornila na laboratorní postupy imunohistochemického vyšetření, na jejich záludnosti i na externí kontrolu imunohistochemické laboratoře. Hlavní část práce je zaměřena na oblast laboratorního zpracování nádorové tkáně, ve druhé části jsem zpracovala statistická data laboratorních vyšetření. Závěry práce ukazují, že počet imunohistochemických vyšetření stoupá, protože jsou důležitým ukazatelem pro chirurgy i onkology. Maligní nádory tvoří často metastázy, proto včasná diagnosa tumoru má rozhodující význam pro léčbu. Klíčová slova: Karcinom prsu. Imunohistochemie. Prognostické markery. Steroidní hormony.

6 ABSTRAKT Marcela Mášková Imunohistochemické vyšetření karcinomu prsu Immunohistochemical Examination of Mamma Carcinoma Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: MUDr. Pavel Holan Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2011, 50 stran The graduation thesis deals with the illness called Breast Tumor, whose distribution has been recently rising. It s been made a lot of effort in this area of the medicine because the amount of the breast carcinoma has been also spread at younger patients. Imunohistochemical examination of the breast carcinoma is the part of the tumor tissue examination. Prognostic markers of the breast carcinoma are steroid hormones, which are proven imunohistochemically. Their positives are indications for the hormone therapy. That s why I ve decided to write my graduate thesis about this topic, also to compare the development of the statistical returns during last free years at the pathology ward in Písek hospital and to advise lab procedures of the imunohistochemical examinations, their complications and the external control of the imunohistochemical laboratory. The main part of my thesis is focused on the area of the tumor tissue elaboration, in the second part I ve worked up statistical returns of the lab examination. The outcomes of my work have proven that the amount of the imunohistochemical examinations is rising because they are important markers for the pathologists and the cancerologists. The tumors often make metastasis, that s why timely treatment of the tumor diagnosis has got the decisive sense. Key words: Breast Carcinoma. Imunohistochemistry. Prognostic Markers. Steroid Hormones.

7 Úvod Mléčná žláza Bradavka a dvorec Žláznaté těleso Prevence Onemocnění karcinomem prsu Historie onemocnění Epidemiologie Rizikové faktory Diagnostika Imunohistochemické vyšetření Co je imunohistochemie Historie Základní pojmy Estrogenový receptor = ER Progesteronový receptor =PR Vyšetření Ki Vyšetření c-erb-2 ( Her2/neu) Úloha patologického oddělení Historie Obecný postup imunohistochemického vyšetření Fixace tkáně Příprava skel Příprava preparátů Příprava roztoků Přístrojová technika... 33

8 5.6 Výsledek metodiky Externí kontrola v imunohistochemické laboratoři Externí kontrola imunohistochemie - detekce Her2/neu Statistická data Posouzení kritérií Diskuze Závěr Seznam tabulek a obrázků...48 Seznam použité literatury a zdrojů informací

9 Úvod Nádorová onemocnění jsou známá jako lidstvo samo. Rakovina je především onemocnění vyššího věku, avšak v posledních desetiletích dochází k velkému nárůstu veškerého nádorového onemocnění. Nádory vznikají nekontrolovatelnou proliferací a rozsevem klonů transformovaných buněk. Na začátku dochází ke kaskádě mutací, postihující úseky DNA, které se podílejí na regulaci růstu a diferenciaci buněk. Poruchy růstové regulace mohou vyústit v nádorové bujení. Rychlost růstu maligních nádorů je určena intenzitou proliferace maligních buněk a jejich schopností pronikat do dalších tkání (metastazovat i do vzdálených míst hostitelského organismu). Příčiny úmrtí a počet onemocnění jsou různá pro muže i pro ženy. Pro ženy je nejčastější výskyt rakoviny prsu. Asi 39% žen ve věku mezi 40-50lety má potencionálně zhoubné mikronádory prsu, ale incidence onemocnění je jen 1%. Nádorové buňky jsou původně buňkami hostitele a jsou tedy často považovány za normální buňky. Kapacita imunitního systému je často nedostatečná a nedokáže tak zabránit agresivnímu růstu nádoru. Proto jsem si vybrala jako téma mé absolventské práce Imunohistochemické vyšetření karcinomu prsu, abych pozorovala vývoj statistických dat z oddělení patologie Nemocnice Písek a upozornila na imunohistochemické postupy vyšetřování nádorové tkáně, na laboratorní úskalí těchto vyšetření i na externí kontrolu imunohistochemické laboratoře. Steroidní receptory jsou doposud nejvýznamnějšími prognostickými markery karcinomu prsu. Prokazují se právě imunohistochemicky. Jejich pozitivita je indikací k hormonální terapii. Vypovídají o větší diferenciaci nádorových buněk a o lepší odpovědi na případnou hormonální léčbu. Imunohistochemické vyšetření estrogenových a progesteronových receptorů má být prováděno na formalín fixovaných a do parafínu zalitých tkáňových vzorcích všech invazivních karcinomů prsu a jejich recidiv. 1 Mléčná žláza Jedná se o typ apokrinní kožní žlázy (viz obrázek 8 Anatomie mléčné žlázy). Mléčná žláza u ženy v průběhu života podléhá změnám například v období těhotenství a laktace. Skládá se z bradavky, dvorce a žláznatého tělesa. Obsahuje 15 až 20 samostatných tuboalveolárních žlázek. Žlázky jsou vystlány jednovrstevným kubickým epitelem. Vývody žlázek jsou vystlány jednovrstevným dlaždicovým epitelem. 9

10 1.1 Bradavka a dvorec Epidermis obsahuje pigmentové buňky. V koriu je hladké svalstvo. Svalové buňky se upínají na elastická vlákna. V rozsahu bradavky se nachází mazové žlázky. 1.2 Žláznaté těleso Žláznaté těleso obsahuje velké, menší a malé vývody. Žláznaté těleso je rozděleno vazivovými septy na 15 až 25 laloků. Každý lalok je tvořen větvenou tuboalveolární žlázou. 1- bradavka- vyústění mlékovodu 2- dvorec 3- lalůček tuku 4- retinaculum cutis 5- subsegmentální duktus 6- segmentální duktus 7- mléčný lalok složený z jednotlivých lalůčků 8- tuk 9- žebro 10- sval 11- acinus 12- intralobulární terminální duktus 13- extralobulární terminální duktus Obrázek 1 Anatomie mléčné žlázy. (Atlas nádorů prsu- Jitka Abrahámová, Ctibor Povýšil, Jaromír Horák a kolektiv) 1.3 Prevence Samovyšetření: Provádí se 1x za měsíc (nejlepší období je den po skončení menstruace). Ženy, které nemenstruují si sami určí den v měsíci, kdy si budou vyšetřovat prsy. Žena se nejprve postaví před zrcadlo, má volně spuštěné ruce a velice pečlivě pozoruje své prsy (změny na kůži, barva, tvar, pozorování z několika stran). Poté žena dá ruce v bok 10

11 a svěsí svá ramena (opět pozoruje změny tvaru, vtahování kůže, důlkovatění). Dále provádíme vyšetřování bříšky prstů levé paže pravý prs a opačně. Prsty se pohybujeme v malých soustředných kruzích celého prsu, poté věnujeme pozornost podpažní jamce. Poté se žena položí na záda, levou paži položí nad hlavu, prohmatává prs a totéž provede na opačné straně. Žena by měla také sledovat nepravidelnosti bradavky nebo sekrece z bradavky. Vyšetření prsů lékařem: Lékař provádí vyšetření prsů v gynekologické a mammologické poradně obdobným způsobem jako u samovyšetřování. Instruktáž o samovyšetřování by měla být součástí při těchto preventivních prohlídkách. Dnes jsou veškeré informace volně dostupné i na internetu a v brožurkách. 2 Onemocnění karcinomem prsu Karcinom prsu je v současné době nejčastější zhoubné onemocnění žen. 1 Je zařazen mezi takzvané civilizační choroby. Ve 20. století byl zaznamenán prudký vývoj znalostí a rozvoj léčebných způsobů a metod (od radikálních operací, přes pozorování hormonální závislosti, poznávání množství radiační a chemické léčby až k nejmodernější multimodální komplexní terapii a tím k prodloužení života, zlepšení jeho kvality a snížení úmrtnosti). Zjistilo se, že vysoké procento onemocnění je diagnostikováno v pozdních klinických stádiích. Důležité je včasné rozpoznání choroby, včasná adekvátní léčba, ke které přispívá i imunohistochemické vyšetření a tím zlepšení konečné prognózy a kvality života. Při onemocnění karcinomem prsu se tedy vedle tradičních prognostických kritérií, jako je velikost nádoru, jeho diferenciace a stav uzlin, přibývají pokusy využít měření exprese onkogenů, supresorových genů a aktivity jednotlivých molekul signálních cest k předpovědi přežití, remisí, rezistence k hormonální terapii, chemoterapii a radioterapii. 2.1 Historie onemocnění Ve stručnosti stačí připomenout slavná jména z historie jako Hippokrates nebo Galén. Posledně jmenovaný je mimochodem svým trefným přirovnáním pokročilého stádia 1 ABRAHÁMOVÁ, J.; POVÝŠIL, C.; HORÁK, J. a kol. Atlas nádorů prsu, str

12 onemocnění ke krabím nohám považován za otce dnes používaného termínu cancer. Teprve až v první polovině 20. století přináší Virchow teorii o původu nádoru z epitelových elementů prsu. V této době začíná být také nemoc chápána jako systémová. Pomineme-li úspěchy neustále se rozvíjející chirurgické léčby a radioterapie, umožňující kromě konvenčních radikálních výkonů i konzervativnější (šetřící) postupy, znamenal pak objev hormonální dependence a receptorů další významný průlom. Se zavedením tamoxifenu do praxe na začátku sedmdesátých let minulého století, dochází k postupnému opouštění některých předešlých ablativních metod. Tyto jsou již v současnosti považovány za obsolentní. Nesmírný posun vpřed rovněž přinesl i pokrok v oblasti farmakochemoterapie, objev nádorových markerů, úspěchy na poli genetického výzkumu či pochopení molekulární podstaty a některých řídících mechanismů biologie karcinomu prsu. Přesto zůstává mnoho nezodpovězených otázek a nejasností čekajících na své rozuzlení v budoucnu. 2.2 Epidemiologie Novotvary prsní žlázy se ve vyspělých zemích řadí mezi vůbec nejčastější maligní onemocnění žen, jejichž celoživotní riziko vzniku činí zhruba 12%. Světový vzestup incidence a mírný pokles mortality v některých státech je možno přisuzovat i mohutně se rozvíjejícímu mamografickému screeningu. Mamografický screening patří mezi screeningové metody od roku 2002, je celoplošný a interval screeningu je 24 (12) měsíců. Ke screeningovým programům jsou vhodné nádory, které splňují kritéria, například, že mají relativně vysokou morbiditu, existuje účinná léčba v časných stádiích a pro detekci jsou k dispozici dostupné a laciné testy. Mamografie je hlavní vyšetřovací metoda a vyšetřují se asymptomatické ženy ve věku let. Prognóza nemoci záleží především na stagingu v době diagnózy, zlepšení intervalu přežití se dá podle nejnovějších statistických údajů očekávat spíše jen od systémové terapie, než od pouhého lokálního zákroku. Tumory prsu sice řadíme mezi onemocnění staršího věku, nicméně po 40. roce života dochází k signifikantnímu vzestupu a křivky incidence nabývají na strmosti. Některé studie vyvracejí domněnky, že by se onemocnění v čase začínalo více posouvat do mladších ročníků, nicméně je uznáváno, že věk pod 35 let je prognosticky nepříznivým faktorem, diagnóza bývá často pozdní při výrazně snížené senzitivitě screeningu. 12

13 2.3 Rizikové faktory Karcinom prsu je onemocněním velice heterogenním, příčiny jeho vzniku se pravděpodobně vzájemně potencují. Obecně tyto vlivy rozdělujeme do dvou základních skupin, na zevní a vnitřní. Zajímavým zjištěním je skutečnost, že přibližně 70% pozitivně diagnostikovaných žen si v anamnéze nenese žádný z rizikových faktorů. a) věk Podle regionu, ve kterém žena pobývá, má od asi 50ti let svého věku 7-10% celoživotní riziko vývoje karcinomu prsu. Nepříznivý je i časný nástup menarche, respektive pozdní menopauza, nuliparita či pozdní primiparita. V těchto případech se jedná o vliv endogenních hormonů jako promotorů kancerogeneze. b) pohlaví Přestože je poměr rizika žena : muž nesrovnatelně menší (asi 130 : 1), zasluhují stejnou pozornost pro jejich vyšší invazivitu z anatomických důvodů. c) rodinná zátěž Familiární výskyt se v našich zeměpisných šířkách udává přibližně 10%, genetická predispozice pak 1-5%, přenos se uskutečňuje autozomálně dominantní cestou s různou penetrancí, spolehlivě však nebývá vždy splněn Mendelovský vzorec. Rodiny s mutací v tumor-supresorických genech BRCA1 a BRCA2 pak mívají celoživotní riziko vzniku karcinomu prsu zvýšeno na 85%. d) regionální rozdíl Životní styl západní civilizace spjatý především s velkou mírou stresu, bohatým kalorickým příjmem zastoupeným převážně tuky a proteiny je odpovědný jak za vyšší incidenci, tak i mortalitu ve srovnání například s Asiaty. Jejich životospráva má naopak spíše protektivní vliv. e) alkohol a cigarety Rozsáhlými studiemi byly zjištěny jen nepodstatné rozdíly mezi abusem alkoholu, respektive kuřáky cigaret a abstinenty. Význam kouření se například s rizikem vzniku plicního 13

14 karcinomu stejně jako například souvislost chronického ethylismu a jaterní cirhózy nedá vůbec srovnávat. f) radiace Častější výskyt karcinomu prsu byl pozorován u žen, jež byly v dětství vystaveny ionizujícímu záření během atomových výbuchů za druhé světové války a dále u pacientek léčených v mladém věku pro benigní nádorové či zánětlivé afekce prsu ozařováním. g) hormonálně aktivní farmaka Hormonální antikontraceptiva neovlivňují pravděpodobně významnější měrou časnou kancerogenezi. Skutečný význam užívání hormonální substituce postmenopauzy jako její nejobávanější riziko je často přeceňován. V prvních pěti letech je vzestup výskytu karcinomu prsu patrně zanedbatelný, strměji roste křivka až po deseti a více letech substituce. 2.4 Diagnostika Známé tvrzení, že lépe nemocem předcházet, než je léčit, může být v případě karcinomu prsu spjato snad jen se snahou o jeho časný záchyt. Jinými slovy jde o sekundární prevenci, zatímco ta primární není v současné době prakticky realizovatelná. I když žijeme ve světě do značné míry ovlivňovaném tlakem nejrůznějších médií, je poněkud zarážející relativně vysoké procento případů prvozáchytu tumorů mammy ve stádiích III a IV. Těžištěm tohoto problému jsou sice převážně starší ročníky, nicméně často se z nepochopitelných důvodů dostaví pacientky k lékaři pozdě spíše z ostychu. Sílu mediálních prostředků by proto chtělo lépe využívat pro širokou veřejnou osvětu, než jen ke komerčním účelům. Problém by se tak jistě stal mezi lidmi mnohem diskutovanějším. a) Samovyšetřování a klinické vyšetření Za elementární a jednoduchý způsob prevence se považuje samovyšetřování vlastních prsů. Poučení či informační leták o způsobu jeho provádění obdrží žena docházející na pravidelné prohlídky nejčastěji u svého gynekologa respektive praktika. Správně však tuto techniku 14

15 nakonec ovládne jen málokterá, navíc jsou některé tumory nehmatné. Spolu s klinickým vyšetřením a mamografií je samovyšetřování stále považováno za základ screeningu. b) Mamografie Mamografie je v současnosti hlavní metodou v diagnostice onemocnění prsu, ať už ve skupině žen symptomatických, doporučených po úvodním klinickém vyšetření, tak u žen asymptomatických v rámci sekundární prevence. Přestože není přístrojové vybavení mamografického centra, zaškolení pracovního personálu a koordinace specializačního týmu pro následnou péči levnou a jednoduchou záležitostí, jeví se tato metoda jako zatím nejlepší možností efektivního screeningu. c) Ultrasonografie Doplňující vyšetření v případě nejasného mamografického snímku, při diferenciálních rozpacích u solidních a cystických lézí u mladších fertilních žen mezi rokem života. d) Cytologická a histologická biopsie Takzvaný core-cut tkáňový odběr bioptickým dělem zaručuje vysoké procento správných výsledků, verifikaci biologické povahy léze před plánovanou operací i eventuelní imunohistochemické vyšetření. e) Duktografie Její největší přínos spočívá v zobrazování intraduktálních afekcí prsu. f) Výpočetní tomografie (CT) Vhodná metoda pro topografickou korelaci maligního tumoru k okolním strukturám, stanovení možnosti, rozsahu či typu chirurgického zákroku. 15

16 g) Nukleární magnetická rezonance (NMR) Přes svoji vysokou senzitivitu při detekci malignit prsu je využití rezonance sráženo drahými provozními náklady a především špatnou dostupností přístroji vybavených pracovišť. 3 Imunohistochemické vyšetření 3.1 Co je imunohistochemie Imunohistochemie využívá základní poznatky imunologie o činnosti imunitního systému, což je rozpoznávání vlastního a cizího. Patří mezi moderní vyšetřovací metody dnešní doby. V diagnostické praxi má nezastupitelnou pozici. Používá se zejména v bioptické diagnostice (nádorová léze). Základním cílem imunohistochemických metod je detekce specifických antigenních determinant (molekul či jejich částí) s využitím imunologické vazby, tj. na principu vazby antigenu a protilátky. Tato metoda využívá monoklonální a polyklonální protilátky, kterými lokalizuje a vizualizuje příslušné tkáňové antigeny. Výsledky vyšetření používá onkolog pro stanovení léčby (viz tabulka 1 Procento léčebných odpovědí ve vztahu k hormonálním receptorům). Imunohistochemicky lze histogeneticky klasifikovat nádory epitelového původu, leukocytární choroby, non-leukocytární neoplazmy, nádory prsu, ovaria a placenty a detekovat hormony. Imunohistochemie dovoluje in situ identifikaci antigenových částí buněk a tkáňových struktur. 2 Možnost morfologicky lokalizovat antigen, který exprimuje patologicky změněná buňka, vložila velkou příležitost do rukou patologů pro další zkvalitnění diagnostického procesu. 2, GOMOLČÁK, P. Základy imunohistochemie v patologii str

17 Tabulka 1 Procento léčebných odpovědí ve vztahu k hormonálním receptorům (Atlas nádorů prsu- Jitka Abrahámová, Ctibor Povýšil, Jaromír Horák a kolektiv) Receptor Léčebná odpověď ER+, PR+ 75 % ER-, PR- 10 % ER+, PR- 34 % ER-, PR+ 50 % 3.2 Historie Tato metoda původně vycházela z histochemie. Základ imunohistochemie se datuje od 30. let 20. století. V roce 1941 byl zaznamenán první průkaz antigenu ve tkáni pomocí fluoresceinu značené protilátkou (primární protilátka) Coonsom a Kaplanom. Další zlom nastal v 50. letech 20. století, kdy se dostávaly tyto techniky do patologické diagnostiky. V 70. letech 20. století byly připraveny protilátky proti jednomu epitopu (antigenní determinantě), takzvaná monoklonální protilátka. Spojení enzymu s protilátkou vyústilo v širší zavedení imunohistochemického vyšetření do praxe. V laboratořích se používají různé druhy imunohistochemických metod. Metoda přímá, kdy primární protilátka je přímo značená, a nepřímá metoda (dvojstupňová), kdy sekundárně značená protilátka se váže na primární protilátku. Dále se používá také třístupňová metoda nepřímá a třístupňová metoda využívající avidin biotin komplex. 3.3 Základní pojmy Antigen je každá látka, která je schopna vyvolat tvorbu specifických protilátek nebo specifickou buněčnou imunitní odpověď nebo se specificky vázat na protilátky. Hapten je nekompletní antigen. Má tu vlastnost, že může reagovat s protilátkou, ale nevyvolá imunitní odpověď. 17

18 Epitopy jsou to determinantní skupiny, součástí kompletního antigenu. Nacházejí se na povrchu antigenu. Po styku s imunokompetentní buňkou nebo protilátkou navzájem reagují. Protilátka je protein, který je schopen jako součást imunitního systému identifikovat a zneškodnit cizí objekty v těle. Protilátky jsou nositeli humorální imunity. Imunoglobuliny jsou glykoproteiny. Během imunitní odpovědi jsou syntetizovány a vylučovány plazmatickými buňkami, takzvanými diferencovanými B-lymfocyty. Molekula imunoglobulinu má tvar Y, a skládá se ze dvou identických lehkých (L, light) řetězců, a dvou těžkých (H, heavy) řetězců, které jsou navzájem spojeny pomocí disulfidových můstků. 3 Polyklonální protilátky Jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů, a proto jsou namířeny proti více epitopům určitého antigenu nebo směsi antigenů. 4 Získávají se imunizací laboratorních zvířat antigenem (nebo jejich směsí). Monoklonální protilátky Jelikož jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, jsou specifické proti jediné antigenní determinantě. 5 Fúzí normálních B lymfocytů pocházejících z imunizovaného živočicha a neoplastických myelomových buněk lze připravit takzvané hybridomy, což jsou klony buněk schopné produkce monoklonálních protilátek (viz obrázek 1 Využití techniky monoklonálních protilátek při sledování biochemických nádorových markerů). 3 GOMOLČÁK, P. Základy imunohistochemie v patologii, str HOŘEJŠÍ, V; BARTŮŇKOVÁ, J. Základy imunologie, str HOŘEJŠÍ, V; BARTŮŇKOVÁ, J. Základy imunologie, str

19 (1) Obrázek 2 Využití techniky monoklonálních protilátek při sledování biochemických nádorových markerů (Atlas nádorů prsu- Jitka Abrahámová, Ctibor Povýšil, Jaromír Horák a kolektiv) (2) Imunitní odpověď Začíná spojením antigenu s protilátkou. Lymfocyty tvoří základ takzvané specifické buněčné imunity. Vznikají v kostní dřeni. Volné lymfocyty plavou v krvi, lymfě a mezibuněčné hmotě. Máme dva typy lymfocytů: T-lymfocyty a B-lymfocyty. T-lymfocyty zajišťují buněčnou imunitu. B-lymfocyty se podílejí na humorální imunitě. Po styku s antigenem se transformují a tvoří protilátky. Vazba antigenu s protilátkou (viz obrázek 2 Schematické znázornění struktury imunoglobulinu). 19

20 3 typy vazeb: 1. vodíkové můstky 2. Van der Waalsovy síly 3. elektrostatické vazby Obrázek 3 Schematické znázornění struktury imunoglobulinu [online]. [cit ]. Dostupný z WWW: Estrogenový receptor = ER Lidský estrogenový receptor je dimetrický protein 65 kd umístěný na membráně buněčných jader (viz obrázek 3 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření ER). Může být produkován v mléčné žláze lokálně (vyšší hladina estrogenového receptoru v karcinomu prsu). Vyšetření estrogenového receptoru je opodstatněné % nádorů prsu obsahuje množství estrogenu. Koncentrace estrogenu stoupá s věkem. Asi 50-60% pacientek s významným obsahem estrogenového receptoru v nádoru odpovídá uspokojivě na hormonální léčbu. 20

21 Obrázek 4 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření ER- 90%, 200x (archiv oddělení patologie - Nemocnice Písek) 3.5 Progesteronový receptor =PR Tento steroidní receptor patří mezi doposud nejvýznamnějšími prognostické markery karcinomu prsu. Jeho pozitivita je indikací k terapii antiestrogeny. Vyšetření progesteronového receptoru má pomoci s výběrem pacientek, které by s největší pravděpodobností profitovali z hormonální terapie, je důležitý pro určení prognózy, menší invazivitu zákroku a lepší prognózu onemocnění (viz obrázek 4 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření PR). Obrázek 5 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření PR- 40%, 200x (archiv oddělení patologie - Nemocnice Písek) 21

22 Estrogenové a progesteronové receptory Steroidní receptory jsou doposud nejvýznamnějšími prognostickými markery karcinomu prsu. Pomocí imunohistochemie se hodnotí procento pozitivity vyšetřované nádorové tkáně. Značí se jádra v hormon-senzitivních buňkách, v nichž hormony působí jako regulační faktory genové exprese a diferenciace buněk, metody se užívá v diferenciální diagnostice nádorů prsu. 3.6 Vyšetření Ki-67 Je antigen exprimovaný výhradně buňkami v aktivní fázi buněčného cyklu (viz obrázek 5 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření Ki-67). Proto je detekce Ki-67 spjata s určením proliferační aktivity (určuje se takzvaný proliferační index) korelující s gradem tumoru i s prognózou onemocnění. Určuje míru růstové frakce řady tumorů. Mezi různé růstové tumory, ve kterých byl stav buněčného dělení vyhodnocen pomocí protilátky Ki-67, patří i karcinom prsu. Obrázek 6 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření Ki-67-10%, 200x (archiv oddělení patologie- Nemocnice Písek) 22

23 3.7 Vyšetření c-erb-2 ( Her2/neu) Stanovení c-erb-2 (Her2/neu) je semikvantitativní test. Slouží k určení nadměrné exprese tohoto proteinu (viz obrázek 6 a 7 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření c-erb- 2 (Her2/neu). Pomocí imunohistochemie se určuje exprese již syntetizovaného proteinu na membráně vyšetřované nádorové tkáně. U většiny karcinomů prsu předchází nadměrné expresi proteinu zmnožení počtu kopií genu pro c-erb-2 (Her2/neu) (amplifikace genu). Overexprese Her2/neu je důležitým prognostickým a prediktivním faktorem invazivního karcinomu mléčné žlázy, je asociována s horší prognózou onemocnění. Provádí se stanovení pomocí in situ hybridizace DNA s fluorescenční detekcí (FISH). K léčbě Herceptinem jsou indikovány pacientky, které jsou imunohistochemicky vyšetřeny jako pozitivní. Hodnotí se membránová pozitivita 0 až 3+ (0 a 1+ je negativní výsledek, 2+ je hraniční výsledek, validován vyšetřením in situ hybridizací, 3+ je pozitivní výsledek validován vyšetřením in situ hybridizací). Tato imunoterapie se provádí pomocí humanizovaných monoklonálních protilátek proti nádorovým antigenům. 6 Monoklonální protilátka trastuzumab (Herceptin TM ) reaguje s antigenem Her2/neu. Poté, co do organismu podáme monoklonální protilátku Herceptinu, rozvíjí se účinná protinádorová obrana a lze očekávat i léčebnou odpověď (zmenšení nádoru). Lék se podává nitrožilně formou krátké infuze. Celková doba podávání léku se pohybuje od několika týdnů do mnoha měsíců. 6 HOŘEJŠÍ, V.; BARTŮŇKOVÁ, J. Základy imunologie, str

24 Obrázek 7 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření c-erb- 2 (Her2/neu)- negativita 1+, 200x (archiv oddělení patologie - Nemocnice Písek) Obrázek 8 Karcinom prsu. Imunohistochemické vyšetření c-erb- 2 (Her2/neu)- Pozitivita 3+, 200x (archiv oddělení patologie - Nemocnice Písek) 4 Úloha patologického oddělení V našem zdravotnickém zařízení byl počátkem roku 2000 poměrně dokonale erudovaný tým specialistů s několikaletými zkušenostmi na diagnostickém mamografu, sonografu a spirálním 24

25 CT. Dalším pozitivním momentem byla komplexnost řešení pozitivně detekovaných pacientek léčených záhy v řádu několika dnů. Neopomenout je třeba i příznivou ekonomickou situaci nemocnice, solidní prostorový komfort a nové přístrojové vybavení špičkové úrovně. Přes počáteční problémy spojené hlavně s protrahovaným vyjednáváním smluvního vztahu se zdravotními pojišťovnami na kód preventivní mamografie bylo nakonec oficiálně otevřeno mammocentrum Nemocnice Písek. To je schopno vyšetřit zhruba 30 klientek za den a vyjít tak vstříc ženám především v severnější části jihočeského kraje, tedy z píseckého, strakonického a táborského regionu. Bolestí programu je prozatím malá informovanost veřejnosti i odesílajících lékařů, a přestože péči plně hradí pojišťovny pro bezpříznakové ženy ve věku let jedenkrát za dva roky, podstupuje screening pouze cca 30% z nich, zatímco zbylých 70% zůstává pochopitelně v riziku pozdního záchytu karcinomu. Oddělení patologie tak spolupracuje s oddělením chirurgie, radiodiagnostiky, onkologie a oddělením molekulární patologie. Úlohami patologického oddělení jsou histologické zpracování zhoubného nádoru, zhodnocení nádorových markerů a zaslání materiálu ke genetickému vyšetření. Analyzované vzorky prsní nádorové tkáně jsou získávány: punkční biopsií peroperační excizí odstraněním části nebo celého prsu Velký význam má zpracování nádorové tkáně takzvanou peroperační biopsií nazývanou také zmrazený řez, kdy se tkáň rychle zmrazí v komoře při -25 C, ihned se zhotoví zmrazený řez (přístroj používaný ke zhotovování zmrazených řezů viz obrázek 9 Kryomikrotom) a obarví se. Patolog informuje operujícího chirurga již během operace o eventuelním nádoru, hranicích, popřípadě metastázách v lymfatických uzlinách a chirurg tak přizpůsobí prováděnou operaci. Konvenční analýza vzorku nádorové tkáně poskytuje informace o velikosti nádoru, histologickém typu nádoru, stupni diferenciace, agresivitě nádoru a postižení lymfatických uzlin i rozsahu postižení. Velice důležitá informace pro kliniky jsou tři kritéria hodnocení histologického vyšetření, které poskytuje klasifikace TNM systému. Označují se velkými písmeny a podávají informace: T o primární lokalizaci tumoru 25

26 N určují postižení lymfatických uzlin M hodnotí přítomnost metastáz Stupně postižení jsou vyjádřeny numericky a v případě patologické klasifikace předchází p. Další používaná klasifikace se označuje jako takzvaná nottinghamská klasifikace. Tato metoda vychází z kvantifikace a skórování tří morfologických parametrů, a to tvorby tubulů, jaderné polymorfie a počtu mitóz. Pro grading se doporučuje používat klasifikace Van Nuyská, kde používaná kriteria jsou: charakter jader a přítomnost nebo chybění nekróz. Tato klasifikace rozlišuje dva nukleární grady : high grade (výrazná jaderná polymorfie) a nonhigh grade (mírná jaderná polymorfie). Obrázek 9 Kryomikrotom (přístroj ke zhotovení rychlých zmrazených řezů, oddělení patologie, Nemocnice Písek). 4.1 Historie Významným milníkem v rozvoji oddělení patologie v Písku bylo oficiální zahájení provozu imunohistochemické laboratoře začátkem roku Do této doby jsme sice rutinně 26

27 diagnostikovali nádorové afekce mammy běžnou světelnou mikroskopií, ovšem stanovení aktivity hormonálních receptorů, proliferačního indexu i c-erbb-2 onkoproteinu bylo prováděno externě, formou konsultačního vyšetření v zařízení vyššího typu. Za vydatné podpory zkušeného personálu našeho sesterského pracoviště v Českých Budějovicích jsme po četných školeních převzali celou jejich metodiku imunohistochemie a stali se tak více soběstačnými. Zpočátku bylo nutno překonat některá drobná úskalí plynoucí hlavně z rané nezkušenosti, jak ze strany laborantek, tak i lékařů, avšak po zhruba 5-6 měsíčním testování a zdokonalování jsme již mohli považovat dosahované výsledky za validní a tudíž i v praxi plně použitelné (viz obrázek 10 Imunohistochemické metody stanovení steroidních receptorů). Obrázek 10 Imunohistochemické metody stanovení steroidních receptorů (Atlas nádorů prsu- Jitka Abrahámová, Ctibor Povýšil, Jaromír Horák a kolektiv) 27

28 5 Obecný postup imunohistochemického vyšetření fixace- fixací dojde k zrušení vazeb (antigen z tkáně není v této chvíli dostatečně schopen vázat protilátku) zpracování běžného parafinového bloku a preparátu fixace parafinového řezu na silanizované sklo odparafinování a rehydratace vaření preparátů- metoda regenerace antigenu, spočívající v povaření řezu v citrátovém pufru k obnovení vazeb, aby se mohly navázat primární protilátky (dle návodu výrobce) - například ve vodní lázni oplachování v promývacím pufru ohraničení tkáně speciální tužkou PAP-PEN (zamezení roztékání a úniku protilátek na ostatní část podložního skla) endogenní blokáda- blokátor pozadí - následně čistý preparát - např. endogenní peroxidáza oplachování v promývacím pufru primární protilátka (inkubace dle návodu výrobce) oplachování v promývacím pufru zviditelnění vazby antigenu s protilátkou musí mít 2 kroky (například): a) Značený polymer- DUAL LINK SYSTEM-HRP b) Chromogen DAB- vazba antigenu s protilátkou- (zlatohnědá až hnědá) oplachování v promývacím pufru mezi kroky a) a b) hematoxylin- dobarvení jader (modrá) dehydratace, montování preparátu 28

29 5.1 Fixace tkáně K vyšetření se odebírá podezřelá tkáň, buď získaná punkcí anebo excizí z prsu. Manipulace s odebraným materiálem musí být šetrná a rychlá, protože imunohistochemie je citlivá metoda. V histologii se nejčastěji jako fixační tekutina používá 10% formol. V imunohistochemii nepatří mezi optimální fixační tekutinu celulárních antigenů. Mezi nejpoužívanější fixační tekutiny v imunohistochemii patří pufrovaný formol, metakarn, Zenkerova tekutina. Pokud se používá 10% formaldehyd, měl by být alespoň pufrovaný, abychom zachovali hodnotu ph. Aldehydy tímto alespoň za určitých podmínek ponechávají zachovanou část enzymatické a imunoglobulinové aktivity Příprava skel Speciální skla pro napínání tkáňových řezů se nazývají Superfrost plus a můžeme je objednávat komerčně. Tato záležitost je ale pro menší laboratoře dražší. Naše laboratoř používá pro práci s imunohistochemickými preparáty silanizovaná skla, které si připravujeme sami. Silanizování skel - význam: lepší přilnutí ukrojeného materiálu, zábrana uplavání při dalším zpracování - chemikálie: 2% silan v acetonu ( 3- aminopropyltriethoxysilane, Sigma) destilovaná voda aceton 7 Základy imunohistochemie v patologii, str

30 - pracovní postup: 1. odmastit stojánek v acetonu (5 min.) a následně usušit 2. odmastit ve stojánku umístěná skla v 96% alkoholu (4 hod.) nebo v acetonu (5 min.) 3. usušit při 56 C 4. ještě teplá skla silanizovat: 2% silan v acetonu 20 sekund aceton sekund destilovaná voda 20 sekund aceton sekund destilovaná voda 20 sekund 5. usušit v termostatu při 37 C do druhého dne! nesahat na skla! 5.3 Příprava preparátů Tkáň se běžně zpracuje a ukrojí na mikrotomu. Oproti histologii se řezy napínají na silanizovaná skla. Na silanizovaných sklech řezy lépe ulpí a nemají tendenci se uvolňovat ze skel (např. vařením ve vodní lázni). Ukrojený materiál natažený na silanizovaná skla dáme sušit do termostatu při 60 C alespoň do druhého dne. 5.4 Příprava roztoků Citrátový pufr ( ph 6-6,2) - ohřev v citrátovém pufru - dle druhu protilátky - dochází k obnovení vazeb, revitalizace antigenů v prostředí roztoku (detekce epitopů ) 30

31 - příprava 500 ml pufru: 0,1 M kyselina citronová....9 ml 0,1 M citrát sodný...41 ml doplnit destilovanou vodou do 500 ml 0,1 M kyselina citronová- dodává ústavní lékárna 0,1 M citrát sodný- dodává ústavní lékárna Promývací pufr ( ph 7,4-7,8) - promývání preparátů mezi jednotlivými výkony - příprava 2 l pufru: 1 M HCl ml NaCl p.a g Trometamol.. 12,1 g doplnit destilovanou vodou do ml 1 M HCl- příprava: destilovaná voda ml koncentrovaná HCl. 50 ml - u pufrů před použitím zkontrolovat ph pomocí ph metru ph 9 pufr - používá se při obnovení vazeb, revitalizace antigenů v prostředí roztoku (detekce epitopů) tam, kde zpracování v citrátovém pufru zcela nevyhovuje - ohřev v pufru ph 9 dle druhu protilátky - příprava 2 l pufru: 1,2g TRIS 0,37g CHELATON III Doplnit destilovanou vodou do ml 31

32 Blokátor endogenní peroxidázy - slouží k zablokování vazeb nepotřebných k navázání protilátek (čisté pozadí) - příprava: destilovaná voda ml koncentrovaný peroxid vodíku.. 5 ml azid sodíku mg Primární protilátky (viz obrázek 11 Používané protilátky a detekční systém) - dodávány již naředěné ( ready to use) - ředění pouze protilátky Her2/neu- (dle doporučení v příbalovém letáku pufrem Background Reducing Componets) - uchovávat v ledničce při doporučené teplotě - monoklonální protilátky poskytují více specifické reakce než polyklonální protilátky Detekční systém Dako (viz obrázek 11 Používané protilátky a detekční systém) Značený polymer - DUAL LINK SYSTEM-HRP - komerčně vyráběn k přímému použití DAB + SUBSTRATE BUFFER (chromogen) - před použitím naředit dle návodu výrobce a promíchat -uchovávat v ledničce při doporučené teplotě 32

33 Obrázek 11 Používané protilátky a detekční systém (oddělení patologie, Nemocnice Písek) 5.5 Přístrojová technika V imunohistochemické laboratoři jsou nejvíce nezbytné přístroje jako ph metr, vodní lázeň a lednice. ph metr je přístroj, který měří elektrický potenciál měrné elektrody (viz obrázek 12 ph metr). Ten závisí na koncentraci stanovované látky. Vznikající napětí je mírou koncentrace sledované látky. Přímá potenciometrie se využívá k měření koncentrace H+ iontů. Kalibrace elektrody je prováděna dle doporučení výrobce v laboratoři pravidelně, kalibrace a kontrola celého přístroje je prováděna dle časového harmonogramu odbornou firmou. 33

34 Obrázek 12 ph metr (oddělení patologie, Nemocnice Písek) Vodní lázeň je mikroprocesorem řízená lázeň s LCD displejem, časovým spínačem a regulací teploty (viz obrázek 13 Vodní lázeň). Lázeň je vybavena automatickou tepelnou ochranou, při překročení nastavené teploty je aktivován alarm. Pravidelné kalibrace provádí odborná firma dle stanoveného harmonogramu. 34

35 Obrázek 13 Vodní lázeň (oddělení patologie, Nemocnice Písek) Pro demaskování epitopů lze použít i přístroj RHS-1. Je to multifunkční přístroj, který se hlavně používá na zpracování imunohistochemických preparátů. Zde působením mikrovln a teploty dochází k revitalizaci (demaskování) antigenů. Tento přístroj má vypracovaný program, který se pouze spustí. Přístroj urychluje difúzi, podporuje vznik chemické reakce při barvení a stabilizuje proteiny. Další způsob demaskování epitopů je použití mikrovlnné trouby. V naší laboratoři se ale příliš tento způsob neosvědčil, proto jsme od něj upustili. Na revitalizaci antigenu je možno použít i inkubace řezů v tlakovém hrnci, ale tento způsob jsme v imunohistochemické laboratoři nikdy netestovali. Laboratorní lednice se používá k uskladnění pufrů, setů a protilátek pro imunohistochemii. V rámci bezpečnosti a zachování kvality práce v imunohistochemické laboratoři je opatřena kalibrovaným teploměrem, který kontroluje optimální rozmezí pro skladování chemie. 35

36 5.6 Výsledek metodiky Výsledek barvení preparátů: jádra buněk- modrá pozitivita hormonálních receptorů zlatohnědá až hnědá (membranosní, cytoplasmatická nebo nukleární pozitivita) 6 Externí kontrola v imunohistochemické laboratoři Každá laboratoř musí používat vypracované postupy pro externí a interní kontrolu. Interní kontrola slouží pro kontrolu každé série analýz. Cílem je potvrzení dlouhodobé stability výsledků vyšetření, které je důležité pro monitorování onkologických pacientů. Externí kontrola umožňuje mezilaboratorní srovnávání výsledků a odhaluje případné metodické chyby. Pro histologické laboratoře dosud neexistuje odbornou společností jasně dané kriterium provádění externí kontroly kvality, záleží proto na vlastní diagnostické rozvaze každého patologa. Je tu však možná dohoda pracovišť, které si zasílají navzájem kontrolní materiály, hodnotí je a výsledky pak posuzují a dále je zpracovávají. V imunohistochemické laboratoři je možno posuzovat výsledky s referenčními laboratořemi, s kterými laboratoř spolupracuje. Imunohistochemická laboratoř v Nemocnici Písku je rovněž zapojena do systému externí kontroly kvality práce, garantované společností SEKK s.r.o. a Státním zdravotním ústavem - střediskem pro posuzování kvality laboratoří a pracovišť. Tato zařízení udělují osvědčení kontroly kvality výsledků prováděných vyšetření (takzvané certifikáty). Toto všechno jsou ukazatele, kterými laboratoř zaručuje důvěryhodnost, efektivní řízení a kvalitu dané laboratoře ve zdravotnictví. Státní ústav pro kontrolu léčiv v rámci své činnosti spolupracuje s externími spolupracovníky, kteří jsou členy pracovních týmů nebo zpracovávají odborné posudky, expertizy, poskytují stanoviska, konzultace a zprávy pro odborné útvary ústavu. Do nabídky je od roku 2010 zařazen nový kontrolní cyklus detekce Her2/neu. Kontrolní cyklus se z pohledu zúčastněného pracoviště skládá z těchto kroků: rozeslání kontrolních materiálů, zpracování kontrolních materiálů v laboratoři, odeslání výsledků a vyhodnocení výsledků účastníků. Souhrnné výsledky jsou zveřejněny na 36

37 internetu. Cílové hodnoty pro imunohistochemickou laboratoř jsou určovány konsenzuálně, tedy jako průměry eliminací odlehlých hodnot. Kontrolní materiály pro imunohistochemické kontrolní cykly připravují subdodavatelé. 6.1 Externí kontrola imunohistochemie - detekce Her2/neu Imunohistochemické vyšetření Her2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) Kontrolním materiálem jsou dvě identická neobarvená histologická skla, zhotovená z identického složeného tkáňového bloku. Dvě identická skla se zasílají proto, že nelze eliminovat výpadky tkání během imunohistochemického barvení. Dvě skla tak zvyšují pravděpodobnost, že budou účastníci schopni hodnotit všechny vzorky na sklíčku. Hodnocení práce účastníků se skládá ze dvou částí: Hodnocení správnosti výsledků u jednotlivých vzorků v rámci složeného tkáňového bloku, kdy se výsledek účastníka porovnává se správnou hodnotou stanovenou na pracovišti, které zaslalo zdrojový blok pro odběr vzorků do složeného tkáňového bloku. Všechny tyto zdrojové bloky jsou ještě testovány imunohistochemicky certifikovaným kitem HercepTest a následně pomocí metody FISH. Ve druhé fázi provádí hodnocení tým složený ze třech expertů (hodnotitelů). Hodnotí se kvalita barvení testovacích preparátů a vlastních kontrol jednotlivých laboratoří ve škále 0 až 5 bodů pro každý jednotlivý vzorek. Ve výsledkovém listu účastníci kontrolního cyklu naleznou výsledky vlastní interpretace porovnané s očekávanými výsledky, bodové hodnocení barvení, které provedl tým hodnotitelů a bodové hodnocení vlastního kontrolního preparátu. Ve výsledkovém listu jsou vždy uvedeny a hodnoceny výsledky konkrétního účastníka, jemuž výsledkový list náleží, a dále je zde uveden anonymní přehled výsledků všech účastníků. 7 Statistická data Pro moji práci jsem si vybrala statistická data za poslední roky 2008, 2009 a 2010 na oddělení patologie v Nemocnici Písek. Vyhledala jsem všechna imunohistochemická vyšetření nádorů prsu od roku 2008 až do 2010, kde jsem porovnávala: 37

38 Umístění tumorů dle kvadrantů prsu Lokalizaci tumorů prsu v levém nebo v pravém prsu Věk pacientek při zjištění onemocnění tumorem prsu Typing nádorů prsu Nejčastější pozitivita vyšetřovaných markerů Počet imunohistochemických vyšetření na oddělení 7.1 Posouzení kritérií Při posuzování těchto vybraných kriterií jsem následně zjistila, že počet všech imunohistochemických vyšetření každým rokem vzrůstá (viz obrázek 14 Počet imunohistochemických vyšetření ). Imunohistochemické vyšetření se především začíná používat i k vyšetření dalších tumorů a k určení bližší diagnosy či upřesnění diagnos. Imunohistochemie dovoluje in situ identifikaci antigenových částí buněk a tkáňových struktur. Tímto velice usnadňuje práci lékařům na oddělení patologie a zároveň i chirurgům a onkologům. Počet imunohistochemických vyšetření karcinomu prsu na oddělení patologie v Písku zůstalo během těchto tří let na stejné úrovni. 38

39 Počet imunohistochemických vyšetření celkový počet vyšetření počet vyšetření receptrorů prsu Obrázek 14 Počet imunohistochemických vyšetření (Sloupcový diagram) Dále mne zajímalo, zda je častěji nádorem postižen levý či pravý prs (viz obrázek 15 Lokalizace nádorů prsu). Moje zkušenost při práci v imunohistochemické laboratoři, že je častěji postižen prs levý, se potvrdila. Žádné bližší vysvětlení jsem ale v literatuře nenalezla. Tento ukazatel však není směrodatný, jak je patrno z grafu, rozdíly se v některých sledovaných letech stírají. Domnívám se, že je to zapříčiněno i tím, že vybraný soubor dat tvoří menší počet pacientek. 39

40 Lokalizace nádorů prsu Pravý prs Levý prs Obrázek 15 Lokalizace nádorů prsu (Sloupcový diagram) Co se týká lokalizace tumorů prsu v oblasti kvadrantů, je nejčastěji postižen horní zevní kvadrant, poté následuje dolní zevní kvadrant (viz obrázky 16, 17 a 18 Lokalizace tumorů prsu 2008, 2009 a 2010). Domnívám se, že je to zapříčiněno průběhem mléčné lišty. Bohužel, klinici mnohdy neuvádí všechny údaje o pacientovi, proto se mi nepodařilo zjistit u některých vyšetření přesnou lokalizaci, i když jsem se snažila tuto skutečnost dohledat v bioptickém archivu. Z grafů je patrno, že se i tato skutečnost zlepšuje a klinici přesněji popisují nádorové lokality. 40

41 Lokalizace tumorů prsu % 6% 7% 9% 32% 6% Horní zevní kvadrant Horní vnitřní kvadrant Dolní zevní kvadrant Dolní vnitřní kvadrant Centrální část Bez lokalizace Obrázek 16 Lokalizace tumorů prsu 2008 (Kruhový diagram) Lokalizace tumorů prsu % 28% 11% 42% Horní zevní kvadrant Horní vnitřní kvadrant Dolní zevní kvadrant Dolní vnitřní kvadrant Centrální část Bez lokalizace 11% 7% Obrázek 17 Lokalizace tumorů prsu 2009 (Kruhový diagram) 41

42 Lokalizace tumorů prsu % 10% 19% 11% 12% 41% Horní zevní kvadrant Horní vnitřní kvadrant Dolní zevní kvadrant Dolní vnitřní kvadrant Centrální část Bez lokalizace Obrázek 18 Lokalizace tumorů prsu 2010 (Kruhový diagram) Nejčastější věk pacientek při zjištění onemocnění se v prvním roce statistiky velice vyhoupl u mladších kategorií (30-50 let), další dva roky byly nejvíce postiženy ženy starší (viz obrázek 19 Věk pacientek při zjištění onemocnění). Domnívám se, že tato skutečnost byla zapříčiněna otevřením nového mammocentra, kdy většina gynekologů doporučovala mladší pacientky k vyšetření, či většina samotných žen v produktivním věku chtěla být raději vyšetřena a při této příležitosti se podařilo zachytit větší množství nádorů. Nicméně je patrné, že počet těchto mladších pacientek i nadále stoupá. Onemocnění ostatních pacientek bylo zachyceno při screeningových vyšetřeních nebo náhodných nálezech. 42

43 35 Věk pacientek při zjištění onemocnění více Obrázek 19 Věk pacientek při zjištění onemocnění (Sloupcový diagram) Největší zastoupení dle druhů nádoru prsu je u duktálního a lobulárního karcinomu (viz obrázky 20, 21 a 22 Typing nádorů prsu 2008, 2009 a 2010). Pouze výjimečně se vyskytoval Pagetův karcinom. Při posuzování těchto kriterií jsem již nekalkulovala s novým doplňkovým vyšetřením receptorem E Cadherinem, který se začal používat na oddělení patologie v Písku od poloviny roku Tento receptor pomáhá identifikovat rozlišení mezi duktálním a lobulárním karcinomem prsu. Paleta imunohistochemických vyšetření karcinomu prsu se tedy rozrostla ještě o další komponentu. 43

44 Typing nádorů prsu % 17% 64% Duktální karcinom Lobulární karcinom Ostatní nádory Obrázek 20 Typing nádorů prsu 2008 (Kruhový diagram) Typing nádorů prsu % 1% 17% 19% 62% Duktální karcinom Lobulární karcinom Pagetův karcinom Ostatní nádory Papilokarcinom Obrázek 21 Typing nádorů prsu 2009 (Kruhový diagram) 44

45 Typing nádorů prsu % 1% 10% Duktální karcinom 17% Lobulární karcinom Papilokarcinom Pagetův karcinom 71% Ostatní nádory Obrázek 22 Typing nádorů prsu 2010 (Kruhový diagram) Pozitivita vyšetřovaných markerů je nejvíce zastoupena u estrogenových a progesteronových receptorů, přičemž estrogenové receptory jednoznačně ve statistickém průzkumu vedou (viz obrázek 23 Pozitivita vyšetřených markerů). Proliferační marker Ki-67 jsem do statistického hodnocení nezahrnula, protože každý nádor má svou proliferační aktivitu. U každé pacientky hodnotící patolog přihlíží objektivně k celé paletě imunohistochemických vyšetření karcinomu prsu. 45

46 40 Pozitivita vyšetřených markerů ER PR HER Obrázek 23 Pozitivita vyšetřených markerů (Sloupcový diagram) 8 Diskuze Není pochyb, že imunohistochemická vyšetření nádorových markerů prsu jsou nesmírně důležitá pro pacientku, chirurga i onkologa. Vyšetření tohoto typu jsou pro oddělení patologie v nemocnicích okresního typu velice finančně náročná. Oddělení patologie v Písku se zúčastňuje externí kontroly kvality, která se týká vyšetření Her2/neu. Zatím sice konstantně nedosahuje optimálních výsledků, nicméně nemůže z ekonomických důvodů používat standardizované protilátky jako referenční laboratoře. Do budoucna tak není vyloučeno, že semikvantitativní vyšetření Her2/neu bude s ohledem na přesnost a eventuelní verifikaci molekulárně genetickými metodami prováděno výhradně v referenčních laboratořích. Při posuzování kritérií, které jsem statisticky zpracovala, vyplývá, že na každém patologickém oddělení jsou vyšetřovány určité okruhy pacientek s nádory prsů a nemohou se tedy zcela porovnávat celkové statistické údaje a údaje zjištěné v jednotlivých laboratořích. 46

47 9 Závěr Imunohistochemie je moderní metodou, která má své nezastupitelné místo v medicíně. Dalo by se říci, že je v dnešní době nedílnou součástí lékařské diagnostiky. Největší přínos je pro onkology, kterým napomáhá imunohistochemie s výběrem léčby. Obecně vzato je hormonální léčba spojena s menšími vedlejšími účinky, než chemoterapie, takže snahou je co nejdéle kontrolovat rozvoj choroby hormonálními prostředky, teprve pak nasadit chemoterapii. Dnes je na trhu velká škála primárních protilátek a dále se objevují na trhu nové firmy zabývající se imunohistochemickým vyšetřením. I do imunohistochemických laboratoří v dnešní době dorazila automatizace v podobě nových přístrojů, které nám laborantům usnadňují práci. Závěrem bych chtěla upozornit, že imunohistochemie je velice citlivá metoda. Jak jsem zjistila při své několikaleté práci v imunohistochemické laboratoři, je velice důležitá preanalytická příprava tkáně (např. správná doba fixace, vhodný výběr fixační tekutiny). Důraz se klade především na to, aby nebyl materiál přefixován nebo naopak nedošlo k autolýze (negativní vliv na imunohistochemická vyšetření). S každou vyšetřovanou tkání bychom měli zacházet šetrně a brát v úvahu případná imunohistochemická vyšetření. Zpracovávané imunohistochemické preparáty nesmí během zpracovávání vyschnout! Nesmíme opomenout důležitost správného odparafinování řezů před zpracováním, aby v řezech nezůstala rezidua parafínu, které by mohla výsledky zkreslit. Dodržování časů inkubace dané výrobcem, dobře připravený chromogen, výběr bločku s nekrotickou tkání to všechno ovlivňuje výsledek reakce! Podstatná je i správná hodnota ph pufrů v průběhu laboratorního vyšetření. Před každým imunohistochemickým vyšetřením by měla být tato hodnota zkontrolována pomocí ph metru. Největší problém vidím v optimálním naředění HER2/neu protilátky laborantem a adekvátní zhodnocení výsledku lékařem. Tato práce vyžaduje pečlivost a dodržování správných postupů dle návodu dodavatele setů. Nezastupitelný význam mají i pozitivní a negativní kontroly při laboratorním zpracování. Ze statistických údajů získaných na oddělení patologie v Písku jsem zjistila, že nejvíce postižené jsou ženy od 60 let věku a nejčastěji postižené tumorem jsou horní zevní kvadranty levých prsů. Nejčastěji zastoupená je estrogenová pozitivita nádorových markerů a nejvíce se vyskytuje duktální karcinom prsu. Statistické údaje potvrdily, že množství imunohistochemických vyšetření nadále stoupá a hraje nezastupitelnou roli pro další léčbu pacientek s touto diagnosou. 47